一種豬肉風味肽及其生產方法與應用的製作方法

2023-07-08 09:47:21 1

專利名稱：一種豬肉風味肽及其生產方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程和食品添加劑領域，具體涉及一種豬肉風味肽及其生產方法與應用。
背景技術：
食品具有營養、安全和感官三大要素。滋味是食品感官質量最重要的屬性之一，主要是通過舌頭的味蕾感知，其次是自由神經末梢，是水溶性物質刺激味覺感受器再經過味覺神經傳入到大腦的味覺中樞，經分析整合產生的化學感應。滋味一般由甜味、成味、苦味、酸味和鮮味五種基本味覺構成，它們的味覺感受器分別位於舌頭的不同區域，同時口腔後部，胃和直腸也有部分能與呈味物質發生特異性結合的受體，呈味物質與這些受體結合後並不能讓人產生味感，而只是起到加強味感的作用。呈味肽是指從食物中提取或由胺基酸合成得到的對食品風味具有一定貢獻的相對分子量低於5000u的寡肽類，包括·特徵滋味肽和風味前體肽。呈味肽具有多種滋味特徵，其呈味效果往往不是單一的某種滋味，而是各種滋味的綜合效應，從而賦予食品鮮美濃鬱、圓潤香滑、回味悠長的味感。呈味肽存在於肉類、水果和蔬菜等各種食物中，無論對於加工食品還是未經加工食品的風味都非常重要。呈味肽不但能產生特徵滋味，還可以作為揮發性風味物質的前體物參與美拉德反應，形成特殊的芳香氣味，因此通常所說的各種肽的呈味作用是其綜合效果。基因工程技術在食品工程領域得到了越來越多的應用。在蛋白類香精生產方面，利用基因工程方法特異性表達蛋白類香精具有目前酶法水解方法無法比擬的專一性強的優點，同時也將克服目前蛋白類香精生產原料成分不確定，有苦味物質存在，影響產品風味等缺點，得到了世界香精香料大公司和一些研究單位的重視。天津科技大學曾松榮等中國生物工程雜誌發表《重組畢赤酵母發酵牛肉風味肽的中試研究》，稱在畢赤酵母中表達牛肉風味肽，生產的牛肉風味肽具有牛肉風味特徵，但其採用的表達宿主菌是畢赤酵母，其利用甲醇作為碳源與誘導劑具有較高的食品安全隱患。

發明內容
本發明的目的在於根據現有技術中存在的上述不足，提供一種具有強烈豬肉風味特徵與高食品安全的豬肉風味肽。本發明另一目的在於提供上述豬肉風味肽的生產方法。本發明還有一個目的在於提供上述豬肉風味肽的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種豬肉風味肽，其胺基酸序列如SEQ ID N0:1所示。編碼所述豬肉風味肽的核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。一種重組質粒，是將所述豬肉風味肽基因連入釀酒酵母分泌表達載體PlCAS中，構成重組質粒。
一種重組菌株,是攜帶有所述重組質粒質粒的菌株Escherichia coli Top 10/PICAS-PFP。一種重組工程菌，由所述重組質粒轉化釀酒酵母宿主菌釀酒酵母MT8-1後得到。本發明所述豬肉風味肽的生產方法，其特徵在於包括如下步驟(I)將豬肉通過木瓜蛋白酶、複合蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種酶解獲得豬肉酶解物，通過Sephadex G_15凝膠柱分離不同肽類物質，並進行感官評價，利用MALD1-T0F-MS質譜分析鑑定感官評價6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明顯豬肉風味特徵的豬肉風味肽胺基酸序列；(2)利用釀酒酵母偏好密碼子設計與豬肉風味肽胺基酸序列相對應的核苷酸序列，通過β_乙腈亞磷酸胺化學合成法，使用全自動合成儀合成；(3)為實現豬肉風味肽在釀酒酵母中分泌表達，採用PICAS質粒，該質粒主要包含它有一個啟動子GAPDH，一個來自葡萄糖澱粉酶的分泌信號序列，一個多克隆位點(包含Sac I1、Bgl I1、Xho1、Nco I酶切位點);含有兩個選擇性遺傳標記TRPl和Ampr以及一個可在大腸桿菌中獨立複製的複製起始位點ColElori，在其基礎上引入技術方案I中合成的基因(SEQ ID NO 3)，合成的基因中引入Bgl II與Xho I酶切位點，把合成基因與PICAS質粒通過Bgl II與Xho I進行雙酶切，體外連接構建重組質粒pICAS-pfp ；(4)以LiCl法將Xba I線性化的質粒pICAS-p fp轉化釀酒酵母MT8-1，在SD平板上培養3-4天，挑取SD平板上的克隆轉化子，提取基因組DNA作為模板，進行酵母重組基因組PCR鑑定，獲得重組轉化子；(5)將重組轉化子接種至ImL YI3D培養基中培養適當時間後，轉接到50mlSDC培養基中培養72h離心收集上清液，對上清液進行抽濾，即得到具有強烈豬肉風味的豬肉風味肽； 其中，步驟(I)中所述感官評價的方法是將酶解產物水提物凝膠柱分離峰組分凍乾粉，按照O. 2mg/mL的質量濃度添加到純水中,請12名感官評定員進行評定,評定的定義是添加酶解產物純水的濃厚味強度為4分，並以八分標度法對樣品濃厚感強度進行標度檢驗，從而評定這酶解產物對豬肉風味的影響。每個評價樣品都隨機3位數編號後，打亂順序交給評價員進行滋味評定，同一個樣品每名評價員評價3次，，取3次測定平均值為最終評價分數。本發明豬肉風味肽與10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水調節pH值6. 5，在100°C加熱2h，除去上層奶油層即得豬肉熱反應香精。在200g本發明豬肉風味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入單甘酯乳化lOmin，即得具有豬肉風味的調味品。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明採用釀酒酵母表達體系分泌表達從豬肉酶解物中分離純化出的豬肉風味肽，在保持豬肉風味的同時，與一般昂貴的通過蛋白酶酶解豬肉獲得豬肉風味肽的方法比起來具有產量高、生產成本低可工業化應用等優點。釀酒酵母作為釀酒工業中廣泛應用的菌種，具有遺傳背景清晰並且已經被證明是一種安全的可應用於食品的微生物。利用釀酒酵母作為表達體系的宿主菌，在高效、快速、低成本獲取豬肉風味肽的同時保證了獲取的豬肉風味肽食品安全的問題。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1豬肉風味肽的胺基酸序列與基因序列將豬肉通過木瓜蛋白酶、複合蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種酶解獲得豬肉酶解物，通過Sephadex G_15凝膠柱分離不同肽類物質，將酶解產物水提物凝膠柱分離峰組分凍乾粉，按照O. 2mg/mL的質量濃度添加到純水中，請12名感官評定員進行評定，評定的定義是添加酶解產物純水的濃厚味強度為4分，並以八分標度法對樣品濃厚感強度進行標度檢驗，從而評定這酶解產物對豬肉風味的影響。每個評價樣品都隨機3位數編號後，打亂順序交給評價員進行滋味評定，同一個樣品每名評價員評價3次，取3次測定平均值為最終評價分數。取感官評價分數在6. 5分以上的組分，利用MALD1-T0F-MS質譜分析鑑定感官評價6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明顯豬肉風味特徵的豬肉風味肽胺基酸序列，基因序列根據豬肉風味肽胺基酸序列利用釀酒酵母偏好密碼子設計基因序列，得到具有豬肉風味肽的基因序列(PfP)。具體的序列見SEQ ID NO I與SEQ ID NO 2。設計的基因在兩端引入Bgl II與Xho I酶切位點，並在兩端引入GCGC保護鹼基(SEQ ID NO 3)後委託上海生物工程有限公司合成。實施例2重組質粒pICAS-pfp的構建將上述合成的基因序列與質粒pICAS進行雙酶切。體系為無菌(ΜΗ2013μ1、質粒pICAS 或 pfp 基因 3μ 1、10XM buffer 2μ1、Bgl II I μ1、Xho I μ I。將雙酶切後的 pfp基因與質粒進行體外的連接後用CaC12轉化法轉入Ε. coli ToplOF，在Amp+LB (50mg/ml)平板上塗板，過夜培養。提取 陽性轉化子委託上海生物工程有限公司進行測序。實施例3表達豬肉風味肽工程菌的構建培養將質粒pICAS-pfp線性化後按照以下方法轉化釀酒酵母分別在ΙΟΟμ I新製備酵母感受態細胞的Ep管中加入3 μ I Xba I線性化處理的pICAS、pICAS-celAL-CALB，再加入10 μ I變性處理的Herring Testes Carrier DNA(購自Takara公司)輕輕混勻。每管中加Λ 600 μ L PEG/LiAc溶液，輕輕振蕩混勻。30°C溫育30分鐘，每隔10分鐘輕搖振蕩一次，以混勻溶液。加入70 μ L DMSO，輕搖混勻。42°C熱激15min,每5min輕搖振蕩一次。熱激後在冰上放置15min。14, OOOrpm高速離心5min。棄去上清，用500 μ L TE溶液懸浮細胞。取200 μ L塗布於SD平板上培養3-4 天。利用目的基因的基因序列，提取SD平板上單克隆轉化子提取酵母基因組PCR鑑定總反應體積為20 μ L，酶量為2U，取2 μ LPCR產物進行O. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。實施例4豬肉風味調味品的製備在200g豬肉風味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入單甘酯乳化lOmin，即得具有豬肉風味的調味品。實施例5熱反應豬肉香精的製備取500g豬肉風味肽加入10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水調節pH值6. 5，在100°C加熱2h，除去上層奶油層即得豬肉熱反應香精。序列表
發明名稱一種豬肉風味肽及其生產方法與應用申請人廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司
SEQ ID NO:〗豬肉風味肽胺基酸序列
Gly-V al-Glu-Asn—Ala-V al-V al-Pro-Gln-Asn
SEQ ID N02豬肉風味肽核苷酸序列
GGT-GTT-GAA-AAT-GCT-GTT-GTT-CCA-CAA-AAT
SEQ ID N0:3 GCGC保護鹼基
GCGC-GGT-GTT-GAA-AAT-GCT-GTT-GTT-CCA-CAA-AAT—GCGC
權利要求
1.一種豬肉風味肽，其胺基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.編碼權利要求1所述豬肉風味肽的核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.—種重組質粒，其特徵在於是將權利要求2所述豬肉風味肽基因連入釀酒酵母分泌表達載體PlCAS中，構成重組質粒。
4.一種重組菌株，其特徵在於是攜帶有權利要求3所述重組質粒質粒的菌株Escherichia coli Top 10/pICAS_PFPo
5.一種重組工程菌，其特徵在於由權利要求3所述重組質粒轉化釀酒酵母宿主菌釀酒酵母MT8-1後得到。
6.權利要求1所述豬肉風味肽的生產方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)將豬肉通過木瓜蛋白酶、複合蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種酶解獲得豬肉酶解物，通過Sephadex G_15凝膠柱分離不同肽類物質，並進行感官評價，然後利用MALD1-TOF-MS質譜分析鑑定感官評價6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明顯豬肉風味特徵的豬肉風味肽胺基酸序列； (2)利用釀酒酵母偏好密碼子設計與豬肉風味肽胺基酸序列相對應的核苷酸序列，通過￠-乙腈亞磷酸胺化學合成法，使用全自動合成儀合成； (3)為實現豬肉風味肽在釀酒酵母中分泌表達，採用PICAS質粒，在其基礎上引入GCGC保護鹼基(如SEQ ID NO :3所示)，合成的基因中引入Bgl II與Xho I酶切位點，把合成基因與PICAS質粒通過Bgl II與Xho I進行雙酶切，體外連接構建重組質粒pICAS-pfp ； (4)以LiCl法將XbaI線性化的質粒pICAS-p fp轉化釀酒酵母MT8-1，在SD平板上培養3-4天，挑取SD平板上的克隆轉化子，提取轉化子釀酒酵母基因組DNA作為模板，進行酵母重組基因組PCR鑑定，獲得重組轉化子； (5)將重組轉化子接種至ImLYH)培養基中培養24h後，轉接到50mlSDC培養基中培養72h離心收集上清液，對上清液進行抽濾，即得到具有強烈豬肉風味的豬肉風味肽； 其中，步驟(I)中所述感官評價的方法是將酶解產物水提物凝膠柱分離峰組分凍乾粉，按照0. 2mg/mL的質量濃度添加到純水中，請12名感官評定員進行評定，評定的定義是添加酶解產物純水的濃厚味強度為4分，並以八分標度法對樣品濃厚感強度進行標度檢驗，從而評定這酶解產物對豬肉風味的影響。每個評價樣品都隨機3位數編號後，打亂順序交給評價員進行滋味評定，同一個樣品每名評價員評價3次，取3次測定平均值為最終評價分數。
7.權利要求1所述豬肉風味肽在製備豬肉香精中的應用，其特徵在於200g的豬肉風味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入單甘酯乳化IOmin,即得具有豬肉風味的調味品。
8.權利要求1所述豬肉風味肽在製備豬肉風味調味料的應用，其特徵在於10%豬肉風味肽加入10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水調節pH值6. 5，在100°C加熱2h,除去上層奶油層即得豬肉熱反應香精。
全文摘要
本發明公開了一種豬肉風味肽及其生產方法與應用。本發明所述豬肉風味肽的胺基酸序列如SEQ ID NO1所示，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發明將豬肉風味肽基因經過密碼子優化，在釀酒酵母中高效分泌表達，得到的豬肉風味肽具有很強的豬肉風味，適合應用於調味品或香精領域。
文檔編號C12R1/19GK103044525SQ20121023568
公開日2013年4月17日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者江逢春, 雲帆, 許小博, 彭勇, 鍾健 申請人:廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司