一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑及其製備方法

2023-07-08 12:10:21 3

專利名稱：一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種載i o-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑及其製備方法。
背景技術：
io-羥基喜樹鹼是所有的天然喜樹鹼同類物或合成喜樹鹼同類物中活性最
大的一個天然衍生物，HCPT主要對增殖細胞敏感，是細胞周期特異性藥物。 作用於S期，並對G2及M期邊界具有延緩作用，對G0期無效。HCPT的抗癌 機理主要通過抑制拓樸異構酶I (T0P0 1)，幹擾腫瘤細胞的DNA複製，抑制 腫瘤細胞生長，它與其它常用抗癌藥物無交叉耐藥。由於它具有高效、廣譜、 低毒的特點，使大劑量化療成為可能。此藥的毒副反應較大，呈劑量依賴型毒 性，主要表現為骨髓抑制，引起白細胞減少、胃腸道反應、泌尿道刺激等， 由於半衰期較短，臨床常需延長給藥時間，或延長療程，骨髓抑制和消化道毒 性也隨之增加，這些毒副反應一定程度上限制了羥喜樹鹼的臨床應用。此外， 羥喜樹鹼E環上的a -羥基內酯環是活性的必需基團，但羥喜樹鹼為水不溶、 脂難溶藥物， 一般用其鈉鹽水溶液作為臨床製劑，但形成鈉鹽後會使其E環上 的a -羥基內酯環打開，打開後形成的藥物羧酸鹽形式表現出極低的抗拓撲異 構酶I活性。有研究表明，內酯環結構破壞後，其藥理活性下降90%。因此， 解決羥喜樹鹼溶解度差、半衰期短、內酯基團不穩定等問題是當前的研究熱點。
超聲微泡是一種內含氣體的微球，用於增強組織超聲顯像，以提高疾病診 斷率。近年來，超聲微泡還被嘗試用於運載藥物進行耙向治療。以超聲微泡攜 載藥物，靜脈注射入體內後，在體外可採用診斷超聲對微泡到達器官、組織進 行監控，同時可運用一定能量的治療超聲進行體外定點輻照可使微泡破裂，將 藥物在局部釋放出來一即超聲破壞載藥微泡定位釋放治療技術。在此過程中， 可對藥物進行實時、靶向、定位控釋。除此之外，超聲破壞微泡瞬間產生的空 化效應，在局部產生微聲流、射流、休克波等，可提高組織毛細血管膜和細胞 膜的通透性，有利於增強腫瘤細胞對藥物的吸收，提高藥物對腫瘤細胞的殺傷 效果。 '
發明內容發明所述的一種載io-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，由 類脂雙分子層薄膜包裹生物惰性氣體構成，io-羥基喜樹鹼包封於雙分子層中，
類脂雙分子層薄膜以下重量份配比的原料製得10-羥基喜樹鹼2 3份，磷脂 混合物7 9份，非離子表面活性劑O. 1 0. 5份。
所述載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡優選粒徑範圍為0. 5 6 ii m，更優選 粒徑範圍為1.3 2.8ym。為保證微泡應用的安全性和獲得良好的超聲靶向控 釋效果，更優選的微泡平均粒徑為l. 6 u m左右。
為了提高微泡穩定性，所述的磷脂混合物包括以下重量份配比的A和B: 5 7份A和1. 5 2份B，其中A為1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷 脂醯膽鹼和雙肉豆蔻磷脂醯膽鹼中的一種，B為1， 2 —二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、 聚乙二醇5000 — 1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇2000—1， 2_二硬 脂醯磷脂醯乙醇胺、1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺中的一種。磷脂一聚乙二醇 5000 — 1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(MPEG5000-DPPE)和聚乙二醇2000 — 1， 2 — 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG2000-DSPE)具有長循環功能。
為了進一步提高微泡穩定性，所述的磷脂混合物還包括0. 5 1份C，其 中C為負電荷磷脂1， 2 — 二棕櫚醯磷脂酸和1， 2 — 二棕櫚醯磷脂酸中的一種。
為延長微泡在血液循環中的滯留時間及獲得較好的超聲生物學作用，所採 用的生物惰性氣體為全氟丙垸。
為了提高微泡的產量並可調節微泡的粒徑，所述的非離子表面活性劑選用 婆洛沙姆或者吐溫80。
本發明所提供的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑的製備方法，包括 以下步驟
(1) 將質量份配比10-羥基喜樹鹼2 3份、磷脂混合物7 9份、非離子表 面活性劑O. 1 0. 5份與400 600份溶液D混合，加熱15 30分鐘，使其分散形 成藥物、磷脂混懸液；
(2) 將上述脂質混懸液經滅菌處理後分配至容量為l. 5ml的管形瓶中；以 全氟丙垸氣體置換管形瓶上方空氣後進行密封，每支管形瓶上方氣體體積為 0.5 lml; 、(3)將管形瓶轉移至機械振蕩儀振蕩，製得載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微
泡懸浮液，所得的懸浮液即為所述的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑；
步驟(1)中所說的溶液D為磷酸鹽緩衝液與非水溶劑的混合液、生理鹽水
與非水溶劑的混合液、糖類與非水溶劑的混合液或醇類與非水溶劑的混合液。
磷酸鹽緩衝液、生理鹽水、糖類或醇類溶液與非水溶劑的體積比為9 10: 1，
糖類和醇類溶液為等滲或高滲。
將上述超聲微泡懸浮液導出至西林瓶後，檢測微泡的濃度、平均粒徑、粒
徑分布範圍和藥物的包封率、載藥量。
所述的非水溶劑為丙二醇、丙三醇或兩者的混合物。更優選為丙三醇，因
其較好的助溶作用，可使藥物、磷脂在溶液中充分分散。為獲得更好的分散效
果，還可將此混懸液進行冷凍乾燥，然後重新水合形成藥物、磷脂混懸液。
步驟(1)中加熱溫度優選為40 7(TC。
步驟(3)中機械振蕩儀轉速優選為3000 4500轉/分鐘，振蕩時間優選 為30 j60秒。
本發明將io-羥基喜樹鹼攜載於脂質超聲微泡中進行靶向治療，可克服io-
羥基喜樹鹼溶解性差的缺點，還可以使其a-羥基內酯環結構嵌人雙分子層磷脂 膜中，避免內酯環在水環境和血液中開環，從而保持其生物活性，採用超聲破 壞載藥微泡定位釋放治療技術則可提高治療效率，降低藥物劑量，減少其毒副 作用發生。 、
本發明所採用的成膜材料主要為磷脂，安全性和生物相容性好，可在體內 生物降解且無毒性和免疫原性。
本發明所提供的載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡試劑的製備方法，工藝簡 便、易操作，微泡產量高，性能穩定，顯像效果好；磷脂用量少，藥物包封率 和載藥量高。


圖i是本發明的載io-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡鏡下觀察結構示意圖(x
400)。
圖2是本發明的載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡增強兔肝臟顯像對比圖，其 中A為注射前的兔肝臟顯像圖，B為注射後的兔肝臟顯像圖。
具體實施例方式
以下結合實施例和附圖，對本發明作進一步說明。 實施例l
取10-羥基喜樹鹼25mg， 1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)50mg， 1， 2 — 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)20mg，加入4. 5ml磷酸鹽緩衝液與0. 5ml丙三醇組 成的混合液中，在45。C條件下水浴30分鐘，待形成較均勻的混懸液後分配至 1.5ml管型瓶中，每支分配0.5ml，然後以全氟丙烷氣體置換瓶內上方空氣，密 封管型瓶。最後將管型瓶轉移支機械振蕩儀振蕩45秒，即製得載10-羥基喜樹 鹼脂質超聲微泡混懸液。圖l是本發明的載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡鏡下觀 察結構示意圖(X400)。
實施例2
取10-羥基喜樹鹼20mg， 二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)50mg， 1， 2 — 二棕櫚 醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)20mg，加入4. 5ml 5%甘露糖溶液與0. 5ml丙二醇組成 的混合液中，餘下操作按實例l中進行，最後製得載io-羥基喜樹鹼脂質超聲 微泡混懸液。
實施例3
取10-羥基喜樹鹼20mg，雙肉豆蔻磷脂醯膽鹼(DMPC) 70mg，聚乙二醇 5000 — 1， 2 —二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(MPEG5000-DPPE) 18mg， 1， 2 — 二棕櫚 醯磷脂酸(DPPA) 16mg，婆洛沙姆5mg，加入4. 5ml 5%甘露糖溶液與0. 5ml 丙三醇組成的混合液中，餘下操作按實例l中進行，最後製得載io-羥基喜樹 鹼脂質超聲微泡混懸液。
實施例4
將實施例1、2、3中製得的載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡混懸液導入5ml 西林瓶中封蓋一2(TC保存，並取少量稀釋後以庫爾特計數儀計數微泡濃度，檢 測微泡粒徑。另取部分微泡混懸液低速離心棄液體及少量沉澱，以甲醇加超聲 破壞微泡，再加入適量甲醇完全溶解所釋放出的藥物，然後離心去除沉澱，將 上清夜稀釋，取少量以高效液相檢測10-羥基喜樹鹼濃度。最後計算包封率、 載藥量。
實施例5建立小鼠肝癌H22模型，分3組，每組10隻。按體重(2.5mg/kg)分別靜脈 注射生理鹽水、io-羥基喜樹鹼注射液、載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡混懸液， 然後在腫瘤部位進行同樣超聲輻照3分鐘(2W/cm2)，共治療7次。治療結束後 第3天取瘤塊稱重計算抑瘤率。結果發現，相同劑量條件下，載10-羥基喜樹鹼 脂質超聲微泡混懸液抑瘤率(74. 2% )明顯高於10-羥基喜樹鹼注射液組(46. 3
%)，表明超聲輻照載io-羥基喜樹鹼微泡組治療效果優於超聲輻照io-羥基喜
樹鹼注射液組。 實施例6
將上述載IO-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡混懸液按O. 05ml/kg劑量經耳緣靜 脈注射入紐西蘭大白兔體內，在諧波狀態下觀察注入微泡前後兔肝臟顯像情 況。圖2是本發明的載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡增強兔肝臟顯像對比圖，其 中A為注射前的兔肝臟顯像圖，B為注射後的兔肝臟顯像圖。由圖2可以看出， 本發明的試劑可明顯增強超聲顯像，因此可被超聲監控和觸發。
權利要求
1、一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，由類脂雙分子層薄膜包裹生物惰性氣體構成，10-羥基喜樹鹼包封於雙分子層中，類脂雙分子層薄膜以下重量份配比的原料製得10-羥基喜樹鹼2～3份，磷脂混合物7～9份，非離子表面活性劑0.1～0.5份。
2、 根據權利要求l所述的一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，所述載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡粒徑範圍為0. 5 6 u m。
3、 根據權利要求2所述的一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，所述載IO-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡粒徑範圍為I. 3 2. 8 u m。
4、 根據權利要求1所述的一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，所述的磷脂混合物包括以下重量份配比的A和B: 5 7份A和1. 5 2份B，其中A為1， 2 —二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼和雙肉豆蔻磷脂醯膽鹼中的一種，B為l， 2 — 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇5000_1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇2000 — 1， 2 — 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、1， 2 — 二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺中的一種。
5、 根據權利要求4所述的一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，所述的磷脂混合物還包括0.5 1份C，其中C為1， 2 — 二棕櫚醯磷脂酸和l， 2 — 二棕櫚醯磷脂酸中的一種。
6、 根據權利要求l所述的一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，所述的生物惰性氣體為全氟丙烷；所述的非離子表面活性劑為婆洛沙姆或者吐溫80。
7、 權利要求l所述的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑的製備方法，包括以下步驟(1) 將質量份配比10-羥基喜樹鹼2 3份、磷脂混合物7 9份、非離子表面活性劑O. 1 0. 5份與400 600份溶液D混合，加熱15 30分鐘，使其分散形成藥物、磷脂混懸液；(2) 將上述脂質混懸液經滅菌處理後分配至容量為l. 5ml的管形瓶中；以全氟丙垸氣體置換管形瓶上方空氣後進行密封，每支管形瓶上方氣體體積為`0. 5 lml;(3) 將管形瓶轉移至機械振蕩儀振蕩，即製得載10-羥基喜樹鹼脂質超聲微泡懸浮液，所得的懸浮液即為所述的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑;步驟(1)中所說的溶液D為磷酸鹽緩衝液與非水溶劑的混合液、生理鹽水與非水溶劑的混合液、糖類與非水溶劑的混合液或醇類與非水溶劑的混合液。磷酸鹽緩衝液、生理鹽水、糖類或醇類溶液與非水溶劑的體積比為9 10: 1。
8、 根據權利要求7所述的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑的製備方法，其特徵是，所述的非水溶劑為丙二醇、丙三醇或兩者的混合物。
9、 根據權利要求7所述的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑的製備方法，其特徵是，步驟(1)中加熱是溫度為40 7(TC下加熱。
10、 根據權利要求7所述的載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑的製備方法，其特徵是，步驟(3)中機械振蕩儀轉速為3000 4500轉/分鐘，振蕩時間為30 60秒。
全文摘要
本發明提供一種載10-羥基喜樹鹼的脂質超聲微泡試劑，其特徵是，由類脂雙分子層薄膜包裹生物惰性氣體構成，10-羥基喜樹鹼包封於雙分子層中，類脂雙分子層薄膜以下重量份配比的原料製得10-羥基喜樹鹼2～3份，磷脂混合物7～9份，非離子表面活性劑0.1～0.5份。該超聲微泡可增強超聲顯像，主要用作載10-羥基喜樹鹼的藥物載體，可保護對其抗腫瘤活性具有重要作用的a-羥基內酯環結構，並可在超聲監控下於特定部位被治療超聲靶向破壞，釋放出所載10-羥基喜樹鹼，從而達到提高療效降低毒副作用的目的。本發明還具體涉及製備該載藥超聲微泡的方法，其特徵在於採用機械振蕩法，應用該方法製備出的微泡產量高，性能穩定，顯像效果好；磷脂用量少，藥物包封率和載藥量高。
文檔編號A61P35/00GK101675995SQ200810212058
公開日2010年3月24日 申請日期2008年9月16日 優先權日2008年9月16日
發明者任建麗, 冉海濤, 張群霞, 涓 成, 攀 李, 王志剛, 鄭元義 申請人:重慶醫科大學附屬第二醫院