一類氟化硼絡合二吡咯甲川染料、製備方法及其應用的製作方法
2023-08-03 03:06:31 2
專利名稱：一類氟化硼絡合二吡咯甲川染料、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及可用於生物螢光分析領域的一類新型氟化硼絡合二吡咯甲川類螢光 染料、及其製備方法和應用。
背景技術：
螢光分析技術作為一種傳統的分析方法，特別是近年來隨著新型螢光分析技術的 出現與應用而得到了長足的發展。這些新技術具有靈敏度高、選擇性好、取樣量少、方法快 速簡便等優點，已成為多種研究領域中進行痕量和超痕量甚至分子水平上分析的一種重要 工具。螢光分析方法可提供包括激發光譜、發射光譜和三維光譜以及螢光強度、螢光效率、 螢光壽命等多種物理參數。這些參數反映了分子的各種特性，能從不同角度提供研究對象 的微觀結構信息。眾所周知，對蛋白質和DNA等生物大分子進行定性分析和定量測定是生物化學和 生命科學中經常涉及的分析內容，建立高靈敏度、低檢測限的螢光探針定量測定的方法仍 具有重要意義；另外，在DNA測序、蛋白質標記、新藥研發、細胞內組織成分測定、生物藥代 跟蹤與分析及疾病發病機理研究等領域無不涉及到現代螢光分析檢測技術。而螢光染料 作為螢光分析技術中的前提條件，其性能的優劣將直接影響甚至決定整個螢光檢測的靈敏 度、可靠性和實用價值。因此，開發性能優異、適合生物螢光分析應用的螢光染料顯得尤其 重要。一般來講，適合螢光分析應用的螢光染料通常要具備以下主要性質一、染料的螢光量子產率較高，最好應該大於0.5。螢光量子產率高將有助於提高 檢測的靈敏度，使檢測極限維持在較低濃度的水平。螢光量子產率的高低是衡量一個螢光 染料優良與否的最重要因素之一。二、染料應該具有較長的最大吸收和發射波長，最好在可見光區。因為生物體內存 在很多的有機共軛小分子，例如嘌呤、嘧啶、各種胺基酸，蛋白質分子等，他們在紫外區域都 有吸收和發射光譜，如果螢光染料的吸收波長在紫外或者較短波長區域，將會降低螢光探 針的靈敏度；並且某些幹擾分子的自發螢光會掩蓋探針的發射光譜，容易使檢測的結果出 現偏差；另外，紫外激發光照射在生物組織內而造成的散射光也對螢光的檢測靈敏度構成 了很大障礙。三、螢光染料應該具有較高的穩定性。無論是在光照下、酸鹼條件下，還是在較高 溫度下，染料的化學性質應該穩定不會發生嚴重的光氧化現象，不會在酸鹼條件有較小改 變的狀況下光譜發生較大的波動，當然也不應該在稍高的溫度下就迅速地發生分解。四、染料分子應該具有較好的細胞穿透能力和細胞內的溶解能力。只有這樣才能 夠設計出適合在細胞中應用的螢光探針。染料分子既要有一定的油溶性又要有一定的水溶 性，油溶性是為了便於穿透細胞膜，水溶性是為了有助於在細胞內很好的分散。染料分子的 這兩種性質可以通過引入合適的親水性或者親油性基團來調節。五、染料基團對生物體應該沒有或者僅有極小的毒害。這就要求螢光探針只對特定的靶標發生作用，而不應該由於自身結構的原因而對細胞內其它活性組織產生破壞作 用，否則就失去了螢光探針的生物應用價值。而作為螢光探針重要組成部分的螢光團當然 對細胞的毒害作用要小，儘量不要幹擾細胞的活性。在常用的螢光染料中，芘類與香豆素類螢光染料吸收波長較短，在生物分析中不 利於提高檢測的靈敏度；菁染料雖然具有較長的發射波長，但其光穩定性較差，螢光量子產 率也較低。因此，開發具有良好螢光光譜性能的新型螢光染料，仍然是螢光分析技術發展的 關鍵。氟化硼絡合二吡咯甲川(簡稱B0DIPY)類螢光染料是近二十幾年才發展起來並受 到廣泛重視的一類新型螢光化合物。由於BODIPY類螢光染料具有螢光量子產率高、摩爾 消光係數大、光譜性質非常穩定(不易受到溶劑極性和PH值的影響)、染料的螢光光譜峰寬 較窄及光穩定性較好等非常優異的理化性能，最近幾年來在生物分子螢光標記、核酸檢測、 病理分析及細胞顯像等諸多領域得到了大量應用。而合成具有特定活性基團，如氨基，羧 基，羥基及特定識別基團等新的活性衍生物，是這類螢光染料在生物化學及生命科學等領 域進一步應用的基礎。對應用於生物分析領域的螢光染料，通常是在螢光染料的母體引入帶羧基的活性 官能團，並通過N-羥基丁二醯亞胺活化後，直接用於生物分子或生命有機體中進行分析檢 測。例如有文獻報導在BODIPY染料母體結構的側面2號位置引入脂肪鏈羧酸， 合成路線達六步之多，產率只有12%，生產成本很高。[參見Ludmila A. Alexandrova和 Marina K. Kukhanova 等人發表於 Bioconjugate Chem, 2007 ；18 :886-93.的 ^； $ "New Triphosphate Conjugates Bearing Reporter Groups Labelingof DNA Fragments for Microarray Analysis，，]。另外，Niko等人通過含有自由羧基的吡咯與另一分子的取代吡咯發生不對稱縮 合，最終生成帶有活性羧基的BODIPY類螢光染料，但此方法原料很難合成，且整個反應進 程也不易操作，收率也較低。參見Niko J. Meltola,Rina Wahlroos，和Aleksi E. Soini.發 表於 J. Fluorescence. Vol. 14，No. 5，635-647 的文章。
發明內容
綜上所述，本行業內需求採用方便易行的新方法來合成新型的帶有羧酸活性基團 的BODIPY類螢光染料，促進該類染料更快更好的應用於生物螢光分析領域。本發明運用取代吡咯與不同的酸酐反應，簡單可行地合成了一系列新型的帶有羧 酸活性基團的BODIPY類螢光染料。反應步驟簡單，幾步反應一鍋完成，條件溫和，產率較高。本發明方法不同於傳統的利用醛類或醯氯類化合物與取代吡咯反應製備該系列 染料的合成方法，而是採用酸酐直接與取代吡咯反應，並且對合成方法進行了改進和優化， 從而使產率最高達到25%。合成的染料具有下面的通式I :
權利要求
1.-類氟化硼絡合二吡咯甲川螢光染料，其特徵在於該螢光染料具有如下結構通式
2.如權利要求1所述的氟化硼絡合二吡咯甲川類螢光染料，其中所述的禮、R2>R3、R5> R6、R7各自為H或Ch的烷基。
3.如權利要求1所述的氟化硼絡合二吡咯甲川螢光染料，其中所述的&、R1(1、Rn、R12各 自為H或Cy烷基。
4.如權利要求1-3中任一項所述的氟化硼絡合二吡咯甲川螢光染料，其特徵在於該染 料具有如下結構式II、III、或IV :
5. 一種製備如權利要求1所述螢光染料的方法，包括(1)被取代的吡咯與有機二元酸酐，在有機溶劑或絕對無水的有機溶劑中發生縮合，在 縮合過程中，兩分子的取代吡咯與一分子酸酐進行縮合，其中一分子的取代吡咯為具有取 代基1^ 和R3的吡咯，另一分子的取代吡咯為具有取代基和R7的吡咯，有機二元酸酐選自丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或鄰苯二甲酸酐；有機溶劑選自二氯甲烷、四氫呋 喃或乙腈，所述取代吡咯在所述有機溶劑中的摩爾濃度為0. 1_20%，而且取代吡咯與酸酐 的原料投料摩爾比為0.5-10 1，反應溫度控制在15-120°C，反應得到產物二吡咯甲川結 構化合物；(2)將得到的二吡咯甲川結構化合物再與三氟化硼化合物發生反應，並加入有機胺中 和劑，脫掉氟化氫後形成通式I化合物，然後提純；所述三氟化硼化合物選自氣態三氟化 硼、三氟化硼的乙醚絡合物、或其他能夠在常溫溶液狀態下釋放出三氟化硼的化合物；反應 溫度為-10°C -IOO0C ；三氟化硼化合物的加入量是使二吡咯甲川結構化合物與三氟化硼 化合物的摩爾比為1 0.1-10。
6.一種權利要求1所述的氟化硼絡合二吡咯甲川螢光染料的用途，它用於合成標記蛋 白質或DNA的生物分子探針。
7.—種權利要求1所述的氟化硼絡合二吡咯甲川螢光染料的用途，它用於生物螢光分 析或生物分子標記。
8.如權利要求7所述的用途，其中所述的生物分子標記是蛋白質標記、DNA標記、多肽 標記、抗原或抗體標記、或抗抗體標記。
9.如權利要求7所述的用途，其中所述的螢光分析是螢光免疫分析、螢光顯微鏡分析、 或螢光比色分析。
全文摘要
本發明涉及一類氟化硼絡合二吡咯甲川螢光染料，該螢光染料具有通式I式中R1、R2、R3、R5、R6、R7各自為H或C1-8烷基；R8為結構式X、Y、Z或P的基團；M為H、Na、K、N(R9R10R11R12)或N-琥珀醯亞胺基，其中R9、R10、R11、R12各自為H、C1-8烷基、或帶有取代基-OH、醚鍵、或羧基的C1-8烷基。該染料由取代吡咯直接與酸酐反應而合成，具有良好的光物理特性、穩定性和細胞穿透能力和細胞內的溶解能力，尤其適用於生物螢光分析和生物標記。
文檔編號C09K11/06GK102061103SQ20091026256
公開日2011年5月18日 申請日期2009年12月25日 優先權日2009年11月11日
發明者孫世國, 張劍洲, 彭孝軍, 樊江莉, 王東川, 王麗 申請人:大連理工大學, 珠海納思達企業管理有限公司