一種增強ICG單線態氧產量的方法及ICG包覆的納米金顆粒及其製備方法與流程

2023-05-10 07:28:17 2

本發明屬於藥物化學領域，涉及一種增強icg單線態氧產量的方法及icg包覆的納米金顆粒及其製備方法。
背景技術：
：吲哚菁綠(icg)是美國食品藥物管理局(fda)批准的一種用於臨床的近紅外成像劑。icg是一種三碳花菁染料，吸收峰和螢光發射峰都在近紅外區，由於近紅外光的組織穿透深度較大，受背景影響較小，作為一種診斷用試劑在血容量、心輸出量、肝功能、視網膜、脈絡膜的脈管系統進行診斷時能起到很好的輔助作用。另外，icg可以將光能轉化為熱能或產生單線態氧，在光熱治療(ptt)和光動力治療(pdt)中有潛在應用前景(biotechnol.adv.,2016,34,758-789)。icg單體在水中光熱穩定性差，導致其光照過程中非單線態光降解途徑為主，單線態氧產率低。icg在水中易形成聚集體，可顯著增強其光熱穩定性；但聚集體產生單線態氧的能力比單體還低，不利於單線態氧相關的應用。目前很多研究都致力於增強icg的穩定性。johnc.kraft等通過疏水相互作用將icg嵌入脂質體中，利用脂質體使icg在水溶液中溶解性增強，進而獲得更強的icg螢光，提高了成像效率(biochemistry,2014,53,1275-1283)。leey.等利用兩嵌段共聚物包裹icg，同樣是通過增強icg的穩定性進而提高了icg單線態氧產量(sci.rep.,2017,7,46688)。liy.等用二氧化矽包裹的金棒通過介孔的吸附作用負載icg，利用二氧化矽增強icg穩定性，並利用金棒吸收截面大的特點減小icg的光降解(acsnano,2014,11,11529-11542)。還有一些研究利用靜電相互作用將icg負載在納米材料中，增強icg穩定性(colloidssurfbbiointerfaces,2015,136,402-412；langmuir,2015,31,6202-6210)，但大部分研究集中在icg的光熱效應，光動力治療的應用較少。主要原因還是由於icg水中的不穩定性以及光降解嚴重，單線態氧產量很低，如何增強icg的單線態氧產量是icg應用於光動力治療面臨的重要問題。技術實現要素：針對現有技術中存在的技術問題，本發明提供一種增強icg單線態氧產量的方法及一種icg包覆的納米金顆粒及其製備方法，所述增強icg單線態氧產量的方法，增強了其光熱穩定性並實現了icg單線態氧產量的增強，所述icg包覆的納米金顆粒及其製備方法，實現了生物體系中icg的載帶和單線態氧產量的增強。為達到上述目的，本發明採用以下技術方案：本發明目的之一在於提供一種增強icg單線態氧產量的方法，使用正電荷分子孵化icg。所述方法利用帶正電荷的表面活性劑分子或陽離子聚電解質通過靜電相互作用促進icg形成聚集體從而增強了其光熱穩定性並實現了icg單線態氧產量的增強。其中，所述孵化為將幾種組成加入同一溶液中混勻後置於適宜溫度水浴中放置。作為本發明優選的技術方案，所述正電荷分子包括陽離子表面活性劑和/或正電荷聚電解質。優選地，所述陽離子表面活性劑包括十六烷基三甲基溴化銨和/或十六烷基三甲基氯化銨。優選地，所述正電荷聚電解質為聚二烯丙基二甲基氯化銨。作為本發明優選的技術方案，所述正電荷分子與icg的摩爾比為(1～100):1，如1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、40:1、50:1、60:1、80:1或100:1等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。作為本發明優選的技術方案，所述孵化的溫度為20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，所述孵化的時間為3～10min，如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，所述孵化在避光條件下進行。本發明目的之二在於提供一種icg包覆的納米金顆粒，所述納米金顆粒由內到外依次包覆正電荷分子層和icg層。本發明所使用的納米金顆粒為採用本領域技術人員公知的製備方法製備得到，在此不再贅述。其中，所述納米金顆粒的直徑為10～20nm。本發明目的之三在於提供一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：(1)使用正電荷分子孵化納米金顆粒，得到正電荷分子包覆的納米金顆粒溶液；(2)將步驟(1)得到的正電荷分子包覆的納米金顆粒溶液與icg混合，孵化，得到納米金顆粒負載的icg。作為本發明優選的技術方案，步驟(1)所述正電荷分子與所述納米金顆粒的摩爾比為(105～106):1，如1×105:1、2×105:1、3×105:1、4×105:1、5×105:1、6×105:1、7×105:1、8×105:1、9×105:1或1×106:1等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1)所述孵化的溫度為20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1)所述孵化的時間為3～10min，如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。9、作為本發明優選的技術方案，當步驟(1)所述正電荷分子為聚二烯丙基二甲基氯化銨時，在步驟(1)前進行步驟(1′)，先使用十六烷基三甲基溴化銨孵化金納米顆粒，再使用聚苯乙烯磺酸鈉孵化金納米顆粒，得到聚苯乙烯磺酸鈉包覆的金納米顆粒。優選地，步驟(1′)所述十六烷基三甲基溴化銨與所述納米金顆粒的摩爾比為(1×105～2×107):1，如1×105:1、3×105:1、5×105:1、7×105:1、2×106:1、4×106:1、6×106:1、8×106:1、1×107:1或2×107:1等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1′)所述十六烷基三甲基溴化銨孵化的溫度為20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1′)所述十六烷基三甲基溴化銨孵化的時間為3～10min，如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1′)所述聚苯乙烯磺酸鈉與所述金納米球的質量摩爾比為(200～20000):1mg/nmol，如200:1、400:1、600:1、1000:1、2000:1、3000:1、5000:1、10000:1、15000:1、18000:1或20000:1等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1′)所述孵化的溫度為20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(1′)所述孵化的時間大於等於3h，如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。作為本發明優選的技術方案，當步驟(1)所述正電荷分子為聚二烯丙基二甲基氯化銨時，所述聚二烯丙基二甲基氯化銨與所述金納米球的質量摩爾比為(200～20000):1mg/nmol，如200:1、400:1、600:1、1000:1、2000:1、3000:1、5000:1、10000:1、15000:1、18000:1或20000:1等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，當步驟(1)所述正電荷分子為聚二烯丙基二甲基氯化銨時，步驟(1)所述孵化的溫度為20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，當步驟(1)所述正電荷分子為聚二烯丙基二甲基氯化銨時，步驟(1)所述孵化的時間大於等於3h，如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。作為本發明優選的技術方案，步驟(2)所述正電荷分子包覆的icg與納米金顆粒的摩爾比為(104～105):1，如1×104:1、2×104:1、3×104:1、4×104:1、5×104:1、6×104:1、7×104:1、8×104:1、9×104:1或1×105:1等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(2)所述孵化的溫度為20～40℃，如20℃、21℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。優選地，步驟(2)所述孵化的時間為3～10min如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等，但並不僅限於所列舉的數值，該數值範圍內其他未列舉的數值同樣適用。與現有技術方案相比，本發明至少具有以下有益效果：(1)本發明提供一種增強icg單線態氧產量的方法，所述方法增強了其光熱穩定性並實現了icg單線態氧產量的增強；(2)本發明還提供一種icg包覆的納米金顆粒及其製備方法，所述方法實現了生物體系中icg的載帶和單線態氧產量的增強。附圖說明圖1a是對比例1中雷射照射下與未經ctab孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖1b是實施例2中雷射照射下與經ctab孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖1c是實施例4中雷射照射下與經ctab孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖2是對比例1、對比例2、對比例2在暗態50℃下以及實施例1-4中naa降解量隨時間變化圖；圖3a是實施例5中雷射照射下與經ctac孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖3b是實施例6中雷射照射下與經pddac孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖3c是對比例3中雷射照射下與經pss孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖3d是對比例4中雷射照射下與經sds孵化的icg混合的naa降解的隨加光時間變化的消光光譜圖；圖4a是對比例5中經ctab包覆的金納米球,在808nm雷射照射下降解naa的消光光譜圖；圖4b是實施例11中經ctab和icg包覆的金納米球,在808nm雷射照射下降解naa的消光光譜圖；圖4c是實施例12中經pddac和icg包覆的金納米球,在808nm雷射照射下降解naa的消光光譜圖。具體實施方式為更好地說明本發明，便於理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下：naa作為一種還原劑，可以被單線態氧氧化分解，本發明利用naa的降解來間接表示icg單線態氧的產量，通過265nm處naa特徵吸收峰的降低計算naa的降解量。各實施例以及對比例中所用試劑和儀器如下所示：四氯金酸(haucl4)、硝酸銀(agno3)、十六烷基三甲基氯化銨(ctac)、十二烷基磺酸鈉(sds)購自國藥集團化學試劑有限公司；硼氫化鈉(nabh4)、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、聚苯乙烯磺酸鈉(pss)、抗壞血酸(aa)購自alfaaesar；聚二烯丙基二甲基氯化銨(pddac)、抗壞血酸鈉(naa)購自sigmaaldrich；硫酸(h2so4)購自北京化工廠；紫外-可見吸收光譜在variancary50上測得，zeta電勢在zetasizernanozs上測得。實施例1一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為1mm的ctab溶液(ctab終濃度為10μm)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例2一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為5mm的ctab溶液(ctab終濃度為50μm)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例3一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為10mm的ctab溶液(ctab終濃度為100μm)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例4一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為50mm的ctab溶液(ctab終濃度為500μm)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例5一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為50mm的ctac溶液(ctac終濃度為500μm)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例6一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入50μl濃度為20mg/ml的pddac溶液(pddac的終濃度為1mg/ml)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例7一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為50mm的ctab溶液(ctab終濃度為500μm)，在40℃水浴中避光孵化3min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例8一種增強icg單線態氧產量的方法：在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為50mm的ctab溶液(ctab終濃度為500μm)，在20℃水浴中避光孵化10min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。實施例9一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：(1)取1ml濃度為0.1nm的金納米球，加入1μl濃度為0.1m的ctab溶液，在30℃水浴中孵化5min，得到ctab包覆的納米金顆粒溶液；(2)將1ml濃度為0.1nm步驟(1)得到的ctab包覆的納米金顆粒與10μl濃度為500μm的icg溶液混合，30℃水浴中避光孵化5min，得到納米金顆粒負載的icg。實施例10一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：(1)取1ml濃度為0.1nm的金納米球，加入0.1μl濃度為0.1m的ctab溶液，在40℃水浴中孵化3min，得到ctab包覆的納米金顆粒溶液；(2)將1ml濃度為0.1nm步驟(1)得到的ctab包覆的納米金顆粒與20μl濃度為500um的icg溶液混合，40℃水浴中避光孵化3min，得到納米金顆粒負載的icg。實施例11一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：(1)取1ml濃度為0.1nm的金納米球，加入0.5μl濃度為0.1m的ctab溶液，在20℃水浴中孵化10min，得到ctab包覆的納米金顆粒溶液；(2)將1ml濃度為0.1nm步驟(1)得到的ctab包覆的納米金顆粒與10μl濃度為500μm的icg溶液混合，20℃水浴中避光孵化10min，得到納米金顆粒負載的icg。實施例12一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：(1′)取1ml濃度為0.5nm的金納米球，加入5ul濃度為0.1m的ctab溶液，在30℃水浴中孵化5min。加入50μl含60mmnacl的濃度為20mg/mlpss溶液，放入30℃水浴孵化3h，12000rpm離心5min，棄去上清液之後加入等體積三次水溶解，得到pss包覆的納米金顆粒溶液；(1)向步驟(1′)得到的溶液中加入50μl含60mmnacl的濃度為20mg/mlpddac溶液，迅速混勻，放入30℃水浴孵化3h，12000rpm離心5min，棄去上清液之後加入等體積三次水溶解，得到pss以及pddac包覆的納米金顆粒溶液；(2)取1ml濃度為0.1nm的包覆了pddac的金納米球中加入10ul濃度為500μm的icg溶液，30℃水浴中避光孵化5min，得到納米金顆粒負載的icg。實施例13一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，除了步驟(1′)中金納米球的濃度為0.05nm，ctab的濃度為0.2m外，其他條件均與實施例12相同。實施例14一種icg包覆的納米金顆粒的製備方法，除了步驟(1′)中金納米球的濃度為5nm外，其他條件均與實施例12相同。對比例1在1ml濃度為5μmicg溶液中加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。對比例2在1ml三次水中加入10μl濃度為50mm的ctab溶液(ctab終濃度為500μm)，之後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。對比例3在1ml濃度為5μmicg溶液中加入50μl濃度為20mg/ml的pss溶液(pss的終濃度為1mg/ml)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。對比例4在1ml濃度為5μmicg溶液中加入10μl濃度為50mm的sds溶液(sds終濃度為500μm)，在30℃水浴中避光孵化5min後加入5μl濃度為10mm的naa溶液，攪拌均勻之後將混合溶液加入樣品池中，紫外分光光度計的測量範圍為200～1100nm。對比例5所述方法除了不進行步驟(2)外，其他條件均與實施例11相同。本發明基於四個基本的實驗現象：(1)icg在808nm雷射照射下能產生單線態氧，單線態氧的產量可以由氧化naa的效果間接反映。(2)將icg與不同濃度的ctab孵化後，雷射照射後降解naa的能力增強，並且增強的效果與ctab濃度正相關。(3)同樣是帶正電的高分子ctac、pddac也能夠增強icg產生單線態氧的效果，而帶負電的sds、pss則不會影響icg單線態氧產量。(4)用覆蓋了ctab或pddac的金納米球可以靜電負載icg，同樣可以實現單線態氧產量的增強。首先，naa作為一種還原劑，可以被單線態氧氧化分解，本發明利用naa的降解來間接表示icg單線態氧的產量，通過265nm處naa特徵吸收峰的降低計算naa的降解量。在波長為808nm的連續雷射照射下，icg可以使naa降解，隨著icg的光降解，naa的降解速度變慢。在加入陽離子表面活性劑ctab之後，icg降解naa的能力增強。為了探究這種增強與ctab濃度是否相關，分別採用了10μm/50μm/100μm/500μm五個濃度的ctab與icg進行孵化，對比他們在2w/808nm的連續雷射照射3分鐘內naa降解的不同，可以看出，ctab的確可以增強naa的氧化降解，即ctab可以提高icg的單線態氧產生，並且單線態氧產量的提高與ctab的量成正相關(圖1，圖2)。為了探究這種效果是否是因為ctab分子與icg產生了特殊的反應，本發明還分別用ctac、pddac、pss、sds來孵化icg，其中ctac和pddac帶正電而pss和sds帶負電。結果(圖3)可見，這種單線態氧產量的增強不僅發生在ctab溶液中，而是一種正電荷高分子鏈的普遍效果，帶負電的高分子鏈並不能影響icg的單線態氧產量。從icg本身的紫外-可見吸收光譜可以看出(圖1)，隨著ctab濃度的增加，icg的單體峰(780nm處)變小，在長波側和短波側吸收峰變強，吸收峰的這種變化表明由於與正電荷高分子鏈的靜電相互作用，icg形成了更多的聚集體(j.photochem.photobiol.b:biol.,1998,47,155-164)，這種聚集體的增多起到一種對icg的保護作用(acsnano,2014,11,11529-11542)，使icg單線態氧產量增加。icg作為一種光敏劑應用時，需要載體將icg運入體內。最後為了實現本發明中發現的對icg單線態氧產量增強效果的實際應用，用金納米顆粒作為載體，表面分別用ctab和pddac包覆(表1)，用金納米顆粒負載之後，icg會表現出與相同量高分子鏈孵化時一致的單線態氧增強效果(圖4b/c)，用ctab包覆的金納米顆粒負載icg之後，氧化降解naa時會導致金顆粒的團聚，這種現象在不負載icg的情況下沒有出現，是負載在金納米顆粒表面的icg光降解產物導致了金顆粒的團聚(圖4a/b)，進一步表明了對icg的成功負載。表1表面電勢(mv)ctabpsspddacaus31.6±3.2-41.5±2.454.1±5.1aus-icg17.7±1.4-42.6±4.3申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細結構特徵，但本發明並不局限於上述詳細結構特徵，即不意味著本發明必須依賴上述詳細結構特徵才能實施。所屬
技術領域：
的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁12