一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法

2023-08-11 05:10:06

專利名稱：一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法
技術領域：
本發明屬於腫瘤抗原的篩選技術領域，涉及一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法。
背景技術：
惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一，因此，世界衛生組織和各國政府衛生部門都把攻克癌症列為一項首要任務。在第18屆國際抗癌症聯盟大會上，世界衛生組織發表的一項研究報告表明，全球癌症狀況將日益嚴重，今後20年新患者人數將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因癌症而死亡的人數也將由每年600萬增至1000萬。為應對上述嚴峻形勢，報告呼籲各國制訂反癌症的全國計劃和具體實施方案，並特別強調對癌症預防、早期檢查和早期治療的重要意義。儘管兩個世紀以前就有人提出用腫瘤疫苗來治療人類腫瘤的想法，但因長期以來無法在腫瘤細胞上找到腫瘤特異性抗原而進展緩慢。從20世紀80年代開始，各種不同腫瘤抗原的鑑定方法相繼建立，發現和鑑定了一系列腫瘤抗原，從而為腫瘤主動免疫治療和靶向治療的發展奠定了基礎。然而，腫瘤細胞的多種免疫逃逸機制，使得針對所發現的大部分腫瘤抗原作為靶點的免疫治療效果不盡如人意。作為免疫治療理想的腫瘤抗原應具備在腫瘤細胞特異、穩定表達，正常組織不表達，並且對維持腫瘤細胞的存活至關重要。近年來，隨著腫瘤免疫學的快速發展，只局限性表達於腫瘤及睪丸組織中的腫瘤/睪丸抗原的發現，無疑為腫瘤的免疫治療帶來了新的希望。由於腫瘤/睪丸抗原具有誘導機體產生特異性細胞免疫應答或特異性體液免疫應答的特點，使得腫瘤/睪丸抗原較其它類型的腫瘤抗原在腫瘤免疫治療中更具應用前景，已成為當今腫瘤研究的熱點之一。雖然目前已有許多腫瘤/睪丸抗原被陸續鑑定出來，但可以實際應用於腫瘤疫苗構建及治療靶點的腫瘤/睪丸抗原仍十分有限。為了大規模快速發現更具應用價值的新腫瘤/睪丸抗原，由美國腫瘤研究院和路德維格癌症研究所牽頭，聯合8個國家的30個研究機構，成立了 「發現人類腫瘤抗原合作項目，，的國際合作聯盟，足見篩選和鑑定新腫瘤/睪丸抗原的重要性和迫切性。目前，以T細胞表位克隆技術(T cell epitope cloning)、多肽洗脫法(ρ印tide elute method)、表位預測法(印itope prediction method)、cDNA表達文庫血清學篩選分析技術(serological analysis of cDNA expression libraries, SEREX)等為主的免疫學方法，和以差異顯示(different display, DD)、代表性差異分析(!^presentational difference analysis, RDA) > cDNA Sjn^IlT (cDNA microarray analysis) ^ 性分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、表達序列標籤測序及大規模平行信號測序(massively parallel signature sequencing，MPSS)等為主的基因表達分析法， 在篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原方面發揮了巨大的作用。CN 102507937 A
說明書
2/6頁 然而，無論是免疫學方法還是基因表達分析法均有一定的局限性。前者依賴於腫瘤患者體內針對腫瘤/睪丸抗原的特異性免疫應答，但多數情況下，腫瘤患者處於免疫抑制狀態，所以利用這種方法篩選、鑑定並獲得腫瘤/睪丸抗原的機率可能是較低的。鑑於部分蛋白的核酸表達水平與蛋白表達水平有差異，即核酸雖有表達，但並不表示蛋白就一定會表達。因此，腫瘤/睪丸抗原基因表達分析法並不能有效地鑑定差異表達的蛋白，例如備受研究者關注的MPSS法也僅僅鑑定了 CT45 —個腫瘤/睪丸抗原。顯然，目前的腫瘤/睪丸抗原的鑑定方法無法滿足腫瘤免疫學的研究。因此，建立新的、強有力的特異性腫瘤/睪丸抗原篩選工具，不僅將為人們更加全面、系統地發現新的腫瘤抗原，豐富人們對腫瘤分子機制的認識，同時也將促進腫瘤免疫診斷、治療的發展。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，在人生精細胞作為免疫原篩選的特異性單克隆抗體的基礎上，來篩選和鑑定未知腫瘤/睪丸抗原的新方法。本發明是通過以下技術方案來實現一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，包括以下步驟1)以人生精細胞作為免疫原，應用淋巴細胞雜交瘤技術製備單克隆抗體，免疫組化法篩選識別人生精細胞的特異性單克隆抗體；2)採用免疫組化染色方法，在蛋白水平上從識別人生精細胞的特異性單克隆抗體當中，篩選出只與人腫瘤組織反應，且與人正常組織不反應的特異性單克隆抗體作為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體；3)利用候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體與人陽性腫瘤細胞的裂解物進行抗原抗體反應，收集形成的免疫沉澱，再將候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體所捕獲的腫瘤/睪丸抗原進行蛋白組學分析和鑑定。所述的在蛋白水平上的篩選為採用免疫組化染色方法，篩選出只與人腫瘤組織石蠟切片反應，且與人正常組織石蠟切片不反應的特異性單克隆抗體作為候選識別腫瘤/ 睪丸抗原的抗體。所述的免疫沉澱所獲得的腫瘤/睪丸抗原的收集為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體先與kpharose 4B交聯，再與人陽性腫瘤細胞的裂解物進行抗原抗體反應，形成沉澱之後，沉澱中加入洗脫液，混合後離心，收集上清液，用超濾濃縮管濃縮或用冷丙酮沉澱，然後進行SDS-PAGE，收集所捕獲的腫瘤/睪丸抗原所對應的條帶；所述的洗脫液為0. lmol/L的甘氨酸-鹽酸，pH2. 7。所述的對免疫沉澱所獲得的腫瘤/睪丸抗原進行蛋白組學分析為將所捕獲的腫瘤/睪丸抗原用蛋白酶降解成多肽，收集酶解後的多肽，對其進行質譜分析以確定蛋白序列。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的腫瘤/睪丸抗原的篩選和鑑定方法，是基於生殖細胞的發育過程與
4腫瘤細胞的發生有許多相似性，以及腫瘤/睪丸抗原基因在體細胞中重新表達的過程可能是腫瘤發生的驅動力，逆向設計的篩選和鑑定未知腫瘤/睪丸抗原的方法。一般情況下，都是先有已知抗原，通過免疫再製備相應單克隆抗體。而本發明在沒有腫瘤抗原或不知道腫瘤抗原、按常理無法製備其單克隆抗體的情況下，基於腫瘤/睪丸抗原限制性表達於睪丸組織的特點，利用淋巴細胞雜交瘤技術製備單克隆抗體，採用免疫組化染色選擇只與腫瘤組織反應、而與正常組織不反應的生精細胞特異性單克隆抗體作為候選識別抗體，進而篩選和鑑定新的腫瘤/睪丸抗原分子。這樣既克服了現有免疫學方法依賴於腫瘤患者體內針對腫瘤/睪丸抗原的特異性免疫應答、獲得腫瘤/睪丸抗原的機率較低的缺陷；又克服了基因表達分析法核酸表達水平與蛋白表達水平有差異的缺陷。篩選出不同的抗克隆抗體就能夠識別不同的腫瘤/睪丸抗原。本發明提供的腫瘤/睪丸抗原的篩選和鑑定方法，巧妙了解決了腫瘤抗原單克隆抗體難以篩選的問題，再結合其他蛋白組學分析技術，是一種好的高效的腫瘤/睪丸抗原篩選方法，有望發現新的腫瘤治療靶點；所篩選的相應單克隆抗體也有可能成為潛在的腫瘤治療性抗體。


圖1為FM-I抗體在人睪丸組織及多種腫瘤組織切片中的免疫組化染色；其中A、 睪丸；B、宮頸癌；C、卵巢癌；D、直腸癌；E、結腸癌；F、肝癌；G、肺癌；H、乳腺癌；I、食管癌；圖2為FM-I抗體在人睪丸組織及多種正常組織切片中的免疫組化染色；其中A、 睪丸；J、宮頸；K、卵巢；L、直腸；M、結腸；N、肝；0、肺；P、乳腺；Q、食管。圖3為FM-I單克隆抗體與識別的抗原的免疫沉澱的電泳結果圖；圖4為免疫沉澱電泳目標條帶的酶解多肽的質譜分析結果。
具體實施例方式本發明提供的腫瘤/睪丸抗原的篩選和鑑定方法，以人生精細胞作為免疫原，應用淋巴細胞雜交瘤技術製備單克隆抗體，免疫組化法篩選人生精細胞特異性單克隆抗體; 然後在蛋白水平上研究所篩選的單克隆抗體識別的抗原分子在腫瘤組織和其他正常組織的表達分布。以此為基礎，採用免疫組化染色選擇針對腫瘤/睪丸抗原表達規律的單克隆抗體(即只與人腫瘤組織反應、而與人正常組織不反應的抗人生精細胞特異性單克隆抗體)，作為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體；通過免疫沉澱-質譜分析等現代蛋白組學技術，篩選和鑑定相應單克隆抗體所識別的新腫瘤/睪丸抗原分子。下面結合人生精細胞特異性單克隆抗體的製備和篩選，以及新腫瘤/睪丸抗原分子的鑑定對本發明作詳細的說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。1、生精細胞特異性單克隆抗體的製備和篩選1. 1作為免疫原的生精細胞的製備收集行去勢治療的前列腺癌患者睪丸組織(與患者籤訂知情同意書)，用眼科剪剪成小塊，加0. 25%胰蛋白酶34°C輕微振蕩消化30min，靜置5min使組織塊沉降至容器底部，棄上清。組織塊用PBS洗滌3次，加入0. 1 %膠原酶，32°C消化30min，然後經400目篩網過濾，濾過液中即富含生精細胞，PBS洗滌3次後計數備用。1. 2特異性單克隆抗體的製備和篩選取IX IO6個生精細胞重懸於Iml PBS，腹腔注射8周齡雌性Balb/c小鼠，依次間隔4周和3周行第2次及第3次加強免疫。第3次免疫後10天用免疫組化法測定免疫血清效價。選擇免疫血清效價高於1 8000倍稀釋的小鼠，在細胞融合前3天以相同方法加強免疫1次。處死小鼠取脾製備免疫脾細胞懸液備用。取對數生長的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0計數，同時將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按 1 10比例混合，並採用聚乙二醇為促融劑進行細胞融合(具體操作參見細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)。融合後細胞懸液加入含有飼養細胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔板，37°C、5%C02孵箱培養。HAT選擇培養法篩選雜交瘤，其中HAT，H是次黃嘌呤；A是氨基喋呤；T是胸腺嘧啶核苷。待克隆出現後，免疫組化法篩選生精細胞染色陽性克隆，脾臟組織切片作為正常組織陰性對照(具體採用福州邁新公司的Elivision Plus試劑盒)。選取睪丸組織染色陽性而脾臟染色陰性的克隆，有限稀釋法進行3次克隆化，達100%陽性後擴大培養，直至獲得能夠穩定分泌抗體的雜交瘤細胞系(體外連續培養超過6個月)。留取雜交瘤細胞培養上清，同時以雜交瘤細胞接種Balb/c小鼠體內製備腹水， (具體按小鼠腹水製備方法製備包含單克隆抗體的腹水，細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)。腹水經45%飽和硫酸銨沉澱後，採用QFF陰離子交換層析法純化單克隆抗體， 獲得一種生精細胞特異性單克隆抗體，並命名為單克隆抗體FM-I。2、腫瘤/睪丸抗原的篩選和鑑定2. 1免疫組化染色分析FM-I單克隆抗體所識別抗原分子的表達分布將人睪丸組織、多種腫瘤組織(宮頸癌、卵巢癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌)及相對應的正常組織的石蠟切片脫蠟至水並進行抗原修復，0. 3%甲醇-雙氧水浸泡30min，消除內源性過氧化物酶活性後用羊血清封閉30min ；加FM-I單克隆抗體 (0. lmg/L)，室溫作用60min ；依次滴加增強劑(即用型，福州邁新公司的Elivision Plus試劑盒內提供)及HRP標記的二抗(即用型HRP標記羊抗鼠二抗，福州邁新公司的Elivision Plus試劑盒內提供)，室溫各作用30min ；DAB顯色，蘇木素復染；以上各操作步驟之間以 0. OlM PBS浸洗切片5minX3次；蘇木素復染之後，將切片依次用梯度酒精脫水，二甲苯透明，最後中性樹膠封片。人睪丸組織及多種腫瘤組織切片中的免疫組化染色結果如圖1所示，人睪丸組織及多種正常組織切片中的免疫組化染色結果如圖2所示；對比圖1和圖2，結果發現，FM-I 單克隆抗體所識別的抗原在人睪丸組織、宮頸癌、卵巢癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌有高水平表達，而在相應的正常組織中未見表達，這表明FM-I單克隆抗體只與人腫瘤組織反應，且與人正常組織不反應，符合腫瘤/睪丸抗原的表達分布規律，FM-I單克隆抗體可作為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體。2. 2利用FM-I單克隆抗體進行免疫沉澱-質譜分析2. 2. 1FM-1單克隆抗體與S印harose 4B的交聯稱取一定量的S印harose 4B, ImM HCl 浸泡 15min，2000rpm 離心 5s，棄上清，ImM HCl洗滌1次，離心同前，棄上清。以交聯緩衝液(碳酸鹽緩衝液，pH8. 3)洗滌2次，2000rpm
6離心k，棄盡上清後備用。將FM-I單克隆抗體對交聯緩衝液透析後與上述處理過的kpharose 4B混合 (IOmg抗體=Iml處理過的Sepharose 4B)，室溫輕搖2 4h，2000rpm離心5s，棄上清。加入封閉液(3. 75克甘氨酸/IOOml交聯緩衝液)，室溫輕搖1 ai，2000rpm離心5s，棄上清。用醋酸鹽緩衝液(PH43)和交聯緩衝液輪流洗滌3次，離心同前，棄上清，PBS洗滌2 次，2000rpm離心5s，加入含0. 02% NaN3的PBS後置4°C保存備用。2. 2. 2免疫沉澱消化並收集1 2X IO9個Hela細胞(人宮頸癌細胞系，高表達FM-I單克隆抗體所識別抗原分子)，冷PBS洗滌2次，棄上清。按IO7 IO8個細胞/ml的比例加入預冷的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液OOmM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Triton X_100，50mM NaF, 5mM EDTA, pH 7. 5)，充分重懸細胞並置 4°C，30min。4°C離心 12000rpm，lOmin，將上清移入一個新的離心管中，加入1 2ml無關抗體交聯的kpharose 4B，用垂直混合儀4。C 下慢速混勻1 濁。4°C離心2000rpm，lmin，將上清移入另一個新的離心管中，加入1 2ml FM-I單克隆抗體交聯的kpharose 4B，用垂直混合儀4°C下慢速混勻4h以上。以洗液(IOOmM Tris-HCl, 500mM NaCl, 1 % Triton X_100，pH 7. 5)洗滌 3 次，4°C離心 2000rpm， lmin，移棄上清。沉澱中加入1 2ml洗脫液(0. IM甘氨酸-鹽酸，pH2. 7)，輕混2 ;3min，4°C離心2000rpm，lmin,收集上清液，用Milipore超濾濃縮管濃縮或用冷丙酮沉澱， SDS-PAGE (120V,60min)分離目的蛋白，考馬斯亮藍染色。SDS-PAGE電泳結果如圖3所示， 除去FM-I抗體的輕鏈(25KD)和重鏈(50KD)外，在^KD處出現一條新的電泳條帶，即為免疫沉澱所獲得的目的蛋白分子的條帶。2. 2. 3質譜分析從凝膠上切下目的蛋白帶後，加入胰蛋白酶水解，並收集酶水解後形成的肽；繼而應用納升電噴霧四極杆飛行時間串聯質譜儀Q-T0F2(LC-MS/MS)對酶解的肽進行分析液相色譜(LC)第一維分離為強陽離子色譜分離，將使用含0. 甲酸的丙烯腈溶解酶解的待測樣本，並注入多孔性IOs強陽離子交換柱。利用乙酸銨鹽溶液作為洗脫液，按濃度為 IOmM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 75mM, IOOmM, 250mM, 500mM 和 IOOOmM 共 10 個梯度進行柱洗脫， 流速0. 03mL/min。第二維分離為反向色譜儀分離，使用毛細管液相色譜柱，色譜柱連接集成電噴霧噴頭，直接與質譜儀中的納米噴霧接口相連。樣品經一維洗脫後轉移到預裝液相色譜柱中進行脫鹽和富集，流速設定為 0. 03mL/min。使用流動相乙腈/水(體積比2/98，含0. 甲酸)衝洗5min後，將系統切換到毛細管液相色譜柱，流動相設定為線性梯度20 95%的乙腈(含0. 甲酸)，流速設定為0. 0003mL/min，洗脫時間85分鐘。納米電噴霧儀器分析參數為離子噴射電壓2200V， 分離電位60V，聚焦電位^5V，碰撞能量設定為35 %。TOF-MS質譜掃描條件設定TOF_MS全掃描(範圍為300-1200Da)，採集時間1秒，隨後2次產物離子掃描(範圍100_1500Da)，採集時間3秒。篩選標準為離子質/荷比(m/z)在350到1200之間，負載電荷為2 4，豐度閾值每秒計數大於20，動態排除時間為60秒。免疫沉澱電泳目標條帶的酶解多肽的質譜分析所生成的MS圖譜如圖4所示，其中橫坐標為離子質/荷比，縱坐標為相對豐度。應用kquest分析軟體，得到蛋白質的鑑定和定量結果。檢索參數為至少有一個肽段匹配，肽段對該蛋白質鑑定的可信區間為95%以上，並符合其質譜圖波峰對應，並在NCBInr人類蛋白序列資料庫中進行檢索，最後確定 FM-I單克隆抗體所識別的是B細胞相關蛋白31 (B cell associated protein 31，BAP31)。 由於該分子在蛋白水平的表達分布規律與腫瘤/睪丸抗原的表達分布規律一致，且目前國內外尚無該分子在睪丸及腫瘤組織中高表達的相關文獻報導，所以將BAP31定義為一個的新腫瘤/睪丸抗原分子。
權利要求
1.一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)以人生精細胞作為免疫原，應用淋巴細胞雜交瘤技術製備單克隆抗體，免疫組化法篩選識別人生精細胞的特異性單克隆抗體；2)採用免疫組化染色方法，在蛋白水平上從識別人生精細胞的特異性單克隆抗體當中，篩選出只與人腫瘤組織反應，且與人正常組織不反應的特異性單克隆抗體作為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體；3)利用候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體與人陽性腫瘤細胞的裂解物進行抗原抗體反應，收集形成的免疫沉澱，再將候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體所捕獲的腫瘤/睪丸抗原進行蛋白組學分析和鑑定。
2.如權利要求1所述的基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，其特徵在於，所述的在蛋白水平上的篩選為採用免疫組化染色方法，篩選出只與人腫瘤組織石蠟切片反應，且與人正常組織石蠟切片不反應的特異性單克隆抗體作為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體。
3.如權利要求1所述的基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，其特徵在於，所述的免疫沉澱所獲得的腫瘤/睪丸抗原的收集為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體先與kpharose 4B交聯，再與人陽性腫瘤細胞的裂解物進行抗原抗體反應， 形成沉澱之後，沉澱中加入洗脫液，混合後離心，收集上清液，用超濾濃縮管濃縮或用冷丙酮沉澱，然後進行SDS-PAGE，收集所捕獲的腫瘤/睪丸抗原所對應的條帶；所述的洗脫液為0. lmol/L的甘氨酸-鹽酸，pH2. 7。
4.如權利要求1所述的基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，其特徵在於，所述的對免疫沉澱所獲得的腫瘤/睪丸抗原進行蛋白組學分析為將所捕獲的腫瘤/睪丸抗原用蛋白酶降解成多肽，收集酶解後的多肽，對其進行質譜分析以確定蛋白序列。
全文摘要
本發明公開了一種基於生精細胞特異性單克隆抗體篩選和鑑定腫瘤/睪丸抗原的方法，以人生精細胞作為免疫原，應用淋巴細胞雜交瘤技術製備單克隆抗體，免疫組化法篩選生精細胞特異性單克隆抗體；然後在蛋白水平上研究所篩選的單克隆抗體識別的抗原分子在腫瘤組織和其他正常組織的表達分布規律。以此為基礎，採用免疫組化染色選擇針對腫瘤/睪丸抗原表達規律的單克隆抗體，作為候選識別腫瘤/睪丸抗原的抗體；通過免疫沉澱-質譜分析等現代蛋白組學的技術，鑑定相應單克隆抗體所識別的新腫瘤/睪丸抗原分子。
文檔編號G01N30/02GK102507937SQ201110297248
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者宋朝君, 楊琨, 金伯泉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學