一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法
2023-07-09 03:39:36
專利名稱：一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法
技術領域：
本發明涉及一種生物分析的方法，尤其涉及一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法。
背景技術：
目前，對土壤微生物的研究主要是藉助了分子生物學的手段，直接從土壤中獲得微生物的宏基因組DNA進行分析，該策略使環境微生物多樣性分析成為一種儘可能全面的方法。近年來，關於土壤宏基因組DNA提取方法的報導很多。然而主要側重於提取土壤中細菌群落的總DNA的提取，較少關注土壤中真菌群落總DNA的提取及其提取效果。來自環境中的樣品含有非常複雜的成分，尤其是土壤中的腐質酸類物質在提取過程中不能去除掉， 直接影響後續的PCR擴增。所以大多數方法初提的DNA都要經過回收純化，然而回收的過程或多或少的會損失部分DNA，尤其是大片段的DNA回收率比較低，有人利用通過透析袋回收純化，純化回收率只能夠達到65. 34%，仍然喪失了一部DNA，對於實際上存在量本來就少的微生物種類後續的檢測中就很難檢測到，因而不能真實地反土壤微生態結構。因此，如何減少提取以後的DNA損失是有待於解決的問題。
發明內容
本發明為了解決以上的問題而提出一種檢測結果清確度高的檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其技術方案如下一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，包括以下步驟(1)從土壤中進行DNA提取；(2)對步驟(1)中的DNA提取液中測出土壤中的DNA的濃度和純度；(3)將土壤中提取的DNA進行PCR特異性擴增；(4)PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳分析。如上所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其中提取DNA的條件如下 稱土樣於離心管中，加提取液渦旋混勻後置於冰箱靜止或液氮速凍，取出水浴融化，反覆凍融，加蛋白酶K，搖床振蕩，加SDS，水浴在室溫離心，收集上清，儘可能的不要取到上清與土壤沉澱之間的雜質，沉澱加提取液和20% SDS，渦旋水浴一定的時間，室溫下離心，合併上清；上清中加聚己二醇800混勻，沉澱過夜；然後離心，棄上清，沉澱加入IXTE溶解；用等體積的氯仿異戊醇抽提，離心後收集上清，重複一次；用NaAc和異丙醇室溫沉澱，離心後棄上清；沉澱用70%乙醇洗滌，離心後棄上清，晾乾，加超純水溶解。如上所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其中步驟O)中的檢測方法為取所提取的DNA，0.7%瓊脂糖檢測，以λ mixl9 (i^rmentas)為Maker，用紫外分光光度計測定DNA的0D26Q、OD230> OD260/OD230的值及DNA的純度。如上所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其中在步驟(3)中的PCR儀反應條件為反應總體積為20 μ L 模板DNA lng, PCR buffer 2 μ L，Mg2+2 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 2 μ L，BSA (10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/L) 0. 2 μ L, ddH20 補齊至 20 μ L。長片段擴增應程序94% 4min ；94°C 40S，46°C 40S，72°C 40S，共循環 38 次 72°C延伸 IOmin ；4°C保存；取上述的一次擴增產物1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，弓丨物(10 μ Μ)各 0. 5μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 7 μ L, BSA (10mg/mL) 2 μ L, Taq 酶(5U/ μ L) 1 μ L, ddH20 補齊至 50μ L。採用降落式 PCR 反應程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循環 15 次；94°C 30S,63°C 30S(每循環 1 次下降 1)，72°C 30S，共循環 13 次；94°C 30S,52°C 30S, 72°C 30S ；72°C延伸7min ；4°C保存。擴增產物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，DL2000作為 Marker ；細菌16SrDNA 的擴增引物 F27 5 『 -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 『 ；R1522
5『 -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 『，再利用 V3 區的引物 F357-GC 5 『 -CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 『和 R518 :5 『 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 『 擴增 V3 區；真菌 18SrDNA 的擴增引物為 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3『，Geo2 5' -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3『；擴增其中片段用 NS1-GC :5『 -CGCCCGCCGCGCGCGGGC GGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGTC-3' , NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3『。如上所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其中所述的提取液由以下組份組成:0. Imol Tris,0. Imol EDTA，0. Imol 磷酸緩衝液，1. 5mol NaCl, 1% CTAB, ρΗ8· O。如上所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其中所述的土壤為鹽土或鹼性土壤。如上所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其中在步驟中的變性梯度凝膠電泳分析採用的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行分離，分別用濃度為10%，
6%的丙稀醯胺，變性劑範圍為30 % 60 %，電泳150V，6h，EB染色15min後，凝膠成像系統，觀察拍照。利用本發明的方法對各種土壤進行的檢測分析，其結果最接近真實的微生物狀態。因為在處理的過程中，提取的DNA溶液無損失，對研究土壤中的微生物提供了完美的解決方法。
圖1為四種不種質地的土壤總DNA的瓊指糖凝膠檢測；1.藥用植物根際土，2.羅布泊湖鹽土，3.胡楊根際土，4.棉田土壤。圖2為16S rDNA V3區的擴增結果和18S rDNA的擴增結果；1、5為藥用植物根際土，2、6羅布泊湖鹽土，3、7胡楊根際土，4、8棉田土壤。圖3為16S rDNA的DGGE檢測結果；1.藥用植物根際土，2.羅布泊湖鹽土，3.胡楊根際土，4.棉田土壤。圖4為18S rDNA的DGGE檢測結果；1.藥用植物根際土，2.羅布泊湖鹽土，3.胡楊根際土，4.棉田土壤。
具體實施例方式下面將結合具體實施例對本發明的技術方案進行詳細解釋
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實施例1，土壤DNA的提取稱0. 5g四川省螺髻縣的藥用植物根際土(其pH值為4. 30) 土樣於2ml離心管中，加1. 3ml提取液(0. Imol Tris, 0. Imol EDTA，0. Imol磷酸緩衝液， 1. 5mol NaCl, 1% CTAB，pH8. 0)渦旋混勻後置於_80°C冰箱靜止30min (或液氮速凍5min)， 取出於65%水浴融化，反覆凍融3次；加100 μ L蛋白酶K (lmg/ml)，37°C搖床振蕩30min，加 200 μ L濃度為20%的SDS，65°C水浴2h (期間每15 20min輕輕顛倒混勻)，室溫6000r/ min離心lOmin，收集上清，儘可能的不要取到上清與土壤沉澱之間的雜質；沉澱加0. 75ml 提取液和 50μ L20% SDSji^m 10s65°C水浴 lOmin，室溫 6000r/min 離心 lOmin，合併上清； 上清中加0. 5倍體積的聚己二醇800 (50% PEG, 1. 5molNaCl)混勻，沉澱過夜；600r/min離心30min，棄上清，沉澱加入0.5ml 1 X TE溶解；用等體積的氯仿異戊醇Q4 1)抽提， 40C 12000r/min離心20min收集上清，重複一次；用0. 1倍體積NaAc (3mol/L)和0. 6倍體積異丙醇(_20°C預冷)室溫沉澱4h，4°C，12000r/min離心20min棄上清；沉澱用70%乙醇洗滌，4V，12000r/min離心20min棄上清，晾乾；加50 μ L超純水溶解。土壤DNA濃度及純度的檢測取5 μ L所提取的DNA，0. 7 %瓊脂糖檢測，以 λ mixl9 (Fermentas)為 Maker，用紫外分光光度計(BioPhotometer 6131，Eppendoff)測定DNA的0D26(1、0D23(1、0D26(1/0D23(1的值及DNA的純度，測定時DNA稀釋了 10倍，所提土樣量為 0. 5g，最終換算成每克土壤中所提DNA的量。土壤DNA的PCR反應利用細菌的16SrDNA和真菌的18SrDNA特異引物分析土壤中細菌和真菌DNA的提取質量。細菌16SrDNA的擴增引物F27 5 『 -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 『 ；R1522 5 『 -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 『，再利用 V3 區的引物 F357-GC 5 『 -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCA G-3'和 R518:5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3『擴增 V3 區；真菌 18SrDNA 的擴增引物為 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 『 , Geo2 5 『 -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3 『；擴增其中片段用 NSl-GC :5 『 -CGCCCGCCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGT C-3' ,NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3 『進行。二次擴增的引物前均加GC夾子，便於後續的DGGE分析。長片段PCR反應體系及程序擴增反應在BioRad公司生產的Mycycle PCR儀中進行，反應總體積為 20 μ L 模板 DNA lng, PCR buffer 2 μ L，Mg2+2 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 2 μ L，BSA (10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/L) 0. 2 μ L, ddH20 補齊至 20 μ L。長片段擴增應程序94% 4min ；94°C 40S，46°C 40S，72°C 40S，共循環 38 次 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。PCR 二次擴增反應體系取一次擴增產物1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，引物 (10 μ Μ)各 O. 5 μ L，dNTPs (各 IOmM) 0. 7 μ L, BSA (10mg/mL) 2 μ L, Taq 酶(5U/ μ L) 1 μ L, ddH20 補齊至50 μ L。採用降落式PCR反應程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循環 15 次；94°C 30S，63°C 30S(每循環 1 次下降 1)，72°C 30S，共循環 13 次；94°C 30S，52°C 30S, 72°C 30S ；72°C延伸7min ；4°C保存。擴增產物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，DL2000作為 Marker0PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析採用Bio-Rad公司Dcode的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行分離。分別用濃度為10%，6%的丙稀醯胺，變性劑範圍為30% 60%。電泳150V，6h。EB染色15min 後，凝膠成像系統(BioRad, Gel Doc 2000)觀察拍照。實施例2 本實施例中的土樣取自新疆羅布泊湖的鹽土，其pH為6. 96，其土壤DNA的提取、土壤DNA濃度及純度的檢測、土壤DNA的PCR反應、PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE) 分析方法同實施例1。實施例3 本實施例中的土樣取自新疆塔裡木河岸的胡楊根際土，其pH為8. 64，其土壤DNA 的提取、土壤DNA濃度及純度的檢測、土壤DNA的PCR反應、PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析方法同實施例1。實施例4 本實施例中的土樣取自新疆阿克蘇的棉田土，其pH為7. 60，其土壤DNA的提取、土壤DNA濃度及純度的檢測、土壤DNA的PCR反應、PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE) 分析方法同實施例1。上述的四種土壤檢測實施例DNA的提取效果用上述實施例方法提取4種不同性質的土壤均能提取出DNA如圖1，其不同的土壤，藥用植物根際土、鹽土、胡楊根際土和棉田土編號分別為1、2、3和4，片段在23kb以上， 與國內外土壤微生物的提取片斷大小吻合。在酸性土壤中有略微拖尾現象，其他的3類土壤中不存在拖尾現象。腐殖酸在230Am處有吸收峰，通過估算OD26tZOD23tl值來確定所提取的 DNA中腐殖酸的汙染程度OD26tlAD23tl值越高，表明DNA純度越純，反之，腐殖酸汙染越嚴重。 用此方法所提的DNA的比值在0. 89 1. 23之間，如表一所示，從酸性土壤提取的DNA的OD 較低，而在鹽漬土壤和鹼性土壤中提取的DNA的OD比值高一些，表明此方法更適合於提取鹽漬土壤和鹼性土壤的DNA。每Ig 土壤中，所提取的DNA的從3. 74 15. 28g,從羅布泊鹽鹼土壤中提出的量最少，可能與此種土壤中本身生物量較少有關。雖然比值低於理想值，此純度能夠滿足後續分析的需要。表一四種土壤總DNA的提取量和純度。
樣品編號OD230D260OD230/D260DNA的濃度 (ug/g)每克土壤DNA的量 (wg/g)10.4430.3940.8978.87.8820.1580.1881.1937.43.7430.6100.7141.17142.814.2840.6320.7651.21152.815.28PCR的瓊脂糖凝膠檢測結果和DGGE檢測結果。
利用細菌的16SrDNA和真菌的18S rDNA的特異引物對所提取的4種性質的土壤進行PCR擴增，均獲得較強的擴增結果，如圖2所示。16S rDNA V3區的擴增的目標片段為 230bp左右，對18S rDNA的擴增在550bp左右，在胡楊根際土和棉田土壤中的擴增條帶更亮些，說明在這兩個樣品中的擴增更強一些。DGGE圖譜條帶的豐富性和亮弱程度可以反應土壤的微生物的多樣性和優勢種類、特殊種類，可利用DGGE技術分析評價該方法所提DNA 的全面性。圖3為土壤細菌的DGGE圖譜，細菌的條帶數達到40條以上，並且優勢種條帶明顯，條帶集中於整個凝膠的中間部分。圖4為土壤真菌的DGGE圖譜，真菌的條帶數達到30 條以上，優勢種條帶明顯。分析表明細菌的豐富性較真菌多，不同性質的土壤中真菌之間的相似性較細菌之問的相似性小，條帶集中於整個凝膠的中間部分，顯示真菌、細菌均存在較豐富的多樣性。此方法能夠較為靈敏、全面的反應土壤微生物的多樣性，也說明所提DNA較為全面。結論目前提取土壤DNA的方法主要有直接提取法和間接提取法，間接提取純度較高，但提取的種類和數量較少；直接提取法是直接在土壤中裂解細胞，使其中內含物儘可能的釋放，能夠代表大部分的土著微生物。但是由於土壤中所含物質種類較多，量較大，因而提取的質量受到很大的影響，許多方法需要對粗體DNA做純化處理，常用的氯化銫密度梯度超速離心、電泳法、過濾法、試劑盒法。回收純化後往往造成部分DNA的喪失，可能在土壤中本身存在量較少的種類會喪失或檢測不到，影響土壤微生物多樣性的分析。本方法中大量樣品提取改為小量樣品的提取，樣品加入裂解液後_80°C冰箱(或液氮)與65°C反覆凍融，利於細胞壁較厚的微生物充分破壁，使細胞含物的充分釋放，在DNA沉澱的過程中採用聚乙二醇(PEG8000)。沉澱DNA分子所用的PEG的濃度也不同，沉澱大片段DNA分子所需 PEG的濃度只需1 %左右，小片段DNA分子所需PEG濃度高達20%。本實施例中加入終濃度為17% PEG進行沉澱，獲得較好的沉澱效果另外，有人用PEG沉澱結合鹼裂解法提取DNA 可消除肝素對PCR檢測結果的影響DNA，這可能也是本方法不用回收純化而獲得較好質量 DNA的一個原因。目前對於土壤DNA的提取質量方面，一般認為所提取的片段在231Λ以上即可，有人報導每克土壤中所提DNA的量在2. 5 31 μ g之間，本方法所提大小在231Λ以上，DNA的提取量每克土壤中所提取的DNA的從3. 74 15. 28g獲得較穩定的提取量。從土壤中儘可能的提取出所有種類微生物的DNA是進行土壤微生態分析的基礎，也是充分發應土壤微生物多樣性的必備條件。提取土壤DNA進行微生物多樣性分析的一個重要的環節在於是否能夠進行PCR擴增。土壤中存在大量的PCR反應抑制劑，如腐殖酸、腐殖酸類似物， 重金屬離子等，有人提取粗DNA不經過純化，就無法獲得PCR產物。本方法不經過純化直接進行PCR反應，通過兩次PCR，細菌16S rDNA特異引物及真菌18rDNA核糖體DNA特異引物均獲得較好的擴增結果。PCR過程中發現，加入BSA PCR有一定的影響，可能由於本方法不做回收純化，而土壤中有些不確定的物質殘留到PCR體系中，從而影響Taq酶的活性，加入了 BSA對Taq酶有一定的保護作用從而達到更好的擴增效果。PCR分析中發現，此方法提取的宏基因組DNA不但能夠擴增原核生物的特異基因，也能擴增真菌的特異基因，表明該方法能從土壤中同時有效提取細菌和真菌總基因組DNA，DGGE分析結果顯示，土壤細菌和真菌均表現出較高的多樣性，代表了較豐富的類群。本方法不但適於分析土壤細菌群落結構， 同時也可用於分析真菌等真核微生物的多樣性。本方法從4種不同性質的土壤中均有效地提取到DNA，在酸性土壤提取的DNA的雜質殘留較多，與土壤偏酸性有關係，其DNA提取融解液的顏色深，色素殘留較多，但是並不影響後續的PCR及DGGE分析；從鹽土及鹼性土壤中所提的DNA的質量較高，說明該方法更適合於鹽鹼土壤DNA的提取。
權利要求
1.一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，包括以下步驟(1)從土壤中進行DNA提取；(2)對步驟(1)中的DNA提取液中測出土壤中的DNA的濃度和純度；(3)將土壤中提取的DNA進行PCR特異性擴增；(4)PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳分析。
2.如權利要求1中所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其特徵在於，提取 DNA的條件如下稱土樣於離心管中，加提取液渦旋混勻後置於冰箱靜止或液氮速凍，取出水浴融化，反覆凍融，加蛋白酶K，搖床振蕩，加SDS，水浴在室溫離心，收集上清，儘可能的不要取到上清與土壤沉澱之間的雜質，沉澱加提取液和20% SDS，渦旋水浴一定的時間，室溫下離心，合併上清；上清中加聚己二醇800混勻，沉澱過夜；然後離心，棄上清，沉澱加入 IXTE溶解；用等體積的氯仿異戊醇抽提，離心後收集上清，重複一次；用NaAc和異丙醇室溫沉澱，離心後棄上清；沉澱用70%乙醇洗滌，離心後棄上清，晾乾，加超純水溶解。
3.如權利要求1中所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其特徵在於，步驟O)中的檢測方法為取所提取的DNA，0. 7%瓊脂糖檢測，以λ mixl9 (i^rmentas)為 Maker，用紫外分光光度計測定DNA的0D26(1、OD230> OD260/OD230的值及DNA的純度。
4.如權利要求1中所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其特徵在於，在步驟(3)中的PCR儀反應條件為反應總體積為20 μ L 模板DNA lng, PCR buffer 2 μ L， Mg2+2yL，弓丨物(10 μ Μ)各 0.2 μ L，BSA(10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/ L) 0. 2 μ L，ddH20 補齊至 20 μ L。長片段擴增應程序94 % 4min ；94 "C 40S, 46 "C 40S， 720C 40S，共循環38次72°C延伸IOmin ；4°C保存；取上述的一次擴增產物 1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 5 μ L， dNTPs (各 10mM)0. 7μ L，BSA(10mg/mL)2y L，Taq 酶(5U/μ L) 1 μ L，ddH20 補齊至 50 μ L。採用降落式 PCR 反應程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循環 15 次；94°C 30S， 63°C 30S(每循環 1 次下降 1)，72°C 30S，共循環 13 次；94°C 30S，52°C 30S，72°C 30S ；72°C 延伸7min ；4°C保存。擴增產物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，DL2000作為Marker ；細菌 16SrDNA 的擴增弓丨物 F27 :5 『 -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 『 ；R1522 5 『 -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 『，再利用 V3 區的引物 F357-GC 5 『 -CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 『和 R518 :5 『 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 『 擴增 V3 區；真菌 18SrDNA 的擴增引物為 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3『，Geo2 5' -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3『；擴增其中片段用 NS1-GC :5『 -CGCCCGCCGCGCGCGGGC GGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGTC-3' , NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3『。
5.如權利要求1所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其特徵在於，所述的提取液由以下組份組成0. ImolTris,0. Imol EDTA，0. Imol磷酸緩衝液，1. 5molNaCl,l% CTAB, pH 為 8. O。
6.如權利要求1所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其特徵在於所述的土壤為鹽土或鹼性土壤。
7.如權利要求2中所述的一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法，其特徵在於在步驟中的變性梯度凝膠電泳分析採用的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行分離，分別用濃度為10%，6%的丙稀醯胺，變性劑範圍為30% 60%，電泳150V，6h，EB染色15min 後，凝膠成像系統，觀察拍照。
全文摘要
本發明本發明涉及一種生物分析的方法，尤其涉及一種檢測土壤微生物多樣性的分析方法。該方法包括以下步驟(1)從土壤中進行DNA提取；(2)對步驟(1)中的DNA提取液中測出土壤中的DNA的濃度和純度；(3)將土壤中提取的DNA進行PCR特異性擴增；(4)PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳分析。利用本發明的方法對各種土壤進行的檢測分析，其結果最接近真實的微生物狀態。因為在處理的過程中，提取的DNA溶液無損失，對研究土壤中的微生物狀態提供了完美的解決方法。
文檔編號C12Q1/68GK102399855SQ201010277480
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月9日 優先權日2010年9月9日
發明者丁國才 申請人:上海海帝園藝有限公司