Tweak調節劑和抑制劑在治療神經病症中的應用的製作方法

2023-08-03 10:34:26

專利名稱：Tweak調節劑和抑制劑在治療神經病症中的應用的製作方法
技術領域：
本發明的目的是採用能調節或抑制神經細胞內TWEAK表達或活性的物質來製造治療和/或預防神經和/或精神病症的藥物。
本發明還涉及調節或抑制TWEAK受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體胞內信號傳導的物質在相同目的中的應用。
此外，本發明包括鑑定能調節或抑制TWEAK表達或活性的物質的方法。
TNF樣凋亡弱誘導物(TWEAK，TNF-like weak inducer of apoptosis)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員。已知該家族的成員參與凋亡、增殖、遷移和炎症。大多數腫瘤壞死因子是II型跨膜蛋白，但TNF的胞外域可被特定的金屬蛋白酶切割，產生可溶性細胞因子。這些可溶性細胞因子然後與特定的受體相互作用(Orlinick等，(1998)，Cell Signal.10(8)543-51)。
人TWEAK基因由750個鹼基對編碼，位於染色體17上。它被翻譯成一種表觀分子量為30 kDa的250個胺基酸的蛋白質。小鼠、大鼠和人之間的序列同源性相當高(就受體結合域而言，小鼠與人為93％；大鼠與人為90％)，這說明了結構和功能的保守性(Chicheportiche等，(1997)，J Biol Chem.，272(51)32401-10)。
未加工的TWEAK具有一跨膜結構域，主要定位於細胞膜外。加工後，該蛋白質的分泌可溶性形式約17kDa，並裝配成典型的TNF-配體三聚活性形式。這種TWEAK三聚體結合特定的受體，通過表達克隆鑑定該受體為成纖維細胞生長因子誘導型基因(Fnl4)。研究證實，TWEAK結合Fnl4(TWEAK受體)，導致與NF-kB活化有關的胞內信號傳導級聯的活化，從而介導促炎症和細胞死亡效應(Han S等，(2003)，Biochem Biophys Res Commun.2003，13；305(4)789-96)。
一些研究顯示，TWEAK誘導腫瘤細胞凋亡並通過上調粘附分子和分泌細胞因子發揮促炎症作用(參見Wiley等，(2003)，Cytokine Growth Factor Rev.，14(3-4)241-9)。它還顯示促進內皮細胞增殖和血管發生。尤其是與bFGF聯用時可刺激新血管形成。
TWEAK轉錄物富含並發現於許多組織。據報導，淋巴細胞分泌的TWEAK可滲入發炎的大腦並作用於星形膠質細胞。這些星形膠質細胞結合配體，但可抵抗TWEAK介導的凋亡。觀察到這些細胞分泌大量IL-8和IL-6，說明TWEAK在大腦炎症中具有作用(Saas P等，(2000)，Glia.32(1)102-7)。
對於許多神經病現在還沒有合適的治療方法中風是西方世界的第三大死亡原因，並且是導致失能的主要原因。它帶來了巨大的社會經濟學負擔。其病因可以是缺血(大多數病例中)或出血。缺血性中風的原因通常是血栓或血栓形成。迄今為止，對於大多數中風患者還沒有有效的治療。到目前為止，唯一在臨床上得到證實的藥物是組織纖溶酶原激活物(TPA)和阿斯匹林。在立即梗死核心的大量細胞由於缺乏葡萄糖和氧氣而死亡後，由於穀氨酸鹽的興奮性毒性、凋亡機制和自由基產生等繼發性機制梗死區域在數天不斷擴大。
肌萎縮側索硬化(ALS；Lou-Gehrig病；Charcot病)是一種神經變性疾病，其年發病率為每100,000人0.4-1.76(Adams等，Principles of Neurology，第六版，紐約，第1090-1095頁)。它是運動神經元病變的最常見形式，典型表現有泛發性肌束震顫、進行性萎縮和骨骼肌無力、痙攣狀態和錐體束症狀、構音困難、吞咽苦難以及呼吸困難。病理學主要在於脊髓前角和下腦幹運動核中的神經細胞損失，但也包括皮層中的一級運動神經元損失。這種破壞性疾病的發病機理仍基本未知，儘管已經詳細知道超氧化物歧化酶(SOD1)突變在家族性病例中的作用，這涉及到氧化應激假說。迄今為止已報導了90多種可造成ALS的SOD1的突變(Cleveland和Rothstein(2001)，Nat Rev Neurosci，2，806-19)。此外，還顯示了神經絲在這種疾病中的作用。興奮性毒性，一種由於過量穀氨酸鹽刺激誘發的機制，也是重要因素，可通過利魯唑對人類患者的有益作用來例證。SOD1突變體最具說服力的證據是，胱冬酶和凋亡的激活似乎在ALS中是共同的最終途徑(Ishigald等，(2002)，J Neurochem，82，576-84.，Li等，(2000)，Science，288，335-9)。因此，似乎ALS也有與其它神經變性疾病和中風相同的一般發病模式，例如涉及穀氨酸鹽、氧化應激和程序性細胞死亡。
帕金森病是最常見的運動失調，北美約有1百萬患者；65歲以上人群中約有1％患有該病。該病的主要症狀是僵直、震顫和運動不能(Adams等，Principles ofNeurology，第六版，紐約，第1090-1095頁)。帕金森病的病因未知。然而，從人腦屍檢研究和動物模型獲得的生化數據大多數都指出黑質中正在進行氧化應激過程，該過程會引發多巴胺能神經變性。神經毒素6-羥基多巴胺和MPTP(N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)誘導的氧化應激已經被用於動物模型以研究神經變性過程。儘管存在對症治療(例如，L-DOPA加脫羧酶抑制劑；作為多巴胺激動劑的溴隱亭、培高利特；以及抗膽鹼能藥如三己芬迪(安坦))，但無疑需要能夠確實停止疾病進程的對因治療，例如神經保護治療。這些動物模型被用來檢測自由基清除劑、鐵螯合劑、多巴胺激動劑、氧化氮合成酶抑制劑和某些鈣通道拮抗劑的功效。凋亡機制在動物模型以及患者中無疑具有作用(Mochizuki等，(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10918-23，Xu等，(2002)，Nat.Med.，8，600-6，Viswanath等，(2001)，J. Neurosci.，21，9519-28，Hartmann等，(2002)，Neurology，58，308-10)。這種包括氧化應激和凋亡的病理生理學機制也使帕金森病屬於神經變性疾病和中風。
腦缺血可由多種損害腦血流量(CBF)及導致氧氣和葡萄糖缺乏的原因導致。另一方面，外傷性腦損傷(TBI)涉及通常造成頭顱骨折和突然破壞腦實質並切斷或撕裂血管和腦組織的原發性機械損傷。這又引發了一連串以激活分子和導致繼發性損傷的細胞應答為特徵的事件。這種繼發性損傷的發展是一種涉及許多生化途徑的主動過程(Leker和Shohami(2002)，Brain Res.Rev.，39，55-73)。已經鑑定了導致半影缺血區和暴露於繼發性外傷後損傷的區域內繼發性細胞死亡的有害途徑之間的許多相似處(例如，過量穀氨酸鹽釋放導致的興奮性毒性、氧化氮、反應性氧種類、炎症和凋亡(Leker和Shohami(2002)，Brain Res.Rev.，39，55-73))。此外，據報導，外傷性腦損傷後發生的早期缺血事件增加了原發性機械損傷造成的缺血損害。
心血管疾病是西方工業化國家的主要死因。在美國，每年約有1百萬人死亡，其中接近50％是在醫院外突然發生的(Zheng等，(2001)，Circulation，104，2158-63)。每100,000居民中有40-90人嘗試心肺復甦(CPR)，而自發循環恢復(ROSC)佔這些患者的25-50％。然而，成功ROSC後的出院率僅為2-10％(Bottiger等，(1999)，Heart，82，674-9)。因此，每年大多數心臟停搏受害者在美國沒有成功治療。CPR成功後存活率低，即停搏後住院死亡率高的主要原因是持久性腦損傷。心循環停止後的腦損傷與對缺氧應激的耐受時間短和特定的再灌注障礙有關(Safar(1986)，Circulation，74，IV138-53，Hossmann(1993)，Resuscitation，26，225-35)。最初，許多患者在心循環停止後血流動力可能穩定；然而，其中許多人卻因中樞神經系統受損而死亡。心臟停搏後腦損傷的個人、社會和經濟後果是破壞性的。因此，心臟停搏和復甦(「整體缺血和再灌注」)研究最重要的問題之一就是腦復甦和停搏後腦損傷(Safar(1986)，Circulation，74，IV138-53，Safar等，(2002)，Crit Care Med，30，140-4頁)。目前，採用任何停搏後治療手段都不可能降低由於心臟停搏缺氧造成的對神經元的原發性損傷。主要的病理生理問題包括缺氧和隨後的壞死、包括自由基形成和細胞鈣內流的再灌注損傷、刺激性胺基酸的釋放、腦微循環再灌注障礙以及程序性神經元死亡或凋亡(Safar(1986)，Circulation，74，IV138-53，Safar等，(2002)，Crit Care Med，30，140-4)。
一些臨床試驗試圖改善心臟停搏後的神經損傷但沒有成功。測試了巴比妥酸鹽(用來增強神經保護)或鈣通道阻斷劑(用來減輕缺血再灌注損傷)的治療用途(Group(1986)，Am.J. Emerg.Med.，4，72-86，Group(1986)，N.Engl.J.Med.，314，397-403，Group(1991)，Control Clin.Trials，12，525-45，Group(1991)，N.Engl.J.Med.，324，1225-31)。迄今為止，在臨床環境中還沒有可選擇的有效的停搏後治療可改善心循環停止後的神經損傷(輕度低溫和血栓溶解可能除外，仍在熱切期待大規模隨機受控臨床試驗的結果(Safar等，(2002)，Crit.Care Med.，30，140-4))。因此，改善心臟停搏後神經結果的創新療法至關重要。
多發性硬化是一種中樞神經系統的原型炎性自身免疫疾病，終身危險為1/400，它可能是導致青壯年神經失能的最常見原因。全世界約有2-5百萬人患有這種疾病(Compston和Coles(2002)，Lancet，359，1221-31)。由於其所有症狀很複雜，這種疾病可能由尚未鑑定的環境因素和易感基因之間的相互作用而導致。這些因素綜合作用引發了級聯反應，包括免疫系統參與、軸突和神經膠質的急性炎性損傷、功能恢復和結構修復、炎症後神經膠質增生以及神經變性。隨後發生的這些過程成為以功能恢復、持續存在的缺陷和繼發性進展為特徵的臨床過程的基礎。治療的目的是降低復發頻率並限制復發的持續效果、緩解症狀、預防疾病發展造成的失能以及促進組織修復。
精神分裂症是一種最常見的精神疾病。每100人中平均約有1人(人口的1％)患有精神分裂症。這種疾病在全世界所有種族和文明的人中都有發現。精神分裂症以相同比例影響男性和女性，但男性出現精神分裂症的時間平均早於女性。通常，男性在25歲左右首次出現精神分裂症病徵，而女性在將近30歲才首次出現病徵。精神分裂症給社會造成極大負擔，估計美國每年要耗費325億美元。精神分裂症的特徵有以下一些症狀妄想、幻覺、胡思亂語、負面症狀(退隱，缺乏感情和表情，精力、動力和活力降低)、緊張。精神分裂症的主要療法是基於神經抑制(neuropleptic)，如氯丙嗪、氟哌啶醇、奧氮平、氯氮平、硫利達嗪等。然而，神經抑制治療通常不會減輕精神分裂症的所有症狀。此外，神經抑制治療可能有嚴重的副作用，如遲發性運動障礙。精神分裂症的病因學還不清楚，雖然似乎有強烈的遺傳影響。最近，已清楚精神分裂症具有神經變性疾病的至少一些方面的原因。具體地說，MR研究已顯示精神分裂症患者中有快速的皮層灰質流失(Thompson等，(2001)，Proc Natl Acad SciUSA，98，11650-5；Cannon等，(2002)，Proc Natl Acad Sci USA，99，3228-33)。因此，用神經保護藥如TWEAK抑制治療精神分裂症是合理的。
由上可見，需要治療神經和/或精神病症，例如與神經系統的可塑性和功能恢復增強或細胞死亡有關的神經病的藥物。具體地說，需要通過為有關神經細胞提供神經保護來治療神精病。
本發明解決了這些問題，提供了調節或抑制神經細胞內TWEAK和/或TWEAK受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質在製造用於治療和/或預防神經和/或精神病症的藥物中的應用，即產生了利用調節或抑制神經細胞內TWEAK或TWEAK受體或者TWEAK和TWEAK受體的表達或活性、或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質來治療或預防或者治療和預防神經或精神病症的方法。
術語「物質」應廣義理解，它通常表示所有直接或間接帶來所需效果的物質。例如，本發明所述的物質可以是核酸或蛋白質、TWEAK或TWEAK受體的天然或人造結合伴侶、抗體、TWEAK受體拮抗劑、TWEAK受體拮抗劑的肽模擬物、反義核酸、適體、天然或人造轉錄因子、核酸構建物、載體或者低分子量化合物。
「調節」指提高或減低TWEAK的至少一種必需特性或表達。「抑制」包括部分或實質上完全抑制或阻斷不同細胞-生物機制的表達或活性。統計概率指在兩種情況下與未處理細胞相比觀察到顯著差異。
術語「活性」在本發明中指TWEAK結合和/或活化其受體的能力。
「治療」指減緩、中斷、阻止或停止疾病或病症的發展，而不一定要求完全消除所有疾病症狀或病徵。「預防」可理解為以任何程度抑制疾病或病症的發作或嚴重性，包括但不限於完全防止疾病或病症。
為實現這些效果，以治療有效量給予所述物質。本發明所述物質的治療有效量可對治療個體產生有益效果。這種量可根據個體患者的年齡、種族、性別和其它因素確定。當聯合給予各種因子時，可在給藥之前將它們預混合、同時給藥或者分別相繼給藥。給藥途徑可包括傳統途徑，包括例如口服、皮下、透皮、直腸、靜脈內、動脈內、直接注射給大腦、鼻內(通過鼻噴霧)和腸胃外給藥。
熟練的技術人員知道有許多不同方法可以所需方式影響TWEAK。關於這點，下述方法應理解為是舉例。
在一優選的實施方案中，能夠調節或抑制TWEAK、其受體的表達或活性，或者影響該受體胞內信號傳導的物質是抗體。第一種情況下，這種抗體本身構成了對TWEAK、TWEAK受體或由TWEAK受體引發的信號轉導途徑中的蛋白質具有特定結合親和力，和/或能夠調節這些蛋白質的至少一種必需特性的化合物。根據本發明，術語「抗體」包括多克隆抗體以及單克隆抗體、人和人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、合成抗體或這些抗體的片段。本發明所述的片段是所有截短或修飾的抗體片段，它具有一個或兩個與抗原互補的結合位點。優選截短的雙鏈片段，如Fv、Fab和F(ab)2。例如，可通過酶法用諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶切割抗體的Fc部分，或通過化學氧化法或通過重組操作抗體基因獲得這些片段。
所有抗體可以結合或可溶形式使用，並且可被標記。標記指直接或間接連接到可檢測的物質。本發明所述的抗體也可以是融合蛋白的一部分。這些融合蛋白可通過酶切割、通過蛋白質合成或通過精通本領域的技術人員已知的重組方法製造。
本發明所述的抗體應理解為所有的免疫球蛋白類型，如IgM、IgG、IgD、IgE和IgA，或者它們的亞類，如IgG的亞類IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgGM，或者它們的混合物。特別優選IgG的亞型IgG17k或IgG2b/k。
單克隆抗體可通過精通本領域的技術人員熟悉的技術獲得，如雜交瘤技術(Khler和Milstein，Nature(1975)，256495-397；US 4 276 110)。多克隆抗體是衍生自已經用抗原免疫的動物血清的抗體分子的不均一混合物。本發明所述的抗體可以是多克隆的單特異性抗體，該抗體可通過純化抗體得到。
所有這些抗體或片段可單獨使用或混合使用。抗-TWEAK抗體的例子有AB.G11抗體(Jalcubowski等，J.Cell.Sci.2002/01/15，115(Pt2)267-74)。
在優選的實施方案中，能夠調節或抑制TWEAK或其受體的表達或活性的物質是反義核苷酸序列。反義核苷酸序列在mRNA水平發揮作用，防止其翻譯成蛋白質(Kurreck，Eur.JBiochem.(2003)，2701628-1644)。
「反義」核酸序列指與核酸序列的正鏈部分完全或部分互補的核酸序列。本發明所述的反義核苷酸序列與TWEAK核酸序列或其片段、或功能等價物、或其功能等價物片段的編碼區互補。因此，反義核苷酸序列可與TWEAK受體或各轉導途徑的蛋白質或其片段互補。然而，反義核酸序列也可與非編碼區或其一部分互補。在優選的實施方案中，反義核酸是長度為，例如，15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸，優選15、16、17、18、19或20個核苷酸的寡核苷酸。
反義核酸可採用精通本領域的技術人員熟悉的方法通過化學方法和/或酶學方法製備。這些反義寡核苷酸可為用非天然鹼基、修飾的糖或改變的磷酸主鏈修飾的類似物。修飾的核苷酸可提高反義核酸的生物學穩定性，或提高反義核酸和正義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定性。其例子有硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸(Eckstein，Antisense NucleicAcids DrugDev.(2000)，10297-310)。或者，反義核酸也可通過生物學方法採用已在反義方向下遊插入了相應核酸合適啟動子的表達載體來製備。熟練的技術人員知道，可將兩種cDNA之一用作合適的反義構建物的起始模板。
一些「第二代」反義核苷酸不能誘導RNA酶H切割靶RNA。在優選的實施方案中，「gapmer技術」被用於這些類型的修飾的核苷酸。Gapmer由足以激活RNA酶H的DNA或硫代磷酸酯DNA單體的一段中央序列和第二代各末端修飾的核苷酸構成。它們可以是肽核酸、N3』-P5』氨基磷酸鹽、2』-脫氧-2』-氟-β-D-阿拉伯糖核酸、鎖定核酸、嗎啉代寡核苷酸、環己烯核酸和三環-DNA(Kurreck，Eur.J Biochem.(2003)，2701628-1644)。
介導高效分子攝取及保護反義核苷酸抵抗核降解的遞藥系統是精通本領域的技術人員熟知的並可用於本發明(Hughes等，(2001)Drug Discovery Today，6303-315；Liang等，(2002)Eur.JBiochem.，2695753-5758)。
雙鏈RNA介導的基因幹擾(RNAi)是一種基因沉默機制，其中，雙鏈RNA分子的存在使具有通用序列的基因表達降低或沉默。在優選的實施方案中，能夠調節或抑制TWEAK或其受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質是siRNA。術語「siRNA」在這裡指能夠介導RNA幹擾的任何核酸分子。
與本發明的靶mRNA互補的dsRNA分子優選長度在10-30個鹼基對之間，更優選其長度在19-25個鹼基對之間。可採用任何精通本領域的技術人員已知的方法將siRNA遞送到靶細胞。例如，可用陽離子脂質體試劑來遞送。也可以假設運送到細胞因子mRNA的siRNA是用其編碼DNA獲得的。此時，含有所需細胞因子編碼區19-25個核苷酸的一段序列以及由能夠形成髮夾環的合適接頭與一段正義序列分隔開一段反義序列的DNA構建物被插入載體。這種構建物的設計還描述在，例如，Brummelkamp等，(Science，2002，第296卷，550-553頁)。
在本發明的優選實施方案中，反義核苷酸和/或siRNA由病毒載體或脂質體提供。已知合適的載體和表達控制序列以及載體構建的選擇方法。例如，病毒載體包括腺病毒(Acsadi等，Hum.Gene Ther.7(2)129-140(1996)；Quantin等，PNAS USA 89(7)2581-2584(1992)；和Ragot等，Nature 361(6413)647-650(1993))、腺伴隨病毒載體(Rabinowitz等，Curr.Opin.Biotechnol.9(5)470-475(1998))、逆轉錄病毒載體(Federico，Curr.Opin.Biotechnol.10(5)448-453(1999))、單純皰疹病毒載體(Latchman，Gene 264(1)1-9(2001))、慢病毒載體、Sindbis病毒載體或Semliki森林病毒載體。
合適的載體也可以是含有將結合神經細胞的蛋白質的脂質體。這種轉移系統的例子有HVJ-脂質體(Kaneda等，(2002)，Mol Ther，6，219-26，Kaneda(1999)，MolMembrBiol，16，119-22)。優選地，編碼和表達蛋白質或多肽的分離並純化的核酸被操作性連接於適合在神經細胞內表達的啟動子。這些以及其它合適載體的綜述可見Kay等，Nature Medicine 733-40(2001)；Somia等，Nature Reviews 191-99(2000)；和vanDeutekom等，Neuromuscular Disorders 8135-148(1998)。
用來操作性連接於分離並純化的核酸的合適的啟動子是本領域已知的。優選地，編碼多肽的分離並純化的核酸被操作性連接於選自以下的啟動子肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子(Jaynes等，Mol.Cell Biol.62855-2864(1986))、巨細胞病毒(CMV)啟動子、四環素/強力黴素可調控啟動子(Gossen等，PNAS USA 895547-5551(1992))。
通常，為確保有效轉運本發明的載體，考慮到給藥途徑，根據所接觸的細胞數，每個所接觸的細胞採用約1-5000個載體拷貝，更優選使約3-300pfu進入每個細胞。病毒量可根據需要以及是體外還體內應用而不同。實際劑量和方案可根據組合物是否與其它組合物(例如，藥物組合物)聯合施用，或者根據個體藥代動力學、藥物分布或代謝的差異而不同。類似地，根據細胞的特定類型或者轉移載體的方法，體外應用的用量也可不同。
在本發明的優選實施方案中，調節或抑制神經細胞內TWEAK和/或TWEAK受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質是核酶。「核酶」在這裡包括含有供特異性識別的反義序列並具有RNA剪切酶活性的RNA分子。核酶被設計成通過互補鹼基對雜交靶向靶mRNA。與靶結合之後，核酶的酶活性切割靶mRNA從而防止其翻譯成蛋白質。兩種類型的核酶在本發明中特別有用錘頭核酶(Rossi等，(1991)Pharmac.Ther.50245-254)和髮夾核酶(Hampel等，(1990)，Nucl.Acid.Res.18299-304)。
為減少特定蛋白質的核酶的表達是精通本領域的技術人員已知的。可通過核酶和靶RNA的二級結構計算以及通過它們的相互作用來確定合適的靶序列和核酶。
本發明的核酶通常由RNA構成，但這種核酶也可包含嵌合核酸序列。此外，核酶可經化學修飾以使核酶更加穩定和活性更強。
在本發明的優選實施方案中，調節或抑制神經細胞內TWEAK和/或TWEAK受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質是TWEAK受體拮抗劑。根據本發明，「拮抗劑」指通過置換生理活性神經遞質或其類似物但不誘導生理反應和/或信號轉導而封閉受體的物質。
在本發明的優選實施方案中，所述拮抗劑的分子量低於2000g/mol，優選低於1000g/mol，特別優選低於750g/mol，最優選低於500g/mol。
在本發明的優選實施方案中，調節或抑制神經細胞內TWEAK和/或TWEAK受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質是TWEAK受體的可溶性部分。本發明所述的TWEAK受體的可溶性部分應理解為是TWEAK受體或其功能等價物的一部分，該部分能夠結合從而封閉TWEAK，但不能誘導生理反應和/或信號轉導。優選是TWEAK受體或其突變形式的N-末端部分。TWEAK受體的可溶性部分可用精通本領域的技術人員已知的方法製造，如蛋白水解消化或基因工程。
本發明所述的要治療的神經病症通常可分為三類具有缺血或缺氧機制的疾病(有病理生理機制)；神經變性疾病；和與神經細胞死亡有關的神經和精神疾病。
具有涉及缺血和/或缺氧病理生理機制的疾病可進一步分成中風(以及出血性中風)、復甦後的腦缺血、分娩中(intrapartal)缺氧、術中缺氧和/或缺血、和眼內缺血和/或缺氧。
神經變性疾病的例子包括中風、ALS、帕金森病、腦缺血、多發性硬化、精神分裂症、抑鬱、亨廷頓病、三核苷酸重複異常、外周神經病、痴呆、和CNS創傷。
伴有神經細胞死亡的神經細胞疾病的例子包括中風、ALS、帕金森病、腦缺血、心血管疾病復甦後的腦缺血、多發性硬化、精神分裂症、分娩中缺氧、術中缺氧和/或缺血、眼內缺血和/或缺氧、抑鬱、亨廷頓病、三核苷酸重複異常、外周神經病、痴呆、和CNS創傷。
還優選對本發明的物質進行修飾以增強其通過血腦屏障的能力或者改變其在腦組織內的分布係數。這種修飾的例子是加入蛋白質轉導結構域(PTD)或TAT序列(Cao等，(2002)J.Neurosci.225423-5431；Mi Z等，(2000)Mol.Ther.2339-347；Morris等，(2001)Nat Biotechnol 191173-1176；Park等，(2002)J Gen Virol 831173-1181)。這些序列可以突變形式使用，並可在蛋白質的氨基或羧基末端添加其它胺基酸。
可用本領域已有的標準方法將本發明的上述物質製成藥物製劑，例如，可加入藥學上可接受的載體(或賦形劑)。載體或賦形劑可以是固體、半固體或液體物質，它們可作為活性成分的運載體或介質。可根據所選產品的特性、要治療的疾病或病症、疾病或病症的階段以及其它相關情況選擇合適的給藥形式和模式(Remington′sPharmaceutieal Sciences，Mack Publishing Co.(1990))。藥學上可接受的載體或賦形劑的比例和性質可由所選物質的溶解度和化學特性、選擇的給藥途徑以及標準藥物實踐來確定。藥物製品可以適合口服、腸胃外或局部使用，並且可以片劑、膠囊、栓劑、溶液劑等形式給予患者。
在優選的實施方案中，所述藥物還可含有一種或多種其它因子。本發明所述的「其它因子」是進一步支持藥物的有益作用的任何物質。在任何製品的靜脈內應用中添加緩激肽或類似物質將支持其遞送至大腦或脊髓(Emerich等，(2001)ClinPharmacokinet 40105-123；Siegal等，(2002)Clin Pharmacokinet 41171-186)。也可使用抗凋亡劑或有助於通過血腦屏障的試劑。精通本領域的技術人員熟悉有利於各種疾病的治療的其它因子。
在優選的實施方案中，本發明涉及鑑定調節或抑制TWEAK的表達或活性的物質的方法，該方法包括在模擬中風的條件下培育神經細胞培養物，使細胞接觸一種物質，和將這些細胞的TWEAK基因表達水平與未接觸上述物質但在相同條件下培育的細胞的TWEAK基因表達水平進行比較。
可通過，例如，凋亡誘導物質、亨廷頓蛋白的表達或氧氣-葡萄糖剝奪來產生「模擬中風的條件」。測量基因表達的方法是精通本領域的技術人員熟知的。
用這些方法鑑定出的物質可用來製造治療和/或預防神經和/或精神病症的藥物。
下面的圖闡述了本發明

圖1顯示了左(缺血；y軸)和右(非缺血；x軸)半球相比的MPSS實驗結果。給出了鑑定出的信號(signature)的發生頻率。鑑定出的TWEAK信號(「GATCCCTGTGGATTTTG」)的頻率為，缺血半球為41，而對側非缺血半球為0(箭頭；p＝1.1210-12)。測序的信號總數為，左半球174812，右半球161809。
圖2顯示了通過定量PCR測得的腦缺血20小時後同側的tweak特異性上調是損傷側的3倍以上。誤差棒表示連續稀釋測定的標準差。
實施例用MPSS技術鑑定出TWEAK是在MCAO模型(一種有效的嚙齒類中風模型)中上調的序列。腦缺血期間基因表達的變化對於缺血病理生理學和中風後果是重要的。因此我們認為，TWEAK是中風以及具有與中風相同的中樞神經機制的其它神經病症如神經變性的重要的新藥理學靶。
用於實施例的方法缺血模型使用中風的中腦動脈閉塞模型(MCAO)。小鼠用70％N2O、30％O2和1％氟烷麻醉。準備頸外動脈並插入5-0尼龍絲。將動脈旋轉180°，使尼龍絲伸入頸內動脈直至大腦中動脈。將5-0尼龍絲的頂端鈍化。用雷射都卜勒流速計(Perimed，瑞典)監測成功的閉塞。閉塞90分鐘後進行20小時再灌注。然後通過深度麻醉殺死動物並用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)進行經心臟(transcardial)灌注。用酸性苯酚萃取進一步處理前腦半球(除去小腦、嗅球和腦幹)以得到RNA。
MPSS表達分布為得到表達分布，合併6個動物大腦半球(同側和對側)的RNA以降低基因表達個體間差異的影響。大規模平行信號測序(MPSS，massively parallel signature sequencing)基本上按照描述進行(Brenner等，(2000)Nat.Biotechnol.，18630-634)，有一些修改。簡言之，在該方法中，RNA被轉變成cDNA並恢復3′最遠端的(3′-most)DpnII片段。體外克隆後將cDNA模板固定到分離的直徑5μm的玻璃珠上。將該加載的微珠置於流動的細胞中形成密集包裝的單層。通過連接介導的螢光測序法同時獲得游離模板兩端的短序列。得到的信號(14個鹼基)長度足以鑑定大多數(大於95％；比較Velculescu等，(1995)Science 270，484-7)個體cDNA。可將所有匹配序列聚集起來，排除假定的測序錯誤和序列多態性，以檢測一個以上基因(僅考慮非-EST或ESTEMBL資料庫)相匹配的信號。
為製備用於MPSS分析的cDNA文庫，在70℃用50pmol T7-標記的BsmBI-oligo-dT18V引物(GGC CAG TGA ATT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTG CAT TGAGAC GAT TCT TTT TTT TTT TTT TTT TTV)變性5μg總RNA，冰上冷卻，在總共25μL的1×反應緩衝液、10mM二硫蘇糖醇(所有試劑購自Invitrogen，Karlsruhe，德國)和0.5mM各種dNTP(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)中用200U SuperscriptII在42℃逆轉錄1小時。在最終體積為100μL的1×第二鏈緩衝液(Invitrogen)中加入40U DNA聚合酶I、2U RNA酶H、10U大腸桿菌DNA連接酶和0.5mM各種dNTP，16℃放置2小時合成第二鏈cDNA。在存在100mM NaOH時65℃水解RNA20分鐘。反應產物用苯酚氯仿純化並在存在PelletPaint(Calbiochem-Novabiochem，Bad Soden，德國)時用乙酸銨沉澱。
將雙鏈T7-標記的cDNA溶於12μL H2O，取6μL用T7 RNA Polymerase MegascriptKit(Ambion，Huntingdon，UK)按照製造商的說明進行體外轉錄。
用Rneasy柱(Qiagen，Hilden，德國)純化aRNA並定量。對於每個樣品，在與第一次合成相同的條件下(見上文)在存在1μg隨機六聚引物時逆轉錄8μg aRNA。第二鏈的合成通過線型PCR，用5′-生物素標記的BsmBI oligo-dT18引物(生物素-GACATGCTGCATTGAGACGATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT)和AdvantageTaq 2(ClontechGmbH；Heidelberg，德國)按照製造商的說明進行。
雙鏈擴增的cDNA用DpnII消化，3′DpnII片段用鏈黴抗生物素蛋白偶聯的順磁珠(Dynal Biotech，Hamburg，德國)分離，並用BsmBI消化從珠子上釋放。將DpnII/BsmBI雙鏈cDNA片段克隆入已用BbsI和BamHI消化的TAG載體(pLCV)以標記該片段。將DH1OB大腸桿菌(Invitrogen)電穿孔後，每個樣品可收穫106個獨立的克隆，提取含有標記的cDNA的質粒DNA。用PCR擴增質粒DNA中標記的cDNA，與帶有互補抗標記(antitag)的微珠(LYNX，Hayward，CA)混合。通過使該標記與抗標記雜交將標記的cDNA加載到微珠上。將加載有DNA的珠子加入流動的細胞中並按照描述(Brenner等，(2000)Nat.Biotechnol.，18630-634)在MPSS裝置(LYNX，Hayward，CA)上進一步處理。
統計學用得自Audic和Claverie(1997)，Genome.Res.，7986-995的等式(2)計算觀察到的信號頻率分布的統計顯著性。P值小於0.001被認為是顯著的。
定量PCR按照標準方法(Chomczynski和Sacchi(1987)，Anal.Biochem.，162，156-159)分離RNA，然後用Qiagen RneasyTM迷你試劑盒純化。MCAO 20小時後從損傷側的同側和對側獲得組織樣品。採用標準條件，用寡dT引物、superscript II逆轉錄酶(Gibco)從10μg總RNA合成cDNA。採用Lightcycler系統(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)，用DNA雙鏈的SYBR綠色染色進行定量PCR。循環條件如下95℃10分鐘，95℃5秒，65℃10秒，72℃30秒；87℃10秒，50輪。用以下參數完成解鏈曲線95℃冷卻至50℃；以0.2℃/秒升至99℃。使用以下引物對「mm tweak-144s」AAC GCT GTC TGC CCA GGAGCC，「mm tweak-305as」GGC CGA GGA TGA ACCTCA TAA TGG。用SYBR綠色母混合物(master mix)按照製造商的建議(RocheDiagnostics)進行LightcyclerPCR。通過解鏈溫度分析和瓊脂糖凝膠電泳確定產物的特異性。將樣品的cDNA含量標準化成親環蛋白的表達水平(引物「cyc5」ACC CCACCG TGT TCT TCG AC；「acyc300」CATTTGCCATGGACAAGATG)。標準化成親環蛋白後得到了相對調節水平，將其與偽處理(sham-operated)的動物進行比較。誤差棒表明了標準差，它們是從3倍連續稀釋的cDNA樣品計算出的，反映了測量的可靠性。
實施例2TWEAK對動物模型的效果可用大鼠的大腦中動脈閉塞動物模型(MCAO)評估TWEAK與中風的關係。簡言之，用70％N2O、30％O2和1％氟烷吸入麻醉動物。將PE-50聚乙烯管插入右股動脈以連續監測平均動脈血壓和血氣。在右股靜脈插入PE-50管用於治療性灌輸。實驗期間監測直腸溫度並用溫度控制的加熱墊(Fhr Medical Intruments，德國)使其維持在37℃。MCAO用插入頸總動脈並深入到頸內動脈的塗有矽的尼龍絲誘導。用在前囟點後方4mm和中線側方4mm處具有探頭的雷射都卜勒流速計(Perimed 4000，瑞典)控制成功的MAC閉塞。閉塞90分鐘後取出細絲以進行再灌注。可通過TTC染色和計算機輔助面積測量法(Image J)計算梗死體積。通過t檢驗計算統計學顯著性，p＜0.05的結果被認為是顯著的。
TWEAK可通過靜脈灌輸或直接顱內(例如，腦室內)灌輸給予。因此可在體內證實預測的對梗死結果的負面影響。為證明治療性幹預中風活化的TWEAK的作用的可行性，可給予中和抗體(例如，腦室內給予)。
實施例3建立尋找能干預TWEAK上調的新型神經保護物質的篩選系統採用上述通過腦缺血誘導TWEAK來篩選新的神經保護藥物具有吸引力。就這點而言，可利用具有神經特徵的細胞(例如，初級神經元、PC12細胞、SHSY5細胞等)建立細胞培養系統。可用腦缺血的體外模型-氧氣-葡萄糖剝奪(OGD)處理這種培養物。如上所述，可用定量PCR監測TWEAK的誘導，或者可採用含TWEAK啟動子的螢光素酶報告構建物。也可採用ELISA系統監測表達。然後可用不同濃度的感興趣的物質處理細胞，並篩選TWEAK產量的降低。同樣，也可監測和篩選TWEAK受體的表達。
實施例4測定TWEAK對神經細胞培養物的效果為監測細胞培養物中TWEAK活化的作用，可測定初級神經元培養物(或其它神經細胞)以了解TWEAK和TWEAK受體Fn14的細胞死亡促進活性。原代神經元培養物從大鼠胚胎E18切除皮質或海馬。組織在HBSS(BioWhitakker，Taufkirchen，德國)中用10mg/ml胰蛋白酶、5mg/ml EDTA/DNA酶(Roche diagnostics，Mannheim，德國)解離。用4份含有1X B-27添加物(Invitrogen，Karlsruhe，德國)、0.5mM L-穀氨醯胺和25μM穀氨酸鹽的神經基(neurobasal)培養基終止消化。離心後將沉澱溶於5ml培養基，以24孔板每孔250,000個細胞的密度將細胞接種在塗布有聚-L-賴氨酸的蓋玻片上。為用NO-供體NOR3(Sigma)處理，21天後在培養物中用升高濃度的NOR-3處理神經元24小時。然後加入升高濃度的TWEAK。也可加入TWEAK或TWEAK受體的拮抗劑。可採用各種方法讀取神經元細胞的死亡。例如，可用Western印跡測定PARP切割。PARP切割的Western印跡從平板上刮下原代神經元，用含有2.5mg/ml胃蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich，Seelze，德國)和抑肽酶(1∶1000，Sigma-Aldrich)的冰冷的PBS洗滌兩次。將沉澱重懸於1體積2％SDS(40μl)，並加入5μlbenzonase溶液(40μl 100mM MgCl2和9μl benzonase，Roche Diagnostics，Mannheim，德國)。溶解後加入1體積PBS測定蛋白質濃度(BCA檢驗，Pierce，Rockford，IL，USA)。95℃變性5分鐘後取100μg在8％SDS-聚丙烯醯胺凝膠上跑電泳。用半乾印跡室(Whatman Biometra，Gttingen，德國)將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(ProtanBA79，SchleicherSchuell，Dassel，德國)。印跡用PBS/0.02％Tween 20配製的5％乳粉封閉，用PBS/0.02％Tween 20洗滌三次，與第一抗體(抗-切割的-PARP-抗體，Cell Signalling，1∶1000)室溫培育1小時。洗滌後，將印跡與第二抗體(抗-兔-抗血清HRP-偶聯抗體或抗-小鼠-抗血清HRP-偶聯抗體，Dianova，Hamburg，德國，1∶4000)室溫培育1小時。信號用超級信號化學發光系統(Pierce，Rckford，USA)檢測，並暴露於Hyperfilm-ECL(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)。PARP切割物可採用Windows ImageJ vl.29(http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)在掃描放射自顯影照片上定量測定。
或者，可採用細胞死亡ELISA(Roche diagnostics)、LDH試驗、胱冬酶glo試驗(Promega)、或者用來測定細胞死亡或細胞存活的任何其它試驗，這些方法都是精通本領域的技術人員已知的。
序列表110阿克薩隆生物科學股份公司(AXARON Bioscience AG)120TWEAK調節劑和抑制劑在治療神經病症中的應用130BL62630PC150EP 04004094.11512004-02-231604170PatentIn version 3.12101211249212PRT213智人(Homo sapiens)220
221MISC_FEATURE222(1)..(249)223
220
221MISC_FEATURE222(1)..(249)223TWEAK4001Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro1 5 10 15Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu20 25 30Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala35 40 45Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala G1n Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu50 55 60Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Ash Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp65 70 75 80
Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro85 90 95Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu100 105 110Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly115 120 125Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu130 135 140Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu145 150 155 160Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr165 170 175Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu180 185 190Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg195 200 205Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu210 215 220Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu225 230 235 240Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His24521022111306212DNA213智人(Homo sapiens)220
221misc_feature222(1)..(1306)223TWEAK
4002cacagccccc cgcccccatg gccgcccgtc ggagccagag gcggaggggg cgccgggggg60agccgggcac cgccctgctg gtcccgctcg cgctgggcct gggcctggcg ctggcctgcc 120tcggcctcct gctggccgtg gtcagtttgg ggagccgggc atcgctgtcc gcccaggagc 180ctgcccagga ggagctggtg gcagaggagg accaggaccc gtcggaactg aatccccaga 240cagaagaaag ccaggatcct gcgcctttcc tgaaccgact agttcggcct cgcagaagtg 300cacctaaagg ccggaaaaca cgggctcgaa gagcgatcgc agcccattat gaagttcatc 360cacgacctgg acaggacgga gcgcaggcag gtgtggacgg gacagtgagt ggctgggagg 420aagccagaat caacagctcc agccctctgc gctacaaccg ccagatcggg gagtttatag 480tcacccgggc tgggctctac tacctgtact gtcaggtgca ctttgatgag gggaaggctg 540tctacctgaa gctggacttg ctggtggatg gtgtgctggc cctgcgctgc ctggaggaat 600tctcagccac tgcggccagt tccctcgggc cccagctccg cctctgccag gtgtctgggc 660tgttggccct gcggccaggg tcctccctgc ggatccgcac cctcccctgg gcccatctca 720aggctgcccc cttcctcacc tacttcggac tcttccaggt tcactgaggg gccctggtct 780ccccacagtc gtcccaggct gccggctccc ctcgacagct ctctgggcac ccggtcccct 840ctgccccacc ctcagccgct ctttgctcca gacctgcccc tccctctaga ggctgcctgg 900gcctgttcac gtgttttcca tcccacataa atacagtatt cccactctta tcttacaact 960cccccaccgc ccactctcca cctcactagc tccccaatcc ctgacccttt gaggccccca 1020gtgatctcga ctcccccctg gccacagacc cccagggcat tgtgttcact gtactctgtg 1080ggcaaggatg ggtccagaag accccacttc aggcactaag aggggctgga cctggcggca 1140ggaagccaaa gagactgggc ctaggccagg agttcccaaa tgtgaggggc gagaaacaag 1200acaagctcct cccttgagaa ttccctgtgg atttttaaaa cagatattat ttttattatt 1260attgtgacaa aatgttgata aatggatatt aaatagaata agtcag 13062103211129212PRT213智人(Homo sapiens)220
221misc_feature222(1)..(129)223TWEAK受體/Fn 144003Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu G1y1 5 10 15Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly20 25 30Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys35 40 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys50 55 60Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro65 70 75 80Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser85 90 95Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr100 105 110Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile115 120 125Gln2104211998212DNA213智人(Homo sapiens)220
221misc_feature222(1)..(998)223TWEAK受體/Fn 144004gcggcgggcg cagacagcgg cgggcgcagg acgtgcacta tggctcgggg ctcgctgcgc60cggttgctgc ggctcctcgt gctggggctc tggctggcgt tgctgcgctc cgtggccggg 120gagcaagcgc caggcaccgc cccctgctcc cgcggcagct cctggagcgc ggacctggac 180aagtgcatgg actgcgcgtc ttgcagggcg cgaccgcaca gcgacttctg cctgggctgc 240gctgcagcac ctcctgcccc cttccggctg ctttggccca tccttggggg cgctctgagc 300ctgaccttcg tgctggggct gctttctggc tttttggtct ggagacgatg ccgcaggaga 360gagaagttca ccacccccat agaggagacc ggcggagagg gctgcccagc tgtggcgctg 420atccagtgac aatgtgcccc ctgccagccg gggctcgccc actcatcatt cattcatcca 480ttctagagcc agtctctgcc tcccagacgc ggcgggagcc aagctcctcc aaccacaagg 540ggggtggggg gcggtgaatc acctctgagg cctgggccca gggttcaggg gaaccttcca 600aggtgtctgg ttgccctgcc tctggctcca gaacagaaag ggagcctcac gctggctcac 660acaaaacagc tgacactgac taaggaactg cagcatttgc acaggggagg ggggtgccct 720ccttccttag gacctggggg ccaggctgac ttggggggca gacttgacac taggccccac 780tcactcagat gtcctgaaat tccaccacgg gggtcaccct ggggggttag ggacctattt 840
ttaacactag gggctggccc actaggaggg ctggccctaa gatacagacc cccccaactc900cccaaagcgg ggaggagata tttattttgg ggagagtttg gaggggaggg agaatttatt960aataaaagaa tctttaactt taaaaaaaaa aaaaaaaa998
權利要求
1.調節或抑制神經細胞內TWEAK或TWEAK受體或者TWEAK和TWEAK受體的表達或活性、或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質在製造用於治療或預防或者治療和預防神經或精神病症或者神經和精神病症的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述物質是抗體。
3.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述物質是反義寡核苷酸。
4.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述物質是siRNA。
5.如權利要求3或4所述的應用，其特徵在於，所述物質由病毒載體或脂質體提供。
6.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述物質是消化TWEAK的核酶。
7.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述物質是TWEAK受體拮抗劑。
8.如權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述拮抗劑的分子量小於1000g/mol。
9.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述物質是TWEAK受體的可溶性部分。
10.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述神經病症是至少一種選自以下的病症具有缺血或缺氧或者缺血和缺氧相關病理生理機制的神經病、神經變性疾病和伴有神經細胞死亡的神經系統疾病。
11.如權利要求10所述的應用，其特徵在於，所述神經病是至少一種選自以下的具有缺血或缺氧或者缺血和缺氧相關病理生理機制的神經病中風、復甦後的腦缺血、分娩中缺氧、術中缺氧或缺血或者術中缺氧和缺血、以及眼內缺血或缺氧或者眼內缺血和缺氧。
12.如權利要求10所述的應用，其特徵在於，所述神經變性疾病是至少一種選自以下的疾病中風、ALS、帕金森病、腦缺血、多發性硬化、精神分裂症、抑鬱、亨廷頓病、三核苷酸重複異常、外周神經病、痴呆和CNS創傷。
13.如權利要求10所述的應用，其特徵在於，所述伴有神經細胞死亡的神經系統疾病是至少一種選自以下的疾病中風、ALS、帕金森病、腦缺血、心血管疾病復甦後的腦缺血、多發性硬化、精神分裂症、分娩中缺氧、術中缺氧或缺血或者術中缺氧和缺血、眼內缺血或缺氧或者眼內缺血和缺氧、抑鬱、亨廷頓病、三核苷酸重複異常、外周神經病、痴呆和CNS創傷。
14.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述藥物還含有一種或多種其它因子。
15.一種鑑定調節或抑制TWEAK的表達或活性的物質的方法，所述方法包括a)在模擬中風的條件下培育神經細胞培養物，b)使細胞接觸該物質，c)將這些細胞的TWEAK表達水平與未接觸上述物質但在相同條件下培育的細胞的TWEAK表達水平進行比較。
16.一種採用調節或抑制神經細胞內TWEAK或TWEAK受體或者TWEAK和TWEAK受體的表達或活性、或者調節或抑制TWEAK受體的胞內信號傳導的物質來治療或預防或者治療和預防神經或精神病症的方法。
全文摘要
本發明涉及調節或抑制神經細胞內TWEAK的表達或活性的物質在製造用於治療和/或預防神經和/或精神病症的藥物中的應用。本發明還涉及調節或抑制TWEAK受體的表達或活性，或者調節或抑制TWEAK受體胞內信號傳導的物質在相同目的中的應用。此外，本發明包括鑑定調節或抑制TWEAK的表達或活性的物質的方法。
文檔編號A61K39/395GK1985169SQ200580005602
公開日2007年6月20日 申請日期2005年2月23日 優先權日2004年2月23日
發明者A·施奈德, M·羅斯納, G·沃格特, M·施瓦尼格 申請人:阿克薩隆生物科學股份公司