利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法

2023-05-22 17:26:21 1

專利名稱：利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法
技術領域：
本發明屬於高強微生物砂漿製備領域，具體涉及利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法。
背景技術：
灌漿法是加固砌體結構，特別是歷史久遠的文物建築結構加固常用的方法，而石灰、水泥和環氧樹脂是三種常用的灌漿材料。其中石灰基灌漿材料作為傳統砌體結構的勾縫材料，其與被加固結構的兼容性最好，但是由於石灰基灌漿材料的硬化時間長，硬化後強度較低，所以也無法起到很好的加固效果。對於普通的水泥基灌漿材料，由於需要保證灌漿密實，需要儘可能提高灌漿料的流動性，所以漿液中砂的含量往往遠低於普通砌築砂漿，這使得硬化過程不可避免地會產生收縮開裂現象。同時，水泥基灌漿材料硬化後其剛度、強度與被加固結構往往不匹配，容易產生未加固區域的二次破壞。再者，水泥基灌漿材料的高鹼性也會使原始砌體結構產生更容易產生酥鹼破壞。以上種種不足使水泥基灌漿材料加固砌體結構的使用受到限制。而環氧樹脂等有機膠，雖然有出色的力學性能和較高可灌性，但是由於有機材料應力、應變性能和導熱係數等基本材料性質都與原結構相差較大，同時加固後材料體本身透水、透氣性較低，而且有機材料容易老化，正如威尼斯條約裡所陳述的觀點一樣:現代化學材料不屬於珍貴的歷史建築，環氧樹脂等有機材料不適用於大規模的砌體結構加固。

發明內容
為了解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法，採用本發明的微生物砂漿，可以在1-2個星期內到達需要的強度，同時結構延性較好，透水、透氣性保持較高。為了達到上述目的
產脲酶微生物:圓孢芽孢八疊球菌Sporosarcina antarctica UR53、韓國芽孢八疊球菌 Sporosarcina koreensis UR47、芽抱八疊球菌 Sporosarcina sp.UR31 以及延緩芽孢桿菌Bacillus lentus UR41已於2012年3月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC N0.5916、CGMCC N0.5915、CGMCC N0.5913、CGMCC N0.5914，該保藏中心簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。所述的產服酶微生物:Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcinakoreensis UR47>Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacillus lentus UR41 均呈捕圓杆狀，有芽孢，無莢膜，革蘭氏陽性。在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸銨10g/L平板上，菌落呈圓形，表面溼潤光滑，邊緣整齊，菌落大小為1_2_，菌落呈淡黃色，該菌在4°C _37°C的培養基溫度及PH7-9.5的範圍下均能生長。利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法，包括如下步驟:
步驟1:將微生物 Sporosarcina pasteuri1、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcinakoreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41單個菌落分別在25°C _37°C條件下在發酵培養基中發酵培養12-60小時得到六種菌液；步驟2:對結構空鼓進行閉水處理，灌入粒徑為300-450微米粒徑的砂粒，封閉整個空腔，預留進出漿口 ；步驟3:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L菌液的速度把步驟I所得六種菌液由進漿口灌入空鼓，直至出漿口流出呈黃色的菌液；步驟4:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化鈣固定液，所需體積為空腔體積的1/10 ；步驟5:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入4L反應溶液的速度灌入等摩爾濃度的尿素和氯化鈣混合溶液48h,反應液濃度為0.5-lmol/L ；步驟6:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化鈣固定液，所需體積為空腔體積的1/10 ；步驟7:重複步驟3至步驟6過程1-5個循環。步驟I所述微生物Sporosarcina pasteurii來自於美國模式培養物集存庫(American type culture collection),編號為 ATCC 11859 ;所述微生物 Terrabactertumescens來自於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,編號為AS.1.2690。步驟I所述發 酵培養基包括酵母提取物20g/L，硫酸銨10g/L，pH為9。本發明和現有技術相比，具有如下優點:1、從已有產脲酶菌株、土樣和水樣中篩選產脲酶的微生物，並對未知細菌進行分子鑑定，為獲得產脲酶能力強，原位保持脲酶活性高微生物菌株提供候選資源；2、反應溶液中尿素在先期灌入的微生物所產生的脲酶的作用下，分解為銨根和二氧化碳，同時使細菌周圍PH升高，促使生成碳酸鈣沉澱，膠凝空鼓中填充的砂粒，形成整體強度，隨著灌漿循環次數的增加，砂粒體系內的碳酸鈣含量增加，強度隨之增加，並且強度是可以控制的；3、經過微生物灌漿加固後的結構空鼓內形成的人工砂巖材料力學性能優於水泥基材料:劈裂抗拉強度較同等強度水泥石灰材料高，剛度和水泥石灰混合砂漿相近，但遠小於混凝土的剛度，耐受疲勞荷載和循環荷載能力高於水泥基材料；人工砂巖為無機材料，不會像環氧樹脂等有機材料一樣容易老化；3、所用的營養液的成本低；4、本發明中所利用微生物為自然環境(土壤)中本身存在的微生物或其中某種微生物的培養物，營養物質也為天然物質，不會對環境造成二次汙染。


圖1為依據16S rDNA序列構建的產脲酶菌株系統發育樹。圖2為培養菌株的生物量(用OD6tltl值表示)及脲酶活性，橫坐標為不同種類的產脲酶菌株，縱坐標為生物量及脲酶活性。圖3為微生物灌漿裝置示意圖。
圖4為材料幹密度與單軸抗壓強度、劈裂抗拉強度的關係圖。
圖5為單軸抗壓應力應變全曲線。
圖6為微生物砂漿在重複荷載下的應力-應變關係、破壞形態示意圖，其中圖6a和6b達到峰值前分別進過了 12和10個周期，圖6c則是8個周期。
圖7為微生物砂漿壓汞實驗結果示意圖。
圖8為微生物砂漿形成的膠凝體系樣品SEM掃描圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明。實施例:產脲酶具有誘導生成人工砂巖能力菌株的分離篩選1、樣品採集Sporosarcina pasteurii 來自於美國模式培養物集存庫(American typeculture collection),編號為 ATCCl 1859, Terrabacter tumescens來自於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為AS.1.2690。2、產脲酶菌株的分離和篩選產脲酶菌株分離自清華大學花圃採集土壤樣品。細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產生大量的氨，使培養基呈鹼性，顯紅色。本實驗利用這一特性，將試驗樣品先在37° C、5M高濃度尿素條件下富集培養24h後，殺死不能耐受和利用高濃度尿素的各種微生物營養體細胞，再將處理後的培養液進行梯度稀釋，塗布脲酶篩選培養平板，37° C下培養，挑取使培養基顏色變紅的菌株，劃線分離單菌落，獲得的微生物為產脲酶微生物，並利用16S rDNA方法進行鑑定，分別命名為Sporosarcina antarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47，Sporosarcina sp.UR31,Bacilluslentus UR41 ;參照圖1，圖1為依據16S rDNA序列構建的產脲酶菌株系統發育樹。利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法，包括如下步驟:步驟1:配製發酵培養基:酵母提取物20g/L，硫酸銨10g/L，pH為7-9.5，將IOOml發酵培養基裝入500ml培養瓶中滅菌,分別從平板中挑取單個菌落Sporosarcinapasteuri1、 Terrabactertumescens> Sporosarcina antarctica UR53、 SporosarcinakoreensisUR47>Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacillus lentus UR41 分別接種於發酵培養基中，在30°C溫度下培養，轉速為150rpm-250rpm。培養16小時後收集菌液，檢測六種菌液的生物量(用OD6tltl值表示)和脲酶活性，檢測結果如圖2所示；步驟2:對結構空鼓進行閉水處理，灌入粒徑為300-450微米粒徑的砂粒，封閉整個空腔，預留進出漿口，如圖3所示:；步驟3:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L菌液的速度把步驟I所得六種菌液從進漿口:灌入空鼓，直至從出漿口流出黃色的菌液；步驟4:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化鈣固定液，所需體積為空腔體積的1/10:；步驟5:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入4L反應溶液的速度灌入等摩爾濃度尿素和氯化鈣混合溶液48h，反應液濃度根據不同強度等級選擇0.5-lmol/L不等:；
步驟6:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化鈣固定液，所需體積為空腔體積的1/10 ；步驟7:根據加固強度等級要求不同，重複步驟3至步驟6過程1-5個循環。微生物加固強度等級利用灌漿循環次數和營養鹽濃度，控制生成微生物砂漿的強度從單軸抗壓強度2MPa到55MPa不等，如圖4所示。對所形成微生物砂漿的分析1、力學性能分析對這些試樣進行單軸抗壓測試和劈裂抗拉測試。正如水泥砂漿強度和其水灰比密切相關一樣，微生物灌漿形成材料的強度與體系內碳酸鈣的含量有關，我們在灌漿開始前準備的砂巖，其初始密度是相同的，所以用灌漿結束後的去除其中可溶物烘乾的幹密度值，可以表示各樣品的碳酸鈣含量，其與單軸抗壓強度和劈裂抗拉的關係如圖4所示。可以看至IJ，材料的單軸抗壓強度和劈裂抗拉強度都是隨其幹密度提高而增大，而其幹密度可以由灌漿配方與次數控制。對其中部分樣品的單軸抗壓應力應變全曲線進行分析(如圖5所示)，可知除UCS強度較低的HSSlB外，微生物灌漿材料的彈性段剛度相差不大，表現在圖5中各應力應變全曲線初始段基本重合，且與水泥石灰混合砂漿也基本重合。材料在破壞前，一般都會出現一個小峰，此時對應材料的可見裂縫的出現，此時的應力值為強度的65%-90%不等。然而，可見裂縫的出現並沒有顯著降低材料的剛度和抗載荷能力，隨著加載的繼續，材料應力、應變繼續增加，直至到達峰值。峰後段表現為強度越大的材料，強度退化越快，表現為這種材料高強時脆性越明顯。這種材料如果應用於結構灌漿加固，峰前開裂而不顯著降低材料強度、剛度，可根據開裂強度確定正常使用應力，而開裂後的強度儲備，則是必要的安全冗餘。為研究微生物砂漿在重複荷載下的應力-應變關係、破壞形態，並與混合砂漿在相同條件下的性能做比較，其結果如圖6所示。對於強度相近的微生物砂漿和混合砂漿在相同過程的重複荷載作用下，存在以下主要區別:1.達到峰值前，微生物砂漿較混合砂漿能耐受的循環荷載周期數較多(如圖6a和6b達到峰值前分別進過了 12和10個周期，如圖6c則是8個周期)，這表明微生物灌漿材料抵抗重複荷載能力較混合砂楽■聞;2.到達峰值後，微生物砂漿在峰後3-4個荷載周期內仍然能有一定承載能力，在這個階段的加載段，應力隨應變增加而增加，而此時混合砂漿加載段部分與包絡線重合，表現為加載段部分時間應變增加時應力持續下降。這說明微生物材料較混合砂漿在峰後殘餘強度方面優於混合砂漿；3.在樣品破壞形貌上，微生物砂漿峰值後圓柱體試樣逐漸開裂成一個個分開的短柱，如圖6a和6b，短柱在很長時間內並不斷裂，而混合砂漿峰值後開裂成薄片如圖6c，且很快薄片從中間折斷。這可以解釋微生物材料能在峰值後繼續耐受3-4個循環的荷載，而混合砂漿直接進入不可逆的劣化階段，即在峰值後的每個應力-應變循環中，在應變控制段，應力達到包絡線後，應變仍然增加，而此次應力快速降低。

4.進行測試的微生物砂漿樣品重複荷載抗壓極限強度較混和砂漿的低。2、孔隙結構和微觀形貌分析
壓汞實驗結果如圖7所示。微生物灌漿過程使原來鬆散堆積的砂顆粒間的孔隙慢慢變小，孔隙率急劇降低。2個批次的微生物灌漿後，材料中孔隙直徑基本都小於ΙΟΟμπι。隨著灌漿批次的進一步增加，材料中孔隙直徑進一步減小，但是孔徑減小幅度降低，經過7個批次灌漿後，仍存在不少孔徑在7 μ m左右的孔隙，總的來講，微生物灌漿材料的孔徑主要分布在10-100 μ m範圍內，而混合砂漿微孔主要分布0.01-1 μ m範圍內，相對於微生物灌漿材料的孔徑要小得多。微生物砂漿中這種相對較大孔隙給砌體結構內外水汽平衡提供了必要的通道，同時卻能有效阻斷毛細水入侵，有利於加固後砌體結構耐久性的提高。對微生物灌漿形成的膠凝體系樣品進行SEM掃描，其結果如圖8所示。其中圖8a、8b是樣品HSS9B中提取的，可以看出除了少量孔隙，砂顆粒周圍均被碳酸鈣包裹、填充，在放大的碳酸鈣 表面上可以清楚的看到許多直徑I μ m左右，長約3-4 μ m的孔洞，這些空洞大小與S.pasteurii相近,應該是微生物體留下的痕跡。
權利要求
1.產服酶微生物:Sporosarcinaantarctica UR53>Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31 以及Bacillus lentus UR41 已於2012年3月 16 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC N0.5916,CGMCC N0.5915、CGMCC N0.5913、CGMCC N0.5914，該保藏中心簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
2.根據權利要求1所述的產脲酶微生物:SporosarcinaantarcticaUR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcinasp.UR31 以及Bacillus lentus UR41 均呈捕圓杆狀，有芽孢，無莢膜，革蘭氏陽性，在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸銨10g/L平板上，菌落呈圓形，表面溼潤光滑，邊緣整齊，菌落大小為l_2mm，菌落呈淡黃色，該菌在4°C -37°C的培養基溫度及PH7-9.5的範圍下均能生長。
3.利用權利要求1或2所述的產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 步驟 1:將微生物 Sporosarcina pasteuri1、Terrabactertumescens> Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcinakoreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacillslentus UR41單個菌落分別在25°C _37°C條件下在發酵培養基中發酵培養12-60小時得到六種菌液； 步驟2:對結構空鼓進行閉水處理，灌入粒徑為300-450微米粒徑的砂粒，封閉整個空腔，預留進出漿口 ； 步驟3:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L菌液的速度把步驟I所得六種菌液由進漿口灌入空鼓，直至出漿口流出呈黃色的菌液； 步驟4:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化鈣固定液，所需體積為空腔體積的1/10 ； 步驟5:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入4L反應溶液的速度灌入等摩爾濃度尿素和氯化鈣混合溶液48h，反應液濃度為0.5-lmol/L ； 步驟6:以每立方米空鼓體積每分鐘灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化鈣固定液，所需體積為空腔體積的1/10 ； 步驟7:重複步驟3至步驟6過程1-5個循環。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:步驟I所述微生物Sporosarcinapasteurii來自於美國模式培養物集存庫(Americantype culture collection),編號為ATCCl 1859 ;所述微生物Terrabacter tumescens來自於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為AS.1.2690。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:步驟I所述發酵培養基包括酵母提取物10-20g/L，硫酸銨或氯化銨10g/L，pH為7-9.5。
全文摘要
產脲酶微生物Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41已於2012年3月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No.5916、CGMCC No.5915、CGMCC No.5913、CGMCC No.5914，利用產脲酶微生物製備高強度微生物砂漿的方法，將上述四種微生物及微生物Sporosarcina pasteurii和Terrabacter tumescens發酵培養基中發酵培養得到菌液，向砂顆粒體系多批次灌入菌液、固定液、膠凝液，形成強度最高可達55MPa的微生物砂漿，該材料力學性能優於水泥基材料劈裂抗拉強度較同等強度水泥石灰材料高，剛度和水泥石灰混合砂漿相近，但遠小於混凝土的剛度，耐受疲勞荷載和循環荷載能力高於水泥基材料；人工砂巖為無機材料，不會像環氧樹脂等有機材料一樣容易老化。
文檔編號C04B28/00GK103173376SQ201210464480
公開日2013年6月26日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者程曉輝, 化彬 申請人:清華大學