毛竹苯丙氨酸解氨酶、其編碼基因及體外表達方法
2023-07-09 02:18:06 2
專利名稱：毛竹苯丙氨酸解氨酶、其編碼基因及體外表達方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種苯丙氨酸解氨酶、其編碼基因及應 用，本發明還涉及該酶的體外表達方法。
背景技術：
苯丙烷類代謝途徑是植物代謝中一條非常重要的途徑，一切含苯丙烷骨架的物質 都是由這一途徑直接或間接生成。苯丙烷類代謝可生成類黃酮、木質素等多種次生代謝產 物，這些次生產物在植物的生長發育、抗病、抗逆反應中起著重要的作用，而苯丙氨酸解氨 酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是連接植物初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙 烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脫 氨反應，使NH3釋放出來，形成反式-肉桂酸，在植物體內次生物質(如木質素等)代謝中 起著重要作用。近年來，越來越多的研究集中在苯丙氨酸代謝途徑關鍵酶方面，以期通過調節這 些酶的表達活性，來實現有效地調節與之相應的次級代謝產物的生物合成，培育出適合人 類生產生活需要的植物新品種，如適於造紙的低木質素含量樹種、高異黃酮含量的大豆品 種等。竹子作為我國重要的森林資源，由於竹材具有強度高、韌性好、硬度大等特點，在 建築、造紙、裝飾材料等領域得到廣泛的應用。毛竹(Phyllostachys edulis)是我國重要 的經濟竹種之一，以毛竹為材料進行PAL基因的研究，對於更好地開發利用毛竹資源具有 重要的現實意義。然而，竹子苯丙氨酸代謝途徑的研究尚屬空白。尚未有竹子苯丙氨酸解氨酶基因 體外表達的報導，竹子苯丙氨酸代謝途徑的分子基礎還不清楚。
發明內容
本發明的目的在於提供一種毛竹苯丙氨酸解氨酶、編碼該酶的基因及應用。本發明的另一個目的在於提供體外表達上述毛竹苯丙氨酸解氨酶的方法。本發明從毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆得到一種新的苯丙氨酸解氨酶基 因(現將該基因命名為PePAL)，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示，該基因全長為2 503bp, 分析表明，該序列包含一個完整的編碼區2 106bp,5'非翻譯區(UTR)95bp，3'非翻譯區 274bp和polyA尾巴^bp，GC含量為63. 16 %，編碼701個胺基酸組成的蛋白(苯丙氨酸 解氨酶)。由該基因編碼的苯丙氨酸解氨酶的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該蛋白的 分子量為75. 69KDa，等電點為6. 489，第41 450位為苯丙氨酸解氨酶保守域，在第185 201位為苯丙氨酸解氨酶-組氨酸酶(PAL-histidase)信號，具備苯丙氨酸解氨酶的特徵。 實驗表明由該基因編碼的苯丙氨酸解氨酶在30°C、pH值為8. 8的條件下具有較高的酶活。 為便於表述，將該苯丙氨酸解氨酶命名為PePAL。應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的苯丙氨酸解氨酶的胺基酸序列(SEQ ID No. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸，得到 所述蛋白的突變序列。例如在非活性區段，將第675位的L替換為I。因此，本發明苯丙氨 酸解氨酶還包括SEQ ID No. 2所示胺基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個胺基酸， 具有與PePAL同等活性的由PePAL衍生得到的蛋白質。本發明基因包括編碼所述蛋白的核 酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的簡併性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術 人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。因而，本發明苯丙氨酸解氨酶基因還 包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼 PePAL的核苷酸序列。在本發明實例中，所述基因通過如下方法克隆獲得從毛竹葉片中提取RNA，反轉 錄成cDNA，通過RT-PCR的方法先克隆到T-easy載體上，並對篩選出的陽性克隆子進行測序 克隆分析，發現插入片段與苯丙氨酸裂解酶基因家族的保守區有著較高的相似性。根據已 獲得保守區片斷的序列設計引物，進行5' -RACE和3' -RACE擴增，將PCR產物回收、連接 後轉化，在得到的大量克隆中，選取陽性克隆進行測序。通過測序並與保守區序列拼接，去 掉重疊部分，得到全長基因序列2 503bpo可將本發明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發明蛋白的重組表達 載體，進一步將該重組表達載體導入恰當的宿主細胞中，獲得表達本發明PePAL的基因工 程菌。本發明還提供PePAL的體外表達方法，其是通過培養上述基因工程菌，並誘導表 達，獲得PePAL。在本發明實例中，根據PePAL編碼區序列設計包含酶切位點的引物，通過RT-PCR 的方法先克隆到T-easy載體上，測序正確後將PePAL克隆到原核表達載體pGEX的多克隆 位點，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，進行誘導表達，優化條件，獲得具有活性的苯丙氨酸解氨 酶。實驗表明，PePAL能夠催化L-苯丙氨酸形成反式-肉桂酸。優選，經發酵培養菌液生長至OD6tltl為0. 6-0. 8時，加入IPTG至終濃度lmmol/L， 37°C培養4小時，收集菌體，裂解後離心取上清，用組氨酸結合樹脂純化獲得純化苯丙氨酸 解氨酶。在本發明實例中，待菌液生長至006(1(1為0. 6-0. 8時，加入IPTG (終濃度lmmol -L"1) 進行誘導培養。取誘導過的菌液250ml，5000rpm離心lOmin，收集細胞；加入9ml的 BugBuster溶液、9 μ 1的Benzonase核酸酶、9 μ 1的Lysozyme，重懸細胞，室溫下將細胞液 在搖板上孵育15min ；輕輕渦旋震蕩，裂解細胞；4°C下1200g離心20min，取上清液按照IDA HisBind樹脂純化方法準備樹脂柱(MERCK)；將製備好的抽提物小心加到樹脂柱的上方；分 別用10倍床體積的IX結合緩衝液、6倍床體積的IX漂洗緩衝液、6倍床體積的IX洗脫 緩衝液洗脫蛋白，獲得純化的蛋白溶液。本發明提供了一種新的苯丙氨酸解氨酶，其能夠催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂 酸，具有較高的酶活性，為催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸提供了一種新的可選擇途徑。 此外，本發明通過原核表達製備重組PePAL，克服了直接從竹子葉片中分離該蛋白的困難， 降低了成本。
圖1是保守區擴增及RACE產物電泳圖。圖2顯示的是原核表達載體pGEX-PePAL的質粒載體。圖3顯示的是單克隆菌落PCR電泳結果，其中1-4 單克隆菌落；5 重組表達載體 質粒；6 :pGEX質粒；7 :BL21菌液；8 水；M =Ikb分子量標記。圖 4 顯示的是不同 IPTG(終濃度 0. 5mmol · L^1Ummol · Λ · 5mmol · L-1)誘導的 PePAL重組蛋白的電泳圖，其中1，3，5 上清；2，4，6 沉澱。圖5顯示的是基於G-250的BSA標準曲線。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明 的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1、毛竹色素結合蛋白基因PePAL序列的獲得以毛竹(Phyllostachys edulis)幼嫩新鮮葉片為材料，提取RNA，並反轉錄成 cDNA作為模板，根據公布的禾本科植物色素結合蛋白基因PAL家族的保守序列設計引物， PCR擴增編碼區序列。上遊引物5『 -TGTCGACCAGCGTCAACGG-3 『下遊引物5『 -ACTCTTCGTCGTCGTCGCTGAC-3 『對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶純化回收，將回收的DNA 片段連接到pGEM-T easy載體上，轉化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5a感受態細胞，經 藍白斑篩選，提取陽性克隆質粒並酶切圖譜分析後，再將單克隆測序，插入片段位1 062bp， 編碼340個胺基酸。應用Blast在線軟體，將測序的序列與已報導的基因進行同源比較，發 現插入片段與苯丙氨酸裂解酶基因家族的保守區有著較高的一致性，其中與水稻的一致性 達 95. 9%o根據已獲得保守區片斷的序列設計5' -RACE弓丨物PAL5-1 5' -ATCTCGTTGACCTTCTTGGCGTGGCTC-3『；3' -RACE 引物PAL3-1 5' -GCTCCAGTTCCTTGCCAACCCGATCAC-3『PAL3-2 5' -CGTGTTCAGCTACGCCGACGACCCG-3『引物PAL5-1和UPM的產物在1 IOObp左右有一條亮帶，而引物PAL3-1和UPM的 產物電泳呈現彌散狀態，沒有特異性條帶。將物PAL3-1和UPM的PCR產物稀釋50倍作為 模板，用引物PAL3-2與NUP配對進行擴增，電泳結果顯示在SOObp左右有一條亮帶(圖1)。 將PCR產物回收、連接後轉化，在得到的大量克隆中，選取陽性克隆進行測序。通過測序並 於保守區序列拼接，去掉重疊部分，得到脫氧核糖核苷酸序列全長為2 5(X3bp，包含一個完 整的編碼區2 106bp,5'非翻譯區(UTR) 95bp, 3'非翻譯區274bp和polyA尾巴^bp。通過blast軟體在線比較分析，發現PePAL編碼的胺基酸序列與其它單子葉 植物的PAL具有較高的一致性，尤其與同是來自禾本科的水稻(Oryza sativa L.)、玉
5(Zea mays L. ) > (Saccharumofficinarum L· )、zj、 弗月土tt (Bambusa ventricosa McClure)、綠竹(Bambusa οldhamii Munro)禾口小麥(Triticum aestivum L.)的 PAL 的一 致性都在75%以上，其中與水稻的PAL(P14717)的一致性最高，達94. 4%，與來自毛竹的 LLBl (ABP96954)和 PePALl (FJ195650)的一致性為 76. 7%禾口 98. 1%0 由此可見，克隆出的 PePAL基因為一全新的苯丙氨酸解氨酶基因。實施例2攜帶毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的重組表達載體的構建以毛竹cDNA為模板，根據序列1設計引物，PCR擴增毛竹苯丙氨酸解氨酶基因編碼 區的脫氧核糖核苷酸序列。引物兩端分別引入EcoR I和Not I酶切位點，引物序列如下上遊5'-ACGAATTCATGGCGGGCAACGGGCTC-3『，引入 EcoR I 酶切位點下遊5'-ATTGCGGCCGCTTAGTTGATGGGCAGGGG-3'，引入 Not I 酶切位點對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶純化回收，將回收的DNA 片段連接到pGEM-T easy載體上，轉化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5a感受態細胞，經 藍白斑篩選，提取陽性克隆質粒並酶切圖譜分析後，再將單克隆測序，得到含有EcoR I和 NotI酶切位點及編碼毛竹苯丙氨酸解氨酶的脫氧核糖核苷酸序列的質粒pT-PePAL。將質粒pT-PePAL和改造過的質粒pGEX (在GST前添加了 His標籤)37°C條件下分 別用雙酶切Mir，酶切產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收，用T4DNA連接酶4°C連 接過夜。連接產物轉化DH5a感受態細胞，挑取Amp抗性平板上長出的單克隆，提取質粒， 進行PCR鑑定和酶切圖譜鑑定。將獲得的重組表達載體命名為pGEX-PePAL，重組表達載體 pGEX-PePAL圖如圖2所示。實施例3重組表達載體轉化宿主、陽性克隆鑑定將實施2中構建的重組表達載體pGEX-PePAL轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細 胞，挑取Amp抗性平板上長出的單菌落進行PCR鑑定。以PePAL基因重組表達載體的單克 隆菌落為模板，用實施例2中引物進行PCR檢測，同時以重組質粒、BL21 (DE3)和水為對照。 菌落PCR產物的電泳結果(圖3)表明，單克隆菌落含有目的基因片段，可用於蛋白的誘導 表達實驗。實施例4PePAL基因的原核表達將實施3中鑑定正確的克隆培養過夜，再將細菌100倍稀釋於含氨苄青黴素 (IOOmg · Γ1)的LB培養基中培養，待菌液生長至OD6tltl為0. 6-0. 8時，加入IPTG(終濃度 分別為0. 5mmol · lAlmmol · Λ · 5mmol · L-1)進行誘導培養。取誘導過的菌液250ml, 5000rpm離心lOmin，收集細胞；加入9ml的BugBuster溶液、9 μ 1的Benzonase核酸酶、 9μ 1的Lysozyme，重懸細胞，室溫下將細胞液在搖板上孵育15min ；輕輕渦旋震蕩，裂解細 胞；4°C下1 200g離心20min，取上清入另一個新管中；沉澱用上樣緩衝液溶解後，進行蛋白 電泳分析。蛋白電泳結果(圖4)表明，表達蛋白的分子量約為103KDa(包括His -Tag.GST 與目的蛋白)。實例5PePAL基因原核表達產物的純化及其活性檢測取實例4中獲得的上清溶液，按照IDA HisBind樹脂純化方法準備樹脂柱 (MERCK)；將製備好的抽提物小心加到樹脂柱的上方；分別用10倍床體積的IX結合緩衝 液、6倍床體積的IX漂洗緩衝液、6倍床體積的IX洗脫緩衝液洗脫蛋白，獲得純化的蛋白 溶液。
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按表1中所示反應體系加入各組分，30°C溫育，振蕩反應30min，然後分別加入 200 μ 1 HCl (6mol -L-1)終止反應。測定278nm吸光度值，OD值每變化0. 01為一個酶活單 位(相當於Iml反應混合物中形成Iyg肉桂酸)。蛋白質量用考馬斯亮藍(G-250)法進 行測定。考馬斯亮藍G-250是一種染料，在游離狀態下呈紅色，當它與蛋白質結合後變為青 色。蛋白質含量在0-1000 yg範圍內，蛋白質-色素結合物在595nm下的吸光度與蛋白質 含量成正比，用比色法建立標準蛋白BSA的標準曲線(圖5)。表1 PePAL活性檢測
權利要求
1.毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL，其胺基酸序列為a)SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列；b)SEQID No. 2所示的胺基酸序列經替換、缺失、或添加一個或幾個胺基酸殘基形成的 具有同等功能的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述苯丙氨酸解氨酶PePAL的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體。
5.如權利要求4所述的重組載體，其為pGEX-PePAL。
6.權利要求4或5所述重組載體轉化的宿主細胞。
7.如權利要求6所述的宿主細胞，其為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.—種體外表達毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL的方法，其通過培養權利要求6或7所述 的宿主細胞，誘導PePAL表達。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述宿主細胞為轉化pGEX-PePAL重組載 體的大腸桿菌BL21 (DE3)，經發酵培養菌液生長至OD6tltl為0. 6-0. 8時，加入IPTG至終濃度 lmmol/L，37°C培養4小時，收集菌體，裂解後離心取上清，用組氨酸結合樹脂純化獲得純化 苯丙氨酸解氨酶。
10.權利要求1所述的毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL在催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸 中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL，其胺基酸序列如SEQ ID No.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL能夠催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸，具有較高的酶活性，為催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸提供了一種新的可選擇途徑。此外，本發明通過原核表達製備重組PePAL，克服了直接從竹子葉片中分離該蛋白的困難，降低了成本。
文檔編號C12P7/40GK102102096SQ20091026120
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月17日 優先權日2009年12月17日
發明者彭鎮華, 李雪平, 鄭波, 高志民 申請人:國際竹藤網絡中心