連作黃瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有機肥料的製作方法

2023-07-08 12:31:26 2

專利名稱：：連作黃瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有機肥料的製作方法
技術領域：
：本發明涉及連作黃瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其製成的微生物有機肥料，屬於農業集約化生產
技術領域：
，專用於克服和消除連作黃瓜、西瓜枯萎病問題。二
背景技術：
：黃瓜和西瓜是我國重要的經濟作物，其產量高低和質量的優劣關係著國計民生。黃瓜、西瓜枯萎病是黃瓜和西瓜的主要病害之一，尤其在保護地種植中危害嚴重。黃瓜的枯萎病於1943年首次在荷蘭報導，在1949年曾經使美國弗羅裡達州黃瓜損失40%以上，連作的第三個季節植株的感染率達到70%以上。目前，在我國高度集約化的黃瓜、西瓜產地，枯萎病發病嚴重時產量損失90%左右。黃瓜、西瓜枯萎病是一種土傳性真菌病害，該病廣泛分布於全世界的熱帶、亞熱帶和一些溫暖的地區。黃瓜、西瓜枯萎病致病菌一鐮刀菌(Fusariumoxysporum)能通過土壤、流水(灌溉等)、種子等方式傳播，對環境有很強的適應能力。鐮刀菌侵染化黃瓜，會造成黃瓜出土前或者出土後的猝倒病，頂端的莖蔓萎蔫，植株的莖基部維管束壞死，然後整株枯萎。鐮刀菌會導致西瓜苗期的猝倒、皮層的腐化和植株矮化，會導致較老的植株的突然或者逐漸的萎蔫。在高溫高溼的條件下，病害發展迅速，發病嚴重的田塊發病率達100%，造成絕收。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規模化養殖後的畜禽糞便隨地棄置等不僅嚴重汙染了環境，也極大地浪費了能作為有機肥和生物有機肥產品的原料；大量的養分資源(C、N、P、K、S及微量元素)流失於土壤-植物系統之外，明顯地削弱了我國農業可持續發展的能力。如何將從土壤中因收穫作物取走的營養元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機廢棄物製成商品有機肥，再施入土壤。如果將這些固體有機廢棄物經過高溫發酵合成高品位的有機堆肥，再用於功能菌的載體，所製成的微生物有機肥料功能明確，將會有很好的應用前景。三
發明內容1.技術問題本發明的目的在於研製一種能防除黃瓜、西瓜枯萎病的拮抗微生物有機肥料，大田防治效率達到80%以上，使連作障礙土壤得到生物修復，確保集約化農業的順利發展。2.技術方案用於防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株，該菌株SQR-T037屬於哈茨木黴(Trichodermaharzia皿m)，2009年9月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNo.3308，主要生物學特性為在PDA培養基上最佳的生長溫度是30°C，培養時間為96個小時的時候，菌落直徑可達90mm，布滿整個平皿，在培養基中產生黃色的色素。分生孢子梗呈瓶狀，對生，分生孢子橢圓型，長2.3-3.5i！m，寬2.0-3.2ym，表面光滑，孢子的顏色開始的時候是黃綠色，然後慢慢的變成深綠色。用上述生物防治菌株所生產的防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥料，該肥料中生物防治菌株SQR-T037菌落形成單位1X108個/g以上、全氮質量比含量為45%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分質量比為610%、有機質質量比含量為3035%。所述防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥料的生產方法，包括1)將SQR-T037接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為發酵初始pH範圍為6.5-7.2，培養溫度為25-30°C，溶氧通氣量範圍為30100%，170轉/分鐘，發酵時間為48小時，發酵後期將菌絲球全部打碎成該菌株的菌落形成單位，發酵液中SQR-T037菌株的菌落形成單位^1X109個/mL;所用PDA培養液配製方法為(以配置1L培養基為例)用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，經過濾後濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000mL，pH值調至6.5_7.0，121。C滅菌20min。2)將SQR-T037發酵液按50L/噸的量分別接種到腐熟的畜禽糞便堆肥和菜粕微生物酶解混合物中進行固體發酵，發酵溫度為30-5(TC，發酵中每天翻堆1次，發酵5-7天後結束，使該菌株的菌落形成單位含量達到1X108個/g以上，獲得生物防治菌株SQR-T037的固體菌劑；所用腐熟後的畜禽糞便堆肥為發芽指數98%以上，有機質含量>35%，有機氮含量為1.2-2%，含水量25-30%。3)將畜禽糞便堆肥的SQR-T037固體菌劑按體積比50_80%與菜粕微生物酶解混合物的SQR-T037固體菌劑按體積比20-50%的比例充分混合，後熟2_3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過5(TC的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥料。所述微生物有機肥料可專用於防除連作黃瓜、西瓜枯萎病。3.有益效果本發明一種能克服或消除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥料及其生產方法，利用畜禽糞便堆肥和菜粕的微生物酶解胺基酸混合物，再與生物防治菌株液混合後製成微生物有機肥料，其產品與目前市場上的產品相比具有如下優點1)該肥料產品中含有抑制黃瓜、西瓜枯萎病病原真菌生長的高效菌株(哈茨木黴)，其抑制效果非常顯著。試驗結果表明，在連作黃瓜、西瓜枯萎病的土壤上施用本產品後，黃瓜、西瓜枯萎病大田生物防治率達85%以上，連續三年施用本肥料的土壤，枯萎病的生物防治率更高。2)該肥料為生物有機肥，含有豐富的有機質(含量30_35%)，有機氮含量為3-5%。本產品總磷含量為2-4%，而且生物有效性特別高，使用本產品後能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤後生物有效性較差。生物有機肥料中含有的豐富營養也為其中的生物防治菌株提供了生長繁殖的條件，使在土壤中存活下來並形成優勢群，從而發揮防病作用。3)由於是生物菌株製劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利於黃瓜和西瓜的無公害生產，農民可以不用或減少其他防治枯萎病化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利於農產品的質量。同時，該微生物肥料還有增產功能，可為農民增加收入。四圖1:生物防治菌株SQR-T037的抑制黃瓜、西瓜枯萎病病原菌的效果ASQR-T037抑制黃瓜枯萎病病原菌的效果圖BSQR-T037抑制西瓜枯萎病病原菌的效果圖圖2:溫室盆栽試驗防治效果ASQR-T037製成的生物有機肥抑制黃瓜枯萎病效果:對照；CK2:黃瓜連作土壤；1\:CK2+有機肥；T2:CK2+木黴SQR-T037的發酵液；T3:CK2+木黴SQR-T037的混合有機肥；T4:CK2+木黴SQR-T037發酵的有機肥BSQR-T037製成的生物有機肥抑制西瓜枯萎病效果:對照；CK2:西瓜連作土壤；1\:0(2+有機肥；T2:0(2+木黴SQR-T037發酵有機肥五具體實施例方式(—)菌株的分離和鑑定採集已經發生連作障礙並出現嚴重枯萎病病症的植株和周圍土壤，樣品低溫保存，採用鐮刀菌的選擇行培養基分離病原菌——尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumeri皿m)禾口尖抱嫌刀菌西瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)。然後以分離到的枯萎病病原菌為指示菌，從來自於經過高溫堆置的有機堆肥中，採用木黴的選擇性培養基分離生物防治菌株。再通過盆栽試驗和大田試驗最終復篩出高效生物防治菌株SQR-T037,鑑定到種，菌種於PDA培養基4。C保存和室溫保存。生物防治菌株SQR-T037能夠在72小時完全抑制病原菌的生長(圖1)。菌株SQR-T037屬於哈茨木黴(Trichodermaharzia皿m)，主要生物學特性為在PDA培養基上最佳的生長溫度是3(TC，培養時間為96個小時的時候，菌落直徑可達90mm，布滿整個平皿，在培養基中產生黃色的色素。分生孢子梗呈瓶狀，對生，分生孢子橢圓型，長2.3-3.5ym，寬2.0-3.2ym，表面光滑，孢子的顏色開始的時候是黃綠色，然後慢慢的變成深綠色。(二)菌劑生產1)將SQR-T037接種到PDA培養液中，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為初始pH範圍為6.5-7.O，培養溫度25t:，溶氧通氣量範圍體積比為30100%，170轉/分鐘，發酵時間為48小時，發酵後期將菌絲球全部打碎成該菌株的菌落形成單位，發酵液中SQR-T037菌株的菌落形成單位(菌絲片段)>1X109個/mL;所用PDA培養液配製方法為(以配製1L培養基為例)用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，用紗布過濾後，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至6.5-7.0，121。C滅菌20min。2)將生物防治菌株SQR-T037發酵液按50L/噸的接種量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕的微生物酶解混合物進行固體發酵，發酵過程中每天翻堆1次，使固體發酵溫度30-50°C，發酵5-7天後結束，使生物防治菌株的菌落形成單位含量達到1X108個/g以上，獲得生物防治菌株SQR-T037固體菌劑。所用腐熟後的豬糞堆肥為發芽指數98%以上，有機質含量^35%，有機氮含量為1.2-2%，含水量25-30%。其中菜粕的微生物酶解混合物製備方法為(公知公用，見發明專利5ZL200610086126.0，一種農用胺基酸的生物製取方法及其肥料產品)，將嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)菌株37-1發酵液加入到菜粕原料中，調節含水量55-65%和p朋.0-7.5，進行開放式固體發酵，待發酵溫度上升至5(TC時立即開始翻堆，以後每天翻堆，使堆溫始終維持在35-5(TC約5-7天，固體發酵開始後，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節含水量和pH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.O，發酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物pH調整為5.0左右，再進行低溫乾燥或自然涼幹，即為菜粕的微生物酶解混合物(含胺基酸的混合材料)。3)將豬糞堆肥的SQR-T037固體菌劑按體積比80%與菜粕微生物酶解混合物的SQR-T037固體菌劑按體積比20%充分混合，後熟2_3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過5(TC的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，獲得防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥。上述所生產的SQR-T037經過再次發酵的微生物有機肥(防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥料)中生物防治菌株SQR-T037的菌落形成單位1X108個/g以上、全氮質量比含量為45%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分質量比為610%、有機質質量比含量為3035%。(三)溫室盆栽試驗1.連作黃瓜土壤的枯萎病防治試驗土壤為連作土壤，枯萎病發病嚴重。黃瓜品種採用種植面積較大的黃瓜品種"津春4號"。處理如下:對照;CK2:黃瓜連作土壤；1\:CK2+有機肥；T2:CK2+SQR_T037的發酵液；T3:CK2+SQR-T037與有機肥簡單混合微生物有機肥；T4:CK2+SQR_T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥每處理採用5個重複，10kg病土/盆，T2每盆施10mlSQR-T037的發酵液，T3施用20gSQR-T037混合的微生物有機肥料(10mlSQR-T037的發酵液與20g有機肥簡單混合)，T4施用20gSQR-T037發酵的微生物有機肥，攪拌混合均勻，使生物防治菌株在土壤中的濃度達到105cfu/g幹土。黃瓜苗移栽後5天開始記錄發病情況，40天後，0(2發病率達98.9%，而接種SQR-T037發酵液、SQR-T037混合微生物有機肥或者SQR-T037再次發酵的微生物有機肥的都能有效降低枯萎病的發病率，其中T4:CK2+SQR-T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥表現出最好的防治效果(表1，圖2A)，發病率為7.3%。2.連作西瓜土壤的枯萎病防治。試驗土壤為連作土壤，枯萎病發病嚴重。處理如下:對照；CK2:西瓜連作土壤；1\:CK2+有機肥；T2:CK2+SQR_T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥；每處理採用10個重複，每重複300g病土/杯，1\每杯施用3g普通有機肥，T2施用3gSQR-T037再次發酵的有機肥，攪拌混合均勻，SQR-T037在土壤中的濃度為105cfu/g幹土。西瓜苗移栽後5天開始記錄發病情況，21天後，0(2發病率達95.38%，而丁2:CK2+SQR-T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥能有效降低枯萎病的發病率，將其控制在2.60%(表2，圖2B)。結果表明，生物防治菌株SQR-T037的施入，不但可以起到防治黃瓜、西瓜枯萎病，大大減少土壤中枯萎病原菌(F.oxysporum)數量的作用，促進黃瓜、西瓜根際微生物群落的變化，有益細菌群落顯著增加，真菌總體數量及病原菌數量顯著減少(表3)，還能使黃瓜、西瓜的葉綠素含量、根系活力和乾物量顯著增加(表1、表2)。施入生物防治菌株後，黃瓜和西瓜的系統抗病性相關酶的酶活顯著提高(表4)。(四)田間試驗2008年在江蘇省宜興市黃瓜枯萎病發病的大田施用SQR-T037有機肥。大田試驗處理1、施用有機肥；2、施用SQR-T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥。將枯萎病發病嚴重的一塊田以隨機的方式劃分成8個小區，每個處理隨機選取四個小區。黃瓜品種為"津春4號"，肥料都採用穴施，生物有機肥施入量為30kg/畝。定期到田間採集數據，統計發病率和微生物區系，最後採收後計算其不同處理間生物量的差異。施入SQR-T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥可以顯著地減少枯萎病害的發生，降低發病率33.1%，黃瓜產量增加1.3倍(表5)。2007年在河南通許西瓜枯萎病發病嚴重的大田施用微生物有機肥。大田試驗處理1、施用有機肥；2、施用SQR-T037與有機肥經過再次發酵形成的微生物有機肥。選擇枯萎病發病嚴重的田塊，將田塊以隨機的方式劃分成8個小區，每個處理隨機選取四個小區。西瓜品種為8424，肥料都採用穴施，生物有機肥施入量按30kg/畝田。定期到田間採集數據，統計發病率、病情指數和微生物區系，最後採收後計算其不同處理間生物量的差異。施入SQR-T037發酵的生物有機肥可以顯著地減少枯萎病害的發生，與當地習慣施肥相比(非嫁接苗)，發病率減少20-40%，防治率達95%以上，西瓜畝產增加1200斤以上(表5)。本發明專利從微生物區系這一關鍵問題著手，研製出一種能顯著消除連作黃瓜、西瓜枯萎病發生的微生物有機肥料產品，防治率達85%以上(大田試驗)。本肥料產品的作用機制在於本肥料產品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源給連作障礙土壤有益微生物區系的培育提供了很好的條件，使之迅速恢復和建立外源有益功能菌微生物的生態及其食物鏈；另一方面，本肥料產品中含有較高含量的有機氮和有機磷，這些營養物質對連作障礙土壤中作物的生長十分有利，大大提高了黃瓜、西瓜等作物的立苗率和抗逆能力。表1不同盆栽處理黃瓜葉片葉綠素含量、根系活力和植株的乾重處理髮病率(％)葉綠素含量(SPAD)根系活力(mgTTCg—V0植株乾重(g)CK1035.27±1.520.24±0.0426.87±3.06CK298.927.93±0.690.11±0.0212.77±5.77Tl93.330.07±1.170.14±0.0416.70±3.06T225.635.27±3.000.33±0.0430.86±0.657tableseeoriginaldocumentpage8注枯萎病發病率統計按照國際通行規則0，植株健康；1，植株<10%部分萎蔫2，植株11-20%萎蔫；3，植株21-50%萎蔫；4，植株50-100%萎蔫；5，植株死亡。計算公式啦法茲E(等級x植株數量〉y薩發病率=總植株數量x最高等級X10眺表3不同盆栽處理黃瓜根表微生物的含量差異tableseeoriginaldocumentpage8表4不同處理間根部抗病性相關酶的活力的變化tableseeoriginaldocumentpage9表5大田試驗效果tableseeoriginaldocumentpage9權利要求一種連作黃瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株，該菌株SQR-T037屬於哈茨木黴(Trichodermaharzianum)，2009年9月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNo.3308，主要生物學特性為在PDA培養基上最佳的生長溫度是30℃，培養時間為96個小時的時候，菌落直徑可達90mm，布滿整個平皿，在培養基中產生黃色的色素；分生孢子梗呈瓶狀，對生，分生孢子橢圓型，長2.3-3.5μm，寬2.0-3.2μm，表面光滑，孢子的顏色開始的時候是黃綠色，然後慢慢的變成深綠色。2.用權利要求1所述生物防治菌株所生產的微生物有機肥料。3.根據權利要求2所述的微生物有機肥料，其特徵在於該肥料中分別含有1X108個/g以上的生物防治菌株SQR-T037的菌落形成單位、全氮質量比含量為45%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分質量比為610%、有機質質量比含量為3035%。4.權利要求2或3所述微生物有機肥料的生產方法，包括1)將權利要求1所述的菌株SQR-T037接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為初始pH範圍為6.5-7.2，培養溫度25-3(TC，溶氧通氣量體積比範圍為30100%，170轉/分鐘，發酵時間為48小時，發酵後期將菌絲球全部打碎成該菌株的菌落形成單位，發酵液中該菌株的菌落形成單位^1X109個/mL;2)將SQR-T037發酵液按50L/噸的接種量分別接種到腐熟的畜禽糞便堆肥、菜粕微生物酶解混合物中進行固體發酵，發酵溫度為30-5(TC，發酵過程中每天翻堆1次，發酵5-7天後結束，獲得生物防治菌株SQR-T037的固體菌劑，其中該菌株的菌落形成單位含量達到lXl。8個/g以上;3)將畜禽糞便堆肥的SQR-T037固體菌劑按體積比50-80%與菜粕微生物酶解混合物的SQR-T037固體菌劑按體積比20-50%的比例充分混合，後熟2_3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過5(TC的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作黃瓜、西瓜枯萎病的微生物有機肥料。5.根據權利要求4所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟(1)所用PDA培養液配製方法為，以配製1L培養基為例用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，經過濾後濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7.2-7.4，121。C滅菌20min。6.根據權利要求4或5所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟(2)所用腐熟後的畜禽糞便堆肥為發芽指數98%以上，有機質質量比含量>35%，有機氮質量比含量為1.2-2%，含水量質量比25-30%。7.權利要求2或3所述微生物有機肥料的應用。全文摘要本發明涉及連作黃瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有機肥料，屬於農業集約化生產技術。本發明分離到了對黃瓜、西瓜枯萎病有顯著生物防治作用的木黴(Trichodermaharzianum)SQR-T037，利用該生物防治菌株與有機堆肥製成微生物有機肥料，肥料中含有1×108個/g以上該菌株的菌落形成單位、全氮含量為3～5％(90％以上為有機氮)，總氮磷鉀養分為6～10％、有機質含量為30～35％。試驗表明，這種微生物有機肥料施入土壤後能夠使生物防治菌株迅速繁殖，在土壤中形成優勢群，在黃瓜、西瓜枯萎病發生嚴重土壤中枯萎病生物防治率達85％以上。在還沒有形成連作障礙的土壤上長期施用本微生物有機肥料對黃瓜、西瓜枯萎病防治率達80％以上。文檔編號C12N1/14GK101696390SQ20091023357公開日2010年4月21日申請日期2009年10月29日優先權日2009年10月29日發明者冉煒,徐陽春,楊興明,沈其榮,沈標,陳立華,黃啟為申請人:南京農業大學;被以下專利引用(1),