一種酪蛋白活性單肽及其製備方法與應用的製作方法

2023-07-09 04:08:46 3

專利名稱：一種酪蛋白活性單肽及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉抑制酸乳發酵及儲藏的技術領域，具體涉及從酪蛋白酶解液分離得到的 具有促進酸乳發酵和抑制酸乳後酸化的生物活性單肽及其應用。
背景技術：
酸乳是指在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的作用下，使用添加(或不添加)乳 粉(全脂或脫脂)的乳進行乳酸發酵而得到的凝固乳製品，最終產品中必須含有大量的活 菌。乳酸菌的發酵作用可以使乳白蛋白變成微細的凝乳粒，易於消化吸收，發酵過程中乳酸 菌可以產生機體營養所必需的維生素、煙酸和葉。酸乳除了保留了牛奶的全部營養外，其 與鮮奶最顯著的差異就是在於它還含有大量的乳酸及易於人體腸道健康的活性乳酸菌。我國酸乳生產中所用的乳酸菌大多為國外購進的直投式發酵劑(Direct-to vat caulture，簡稱DVS)，繼代式酸乳菌種的應用量相當小。與液體菌種相比，直投式發酵劑的 潛伏期要長得多。其發酵時間通常比使用傳統的翻代液體發酵劑要延長2 3小時左右， 對於大型乳品廠，這是一個不容忽視的影響因素。因此，如何縮短直投式菌種的發酵時間， 提高生產效率，以及如何採取有效手段在減少發酵劑使用量，同時保證產品品質，來降低成 本也是重要的研究方向。在酸乳發酵過程中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌具有生長互補的作用或稱為共 生(Mutualism)，球菌的生長同時會促進桿菌的生長，而桿菌生長形成的代謝產物又保證球 菌的生長。乳桿菌對酸乳的貢獻是分解蛋白質、產酸，鏈球菌對酸乳的良好風味和感官品質 具有重要作用。酸乳在貨架期必須保持微生物活性和良好的質構和風味。即使冷藏在0 5°C條件下，乳酸菌的新陳代謝導致的後酸化現象依然存在，這造成過乳清析出、酸味過重 甚至產生澀味。以上現象嚴重影響酸乳的品質導致其保質期被大大縮短。因此，通過在酸乳中添加具有含有益生功能因子的酪蛋白生物活性肽，有效地促 進酸乳發酵縮短發酵時間並且抑制酸乳再儲藏期間產生後酸化延長酸乳保質期，對酸乳行 業具有重大的經濟價值和現實意義。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，提供一種有牛乳來源的、高安全性 的、具有可產業化的酪蛋白活性單肽及其製備方法與應用。為實現上述目的，本發明採用以 下技術方案。—種酪蛋白活性單肽的製備方法與應用，包括如下步驟
(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進行酶解，得酶解
液；
(2)當水解度達到9% 10%時，90 95°C加熱15 20min滅酶，終止酶解反應以控 制生物活性肽的分子量；
(3)將滅酶活的酶解液依次通過膜分離、大孔樹脂、凝膠色譜、反相高效液相進行分離純化，即得所述生物活性肽。上述的製備方法，步驟(3)中將滅酶活的酶解液在4°C下以6000 g離心20分鐘，將 上清液經超濾(取分子量小於3000道爾頓的組分)後，採用大孔樹脂NKA-II，收集10-20% (w/w)乙醇洗脫液，接著採用S^hadex (葡聚糖凝膠)G-25，流動相為去離子水，檢測波長 220nm，按吸收峰順序收集；經S印hadex G-25分離得到的具有較強活性的組分再經C18高效 液相色譜分離純化，分離條件為5_40%乙腈和95-60%去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm， 按吸收峰順序收集。本發明還提供了由上述製備方法製得的具有促進酸乳發酵和抑制酸乳後酸化的 酪蛋白活性單肽。上述酪蛋白活性單肽，通過液相色譜-電噴霧串聯質譜測定其分子量為801. 4道 爾頓，該活性單肽胺基酸序列如序列表中序列1所示。所述的酪蛋白活性單肽可應用於酸乳發酵中，促進酸奶發酵，抑制酸奶後酸化。本發明採用了以上技術方案，具有如下優點和效果
1、本發明通過對酪蛋白酶解液的進一步分離、純化得到了胺基酸序列為NPSKENL的 肽，該活性肽具有明顯縮短酸乳發酵時間和抑制酸乳後酸化作用。2、本發明分離純化所得的生物活性肽是從酪蛋白中分離得到的乳源性肽，可以安 全的添加的到酸乳中。


圖1為S印hadex G-25對酪蛋白酶解液的初步分離圖； 圖2為RP-HPLC對生物活性肽的分離純化圖3為實施方式中添加50ppm (w/w)生物活性單肽對酸乳發酵周期和空白對照對應酸 乳發酵周期的影響曲線；
圖4為實施方式中添加50ppm (w/w)生物活性單肽對酸乳儲存期產酸的影響曲線和空 白對照對應的影響曲線。圖5為實施方式中添加50ppm (w/w)的生物活性單肽對酸乳儲存期乳酸菌活菌數 的影響曲線和空白對照對應的影響曲線。
具體實施方案下面結合附圖和實施例對本發明的具體實施作進一步說明。實施例1 利用酪蛋白酶解液生產具有顯著的促進酸乳發酵和抑制酸乳後酸化的 生物活性單肽
1、可控酶解在50°C，PH 6. 0的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進行酶解，得酶解液。2、酶解液滅酶90°C加熱15min滅酶，終止酶解反應。3、將滅酶活的酶解液離心(6000 χ g，4°C ) 20分鐘，將上清液經超濾(取分子量小 於3000道爾頓的組分)後，採用大孔樹脂NKA-II，收集10% (w/w)乙醇洗脫液，接著
採用S印hadex G-25,流動相為去離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集，如圖1所示。 經S印hadex G-25分離得到的具有較強活性的組分再經C18高效液相色譜分離純化，分離條 件為5% (w/w)乙腈和95% (w/w)去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集， 如圖2所示。
實施例2 利用酪蛋白酶解液生產具有顯著的促進酸乳發酵和抑制酸乳後酸化的生物 活性單肽
1、可控酶解在55°C，pH 7. 5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進行酶解，得酶解液。2、酶解液滅酶95°C加熱20min滅酶，終止酶解反應。3、將滅酶活的酶解液離心(6000 χ g，4°C ) 20分鐘，將上清液經超濾(取分子量小 於3000道爾頓的組分)後，採用大孔樹脂NKA-II，收集20% (w/w)乙醇洗脫液，接著
採用Si^phadex G-25,流動相為去離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集，如圖1所示。 經S^hadex G-25分離得到的具有較強活性的組分再經C18高效液相色譜分離純化，分離條 件為40% (w/w)乙腈和60% (w/w)去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收 集，如圖2所示。
實施例3 生物活性肽對酸乳發酵周期的影響
在酸乳發酵前添加50ppm (w/w)實施例1所得生物活性肽HAQQKE替換等蛋白的奶 粉，測定酸乳發酵周期，即TPH4.5，酸乳發酵到pH4. 5所需要的時間，單位為小時。如圖3所 示，添加NPSKENL後酸乳發酵周期縮短了 23. 00%。實施例3 生物活性肽對酸乳儲藏期的酸度變化的影響
測定按實施例2所發酵酸奶在28天儲藏期間的滴定酸度即潔尼爾度T°變化。試驗方法用5ml吸管取攪拌均勻的發酵乳5ml，加入含25ml蒸餾水錐形瓶中，滴 入3 4滴1%酚酞指示劑，用0. INNaOH滴定至淺紅色，保持20s不退色。消耗NaOH溶液 的毫升數乘以20即為酸度T°。由圖4可見，添加NPSKENL後酸乳儲存28天後產酸量相對於空白樣減少了 24. 07%，這表明50ppm的NPSKENL可明顯抑制酸乳乳儲存過程中產酸，有助於保持酸乳產品 風味，延長保質期。實施例4 生物活性肽對酸乳儲藏期的乳酸菌活菌數變化的影響
測定按實施例2所發酵酸奶在28天儲藏期間的乳酸菌活菌數變化，採用試管法。試驗方法在無菌操作條件下，將酸乳充分攪拌均勻，移取1ml，加入含9ml稀釋 液試管內，製成1 : 10的均勻稀釋液，並在渦流儀上充分混勻。再從後者中吸取Iml於9ml 稀釋液中，並依次做10倍遞增稀釋至10_6，ΙΟ"7兩個稀釋度。每個稀釋度吸取Iml於滅菌試 管培養基中，做兩個平行樣，在37°C恆溫培養箱中培養72h。圖5表明，添加NPSKENL後，酸乳在儲藏28天後乳酸菌活菌數是空白的2. 35倍， 結果表明生活活性肽NPSKENL能夠顯著促進乳酸菌生長繁殖，提高酸乳品質。
權利要求
一種酪蛋白活性單肽，該活性單肽胺基酸序列如序列表中序列1所示。
2.權利要求1所述一種酪蛋白活性單肽的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進行酶解，得酶解液；(2)當水解度達到9% 10%時，90 95°C加熱15 20min滅酶，終止酶解反應以控 制生物活性肽的分子量；(3)將滅酶活的酶解液依次通過膜分離、大孔樹脂、凝膠色譜、反相高效液相進行分離 純化，即得所述生物活性肽。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中將滅酶活的酶解液在4°C 下以6000 g離心20分鐘，將上清液經超濾，取分子量小於3000道爾頓的組分，採用大孔樹 脂NKA-II，用10-20% (w/w)乙醇洗脫，收集洗脫液，接著採用Sephadex G-25，流動相為去 離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集；經S印hadex G-25分離得到的具有較強活性 的組分再經C18高效液相色譜分離純化，分離條件為5-40%乙腈和95-60%去離子水梯度洗 脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集。
4.權利要求1所述的酪蛋白活性單肽應用於酸乳發酵中，促進酸奶發酵，抑制酸奶後 酸化。
全文摘要
本發明提供一種酪蛋白活性單肽及其製備方法與應用，胺基酸序列為Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。本發明應用現代酶催化技術對酪蛋白進行酶解，利用生物分子分離純化技術對具有促進酸乳發酵和抑制酸乳後酸化活性較強的部分進行分離純化，對純化得到的活性單肽進行胺基酸序列分析。該活性肽具有明顯縮短酸乳發酵時間和抑制酸乳後酸化作用，可以安全的添加的到酸乳中，將該生物活性肽作為酸乳發酵添加劑提高酸乳產品質量。
文檔編號A23C9/13GK101993476SQ201010277790
公開日2011年3月30日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者崔春, 張清麗, 趙海鋒, 趙謀明 申請人:華南理工大學