利用革蘭氏陽性菌表達重組蛋白質的製作方法

2023-06-06 18:40:01

專利名稱：利用革蘭氏陽性菌表達重組蛋白質的製作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及新的革蘭氏陽性菌表達載體系統的構建和用途。包含革蘭氏陽性菌表面多肽的氨基和羧基分選序列的蛋白融合體可被錨定在異源宿主表面。或者，重組蛋白可被分泌於生長基質中。該系統可用來超量生產和純化用於各種目的的重組蛋白質，包括診斷抗原和疫苗抗原及治療蛋白如激素和生長因子的商業規模生產，但並不限於此。
2.現有技術通過使用重組DNA技術已經使許多原核生物蛋白和真核生物蛋白的超量生產成為可能。向大腸桿菌中導入嵌合DNA分子已成為用來表達多種基因產品所選擇的方法。在利用基於大腸桿菌的蛋白生產系統背後，主要動力是這種宿主世代時間短、遺傳背景清楚。但是，儘管近些年來開發了許多高效的基於大腸桿菌的基因表達系統，最重要的令人觀注的還是有關產品的下遊處理過程。大腸桿菌中產生的重組蛋白不容易穿過外層細胞膜(OM)；因此，必須從細胞質或周質空間(PS)純化多肽。從這些細胞區室純化蛋白會有些困難。經常遇到的問題是產物收率低、潛在的有毒細胞物質(即內毒素)的汙染及大量形成部分摺疊的多肽鏈而成為非活性的聚集體，稱為包涵體。由於這些固有的純化困難，所以最近人們的注意力大多集中在許多革蘭氏陽性菌能將蛋白質輸出至它們的細胞壁之外這一性能上。儘管革蘭氏陽性菌的遺傳學性質不象大腸桿菌被闡明得那樣深入，但是，人們已經認識到這些微生物是用於生產重組蛋白更有利的候選宿主。
穿過革蘭氏陽性菌細胞質膜(CM)被輸出的蛋白質通常有兩種結局它們要麼被釋放(分泌)入細胞外環境，要麼仍錨定在細胞壁/膜上。最近開發的許多基於革蘭氏陽性菌的表達系統僅是依賴於蛋白輸出的前一途徑(即分泌)。在革蘭氏陽性菌表達系統中指導蛋白分泌的基本方法包括將靶蛋白與現時得到的革蘭氏陽性分泌系統的功能性N末端信號序列融合。目前為止，最常用的宿主均為芽孢桿菌屬。這群微生物已被用於工業，生產多種具有重要經濟學意義的蛋白質(Priest，細菌學綜述，41711(1977)；Glenn，微生物學年評，3041(1976))。最深入研究的革蘭氏陽性宿主-載體表達系統可能是基於解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(Ulmanen等，細菌學雜誌，162176(1985)；Palva等，美國國家科學院院刊，795582(1982)；Palva等，Gene，22229(1983)；Lundstrom等，病毒研究，269(1985))。然而，也開發了一些通用的基於其它革蘭氏陽性宿主的表達系統，如枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(美國專利4,824,782、5,171,673、4,711,843；WO專利8,605,812；Chang，S.，酶學方法，153507-516(1987))、乳球菌和乳桿菌屬類(U.S.專利5,242,821)、葡萄球菌屬類(Abrahmsen等，EMBO J.43901-3906(1986))、鏈黴菌屬類(U.S.專利4,745,056；JP專利2,002,379；EP352,707)和棒狀桿菌屬類(U.S.專利4,965,197；WO專利9,303,158)。
革蘭氏陽性分泌系統比傳統的基於大腸桿菌的表達系統具有一些優點。一個明顯的優點是輸出到細胞壁之外的蛋白質通常仍保持其天然構象。因此，人們可以充分利用已建立的基於活性蛋白功能性質的純化方法。此外，革蘭氏陽性表達系統通常能產生較高的蛋白收率，這些蛋白一般不含潛在毒性汙染的細胞物質。
但是，在純化胞外蛋白質時有一些實際操作上的限制。第一要考慮的是蛋白質的不穩定性。由許多革蘭氏陽性宿主分泌的重組蛋白質對由宿主編碼的細胞外蛋白酶產生的蛋白酶降解作用極為敏感。這類蛋白酶的存在能顯著影響蛋白收率。幸運的是，通過基因修飾宿主菌株降低胞外蛋白酶活性，在保持分泌蛋白存活力方面已經取得了顯著進步(Kawamura等，細菌學雜誌160442(1984)；U.S.專利5,084,383)。
當使用革蘭氏陽性分泌系統時所要考慮的另一個重要方面是大規模下遊處理過程的必備條件。人們普遍認為，從龐大體積的發酵液中純化重組蛋白質是一項極其耗時，昂貴的方法，從設備和人力角度而言均是如此。在這些情況下，使用革蘭氏陽性分泌系統只能是不切實際的，通常還是採用較廉價的基於革蘭氏陰性菌的表達系統。使用大腸桿菌作為替代的表達宿主，儘管具有潛在缺陷，但這一決定的作出是僅基於重組多肽與細菌細胞相關(即細胞內或周質中)由此一般而言更易於純化。因此，顯然，本領域所需要的是一種細菌表達系統，它結合了革蘭氏陽性(即蛋白分泌作用)和革蘭氏陰性(即蛋白區室化作用)系統兩者的顯著特點。一種新型而簡單的現有細菌表達系統的替代者將會是革蘭氏陽性系統的開發，它能將重組蛋白特定地錨定或直接附著在細胞壁表面。這種方式中錨定過程便成為純化過程的組成部分。例如，將含有附著於細胞表面的重組蛋白的細胞進行洗滌、收集、再懸浮於小體積溶液中，然後用特定試劑處理使所需蛋白釋放下來。在除去細菌細胞後，所得上清液中含高度富集蛋白產品。
革蘭氏陽性菌的細胞壁是一種複雜的細胞器，由肽聚糖、糖類和具有不同生物學性質的蛋白質裝配而成，表面蛋白與天然分泌的產物不同，因為表面蛋白會需要特定的分選信號，這些信號大概能使它們偏離蛋白輸出的正常缺失(default)途徑。儘管許多生物學上重要的革蘭氏陽性蛋白包括鏈球菌M蛋白、蛋白A和金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白被錨定在細胞表面，但革蘭氏陽性菌的細胞壁仍是一個相對未知的細胞區室。
雖然用作細菌分泌系統基礎的正常N-末端輸出信號已被廣泛特徵化(Abrahmsen等，EMBO J.，43901-3906(1985)；Heijne和Abrahmsen，FEBS Letters，244439-446(1989)；Pugsley，微生物學綜述5750-108(1993))，但指導(orchestrate)細胞蛋白質錨定於革蘭氏陽性細胞壁上的順式作用分選信號只是在最近才被闡明。至今遠遠多於50個革蘭氏陽性表面蛋白(除了枯草芽孢桿菌和肺炎葡萄球菌的蛋白)的序列對比已表明氨基-和羧基-末端分泌/錨定信號均存在。正如所預料的所有被測蛋白均含有N-端信號序列，該序列可能指導它們至細胞輸出機器。這些蛋白質的C末端包含一個主要為疏水的、電位跨膜區，隨後是一個帶電荷的尾部(Fischetti等，分子微生物學41603-1605；

圖1暗陰影區＝LP(X)TG(X)共有序列；淺陰影區＝羧基末端疏水的潛在的跨膜區；粗體字殘基＝帶電荷的蛋白質尾部；蛋白A＝金黃色葡萄球菌蛋白A；M6＝釀膿鏈球菌M6蛋白、WapA＝變異鏈球菌細胞壁相關蛋白A；M49＝釀膿鏈球菌M49蛋白；IgA-BP＝鏈球菌Ig-A結合蛋白；蛋白G＝鏈球菌蛋白G；Fn-BP＝葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白；T6＝鏈球菌T6蛋白；Pac＝變異鏈球菌表面蛋白；Wg2＝酪鏈球菌表面蛋白酶)。在疏水區之前是一個脯氨酸/甘氨酸富集區，已斷定此區呈β-摺疊片樣的構象跨越肽聚糖細胞壁。所有被測表面蛋白在此區內均具有近100％的保守六肽，共有序列為LP(X)TG(X)，其中X通常為Thr或Ser，有時為Gly、Lys或Asn(圖1)。C-末端序列元件的保守性(即LP(X)TG(X)基元、疏水跨膜區和帶電荷尾)表明，許多革蘭氏陽性菌屬均具有將多肽分選並錨定於細菌細胞壁的過程(Fischetti等，分子微生物學，41603-1605(1990)；Fischetti等，當今生物工程評論4603-610(1993))。
使用一個特徵已熟知的金黃色葡萄球菌表面蛋白蛋白A(Moks等，歐洲生物化學雜誌，156637-643(1986))作為模型系統，已經確證了通過序列對比分析鑑別出的羧基末端分選元件的功能重要性。單鏈多肽蛋白A含有兩個主要功能區。N-末端區域含一個36胺基酸信號肽序列，隨後為幾個具有免疫球蛋白結合活性的重複序列組件(E、D、A、B和C)。C-末端區域含保守分選信號，它們被認為負責將蛋白A錨定於細胞壁上(Guss等，歐洲生物化學雜誌，138413-420(1984)；Guss等，歐洲生物化學雜誌，143685(1984)；Fischetti等，分子微生物學，41603-160S(1990))。利用缺失分析，Schneewind等人(細胞，70267-281(1992))確證了金黃色葡萄球菌中蛋白A的正確分選需要3個所有的保守序列元件(即-LPETGE-基元、C-末端疏水區域和帶電荷尾部)。基於他們的這些結果，Schneewind等人(細胞，70267-281(1992))提出了下面的在將蛋白A以及可能許多其它革蘭氏陽性蛋白錨定於細胞表面過程中事件發生順序。首先，蛋白A的N-末端信號序列指導多肽進入普通分泌途徑(GSP)(閱讀請參見Pugsley，微生物學綜述，5750-108(1993)；Salmond和Reeves，生物化學動態187-12(1993))。在膜轉運過程中，C-末端帶電尾部的主要功能是阻止蛋白分泌入基質，蛋白A穿越膜的轉運可能導致C-末端分選信號的識別。識別之後，LPETGE(LPXTGX)基元在蘇氨酸(T)和甘氨酸(G)殘基間被特異切斷，然後所產生的N-末端蛋白片段被共價連接在金黃色葡萄球菌細胞壁上(Navarre和Schneewind，分子微生物學，14115-121(1994))。
由於革蘭氏陽性表面蛋白的錨定基元在多種分子和一些不同革蘭氏陽性菌屬中是保守的，那麼所要提出的一個合邏輯的問題是它是否有可能將一個熟知的表面蛋白錨定在異源革蘭氏陽性宿主的細胞壁上。Pozzi等人(微生物學研究，143449-457(1992))利用纖維(fibrillar)鏈球菌M蛋白首先提出了在異源革蘭氏陽性宿主中錨定蛋白的問題。從結構上來說，M蛋白由一個延伸的中心為繞線式α螺旋的螺旋棒組成，側翼為功能末端區域(圖2)(Phillips等，美國國家科學院院刊，784689-4693(1981)；Fischetti，臨床微生物學綜述，2285-314(1989))(圖2，(A)M6蛋白的結構示意圖；(B)M6蛋白分子的直線表示圖。此圖譜顯示出N-末端信號肽(S)、幾個重複區域(A、B、C和D)、含LPSTGE基元(LPXTGX)的Pro/Gly富集區、C-末端疏水的電位跨膜區(黑條塊)和帶電荷尾部(KRKEEN)。對輸出重要的氨基和羧基末端殘基以及M6蛋白的細胞壁分選/錨定序列被塗以陰影。錨定區沒按比例畫。)N-末端含有正確加工過程所需的42個殘基信號序列(Fischetti，臨床微生物學綜述，2285-314(1989)；Hollingshead等，生物化學雜誌，2611677-1686(1986))，而C-末端正如序列對比所確定的那樣，含有細胞分選和錨定必需的保守殘基(Fischetti)等，分子微生物學，41603-1605(1990)；Pancholi和Fischetti，細菌學雜誌，1702618-2624(1988)；圖1)。在無啟動子的emm-6.1基因被整合入人口腔共生格氏鏈球菌(S.gordonii)的染色體之後，表明了M6蛋白已被正確定位於異源宿主的細胞壁上(Pozzi等，微生物學綜述，143449-457(1992))。
下一個合邏輯的步驟是檢測為在革蘭氏陽性宿主表面表達重組蛋白利用M6分選信號的可能性。M6蛋白已被成功地進行了修飾，將幾個異源抗原如來自人乳頭瘤病毒16 E7型蛋白的序列、HIV-1gp120優勢免疫表位和白頭大黃蜂毒液主變應原呈遞至格氏鏈球菌表面(Pozzi等，感染和免疫，601902-1907(1992)；Pozzi等，疫苗，121071-1077(1994)；Medaglini等，美國國家科學院院刊，印刷中(1995))。在其細胞表面表達重組融合蛋白的革蘭氏陽性口腔共生菌已被用來激發對移生口咽部的外來抗原產生黏膜免疫應答和系統免疫應答(Fischetti等，當今生物工程評論，4603-610(1993)；Medaglini等，美國國家科學院院刊，印刷中(1995))。
這些最近的M6實驗結果均是重要的，有兩方面主要原因。第一，它們確證了下面的假設，即蛋白分選和錨定機制如果不具普遍性的話那麼也是存在於革蘭氏陽性細菌中的極為保守的過程。更重要的是，這些實驗證明了這樣的概念，即為構建將重組蛋白錨定於革蘭氏陽性菌宿主表面的新的表達系統而利用細胞壁蛋白分選信號是可能的。因此，考慮到上述現有技術中表達系統的缺陷，顯然本領域仍存在著構建和使用極好的革蘭氏陽性蛋白表達系統的需求。
發明簡述本發明的主要目的是開發能用於生產和純化重組蛋白的革蘭氏陽性菌表達系統。
作為一個具體實例，本發明另一目的是提供基於鏈球菌M6蛋白的SPEX系統的構建和使用(用於鏈球菌蛋白表達)。該系統允許基因操縱和蛋白質化學領域的技術人員從革蘭氏陽性宿主如人口腔共生格氏鏈球菌中表達和純化重組蛋白。
更具體而言，本發明提供了在革蘭氏陽性細菌中表達蛋白的方法，包括篩選異源宿主菌，該宿主為革蘭氏陽性菌，缺乏胞外蛋白酶生產，並能通過C-末端分選信號錨定表面蛋白；將質粒載體導入宿主，此載體包含革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白的氨基和羧基末端分選序列的編碼DNA片段、編碼所需蛋白產品的DNA片段以及在所選宿主中起作用的轉錄和翻譯控制序列；表達融合蛋白，此蛋白包含所需的蛋白產品、N-末端信號序列和C-末端分選序列，其中此被表達的蛋白錨定於宿主細胞表面；使用蛋白酶從宿主細胞表面切割下錨定蛋白；從上清液中純化被割的蛋白。本發明還提供了在革蘭氏陽性宿主中表達蛋白的另一種方法，其中所需蛋白產品被分泌入胞外空間，從上清液中純化此被分泌的蛋白質。
簡而言之，本發明描述了構建和使用革蘭氏陽性宿主/載體系統的通用方法，該系統利用表面蛋白的細胞分選信號將蛋白靶向附著於細胞壁上。為證明該系統的實用性，本發明還描述了幾個稱為SPEX的特化載體的構建，這些載體基於釀膿鏈球菌M6蛋白。它們將被用來在人口腔共生菌格氏鏈球菌這種革蘭氏陽性細菌中表達蛋白和肽。通過選擇合適的SPEX克隆載體能表達多種重組蛋白產品。可能存在幾種蛋白構型，如存在多組氨酸尾部和蛋白A IgG結合區域的結合、因子Xa或TEV蛋白酶切割位點以及細胞壁錨定區域LP(X)TG(X)。每個克隆載體都用作穿梭質粒，它允許在大腸桿菌中進行起始克隆，然後轉化入革蘭氏陽性宿主中，如天然感受態格氏鏈球菌V288(Challis)。根據所用的SPEX載體，重組蛋白質在被特異性蛋白酶切割後可從錨定狀態純化或者從培養基中純化。
根據前述內容和其它目的，後敘內容可顯見的本發明的優點和特點，通過參照下面詳述的本發明優選實施方案及附帶的權利要求，會進一步明確本發明實質。
附圖簡述圖1描繪了所選擇的一組革蘭氏陽性表面蛋白的C-末端殘基間的對比。
圖2描繪了釀膿鏈球菌M6蛋白的功能區。
圖3描繪了釀膿鏈球菌emm6基因和相鄰DNA區的核苷酸序列。
圖4是構建SPEX載體的示意圖。每個質粒的pBLUESCRIPT(Apr)骨架未示出。
圖5描繪了用於錨定表面蛋白生產和重組蛋白純化的可能的SPEX盒。
圖6描繪了用於重組蛋白分泌和純化的可能的SPEX盒。
圖7描繪了用於整合的M6融合蛋白表達的一些可能的格氏鏈球菌菌株。
圖8描繪了將M6融合蛋白整合入格氏鏈球菌染色體。
優選實施方案的詳細描述具體來講，本發明涉及新的革蘭氏陽性表達系統的構建和使用的通用方法。由此處所述的表達系統生產的蛋白質可以直接從細胞表面純化或者直接從分泌後的上清液中純化。例如，本發明也描述了基於熟知的釀膿鏈球菌M6蛋白的表達系統。稱為SPEX(用於鏈球菌蛋白表達)的表達系統利用人口腔共生的格氏鏈球菌作為這組微生物的模型宿主。
A.通用方法構建革蘭氏陽性表達系統時首先要考慮的主要因素是確定使用哪一種細菌作為宿主。本發明中有效的宿主應該是一種革蘭氏陽性細菌，它能通過C-末端分選信號錨定表面蛋白。這種革蘭氏陽性細菌包括氣球菌屬、雙歧桿菌屬、類球菌屬(Corprococcus)、異常桿菌屬、異常球菌屬、腸球菌屬、孿生球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、海球菌屬、蜜蜂球菌屬、微球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、消化鏈球菌屬、動性球菌屬、瘤胃球菌屬、糖球菌屬、鹽水球菌屬、Carcina、葡萄球菌屬、口腔球菌屬、鏈球菌屬、Trichococcus和漫遊球菌屬，但不限於這些屬。為從本發明獲得最好效果，細菌宿主應缺乏胞外蛋白酶的生產。
本發明中較優選的用作表達宿主的菌種為格氏鏈球菌。最優選的菌株是蛋白酶缺乏變異體V288(Challis)。
其次要考慮的主要因素是用作構建表達載體基礎的革蘭氏陽性細胞壁蛋白的選擇。幾乎所有的革蘭氏陽性菌表面分子都具有氨基和羧基末端分選信號，這些信號能特異地將分子靶向定位以附著於細胞壁(Fischetti等，分子微生物學，41603-1605(1990))。可以使用任何一種含合適分選信號的革蘭氏陽性表面蛋白構建實施本發明所用的表達系統。這種分選信號可被本領域技術人員很快識別。表面蛋白來源包括，革蘭氏陽性菌屬如氣球菌屬、雙歧桿菌屬、Corprococcus、異常桿菌屬、異常球菌屬、腸球菌屬、孿生球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、海球菌屬、蜜蜂球菌屬、微球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、消化鏈球菌屬、動性球菌屬、瘤胃球菌屬、糖球菌屬、鹽水球菌屬、Carcina、葡萄球菌屬、口腔球菌屬、鏈球菌屬、Trichococcus和漫遊球菌屬。
用於本發明的較優選蛋白質是釀膿鏈球菌的M6型蛋白。來自釀膿鏈球菌的M6型蛋白的結構基因已被克隆(Scott和Fischetti科學，221758-760(1983))，並且完整核苷酸序列已被確定(Hollingshead等，生物化學雜誌，2611677-1686(1986))。此序列示於圖3。所推測的M6胺基酸殘基示於DNA序列下面。假定的核糖體結合位點(RBS)被框起來，信號肽(-42至-1)下劃線。成熟多肽表示+1至441殘基。未塗陰影的長條形表示Pro/Gly富集的細胞壁區域。LPXTGX(LPSTGE)基元粗體字表示。相鄰的淺陰影長條形代表疏水的跨膜區，暗陰影長條形表示C-末端帶電荷的尾部。相關的限制酶切位點示於DNA序列上方。轉錄終止子示為箭頭指示的反向重複結構。
接著要考慮的是所選宿主中細胞壁蛋白的編碼DNA序列的分離和特徵化。用於構建和篩選基因組文庫(即質粒、粘粒、噬菌體或YAC)以分離合適的蛋白編碼序列的方法以及確定其核苷酸序列的技術是基因工程領域技術人員所熟知的。參見，如Sambrook，Fritsch Maniatis，分子克隆實驗指南第二版(1989)；Maniatis，Fritsch Sambrook，分子克隆實驗指南(1982)和Griffin Griffin PCR技術現代新技術(1994)。
利用本領域熟知的重組DNA技術可以分離出編碼表面蛋白氨基和羧基末端分選信號的DNA片段。這些片段可在大腸桿菌克隆載體如pUC18/19或任意一個合適的質粒元件上裝配。N-末端信號應該包括一個完整的前導序列以及來自成熟蛋白N-末端的多個胺基酸殘基。這些序列的存在能確保進入細胞輸出器的正確靶向並能在實際的轉運過程中校正加工過程。C-末端分選(即錨)信號應包括LPXTGX基元(其中X是任意胺基酸殘基)、疏水跨膜區和帶電荷尾部。這種分選序列的對比示於圖1。對比序列左側塗有暗陰影的序列表示LP(X)TG(X)共有序列，且蛋白質從這一序列被排列。對比序列右側淺陰影區表示羧基末端疏水的潛在跨膜區。粗體字的殘基表示帶電荷的蛋白質尾部。
為便於異源融合蛋白的構建，可將含有幾個限制性內切酶識別序列的DNA小片段放置於編碼氨基和羧基末端分選信號的DNA序列之間。這種多克隆位點(MCS)便於異源蛋白編碼序列的插入，並且表達時會產生符合讀框的蛋白融合體，這些融合體被錨定於革蘭氏陽性細胞壁表面。或者，也可構建缺失C-末端錨定信號的表達載體。這種情況下，蛋白融合體不是被定向於錨定而是被分泌入胞外空間。
本發明所述載體使本領域技術人員能生產出錨定於細胞表面的重組蛋白或者分泌入胞外空間的重組蛋白。不管靶蛋白的最終結果怎樣，所有載體均含有M6核糖體結合位點(RBS)、翻譯起始密碼子(ATG)和42個胺基酸的前導序列(-42至-1)(圖3，4和5)。此外，所有載體均含有成熟M6蛋白N-末端的一部分。以前的研究已證明成功的轉運需要成熟M蛋白N-末端多至122個胺基酸。但最近已證明正確處理過程和M6融合蛋白向細胞表面的轉運可能需成熟蛋白N-末端少至5個胺基酸殘基(Fischetti等，當今生物技術評論.4603-610(1993))。用於本發明實驗中的M6氨基末端殘基的優選數目是58個，包括殘基-42至+16(圖3)。
用於本發明優選的C-末端分選信號也來自釀膿鏈球菌的6型M蛋白。為錨定蛋白設計的載體包括M6 C-末端殘基302至441、終止密碼子(TAA)和下遊序列，其含有一個推測的轉錄終止子(圖3)。為分泌蛋白設計的載體不含M6C-末端分選信號。
本發明表達載體系統適於超量生產和純化任意所需蛋白質。起碼本發明表達載體能用於超量生產和純化重組蛋白或肽。這些蛋白或肽可用於任何目的，例如，它們可用來生產診斷和疫苗抗原及治療用蛋白質，如激素和生長因子等等。
為便於從革蘭氏陽性細胞壁上釋放出錨定的融合蛋白，可在表達載體中以基因工程的手段加入各種蛋白酶切割位點。可在載體中選擇性摻入這些特定序列，由此它們可緊接在N-末端信號肽的下遊或C-末端分選信號區的緊上遊。也可在兩個位置均插入切割位點。合適的蛋白酶包括菸草蝕刻(etch)病毒(TEV)蛋白酶、凝血酶、腸激酶和因子Xa，但不限於這些酶。
也可在表達載體中插入各種大小的物理上使融合蛋白遠離細胞表面的蛋白間隔區或連接區。這些分隔區不存在時，由於細胞壁的空間阻礙作用蛋白酶的切割效率可能會被降低。可在蛋白酶識別序列和C-末端分選信號區域間插入這些連接序列。
在本發明載體中可插入任何特定的蛋白酶切割位點。優選蛋白酶切割位點多於4個胺基酸殘基。本發明中使用的最優選蛋白酶是TEV NIa蛋白酶。TEV NIa蛋白酶切割一個特定的跨越7個胺基酸序列E-X-V/I/L-Y-X-Q*S/G(X可以是任何胺基酸殘基；Doughtery等，EMBOJ.，71281-1287(1988))的共有區切割位點，本發明優選切割位點是E-N-L-Y-F-Q*G(Parks等，生物化學年鑑，216413-417(1994))。通過基因工程手段可將TEV切割位點插入到融合構建物的任意位置；但是，優選位置緊鄰含LPXTGX基元的Pro/Gly富集區(參見圖5RBS＝M6核糖體結合位點；ATG＝起始密碼子；MCS＝多克隆位點(MCS)，黑色條塊＝跨膜區；實心三角形＝TEV(菸草蝕刻病毒)NIa蛋白酶的基因工程化切割位點；空白三角形＝因子Xa(IEGR/)切割位點；垂直小箭頭16＝推測的細胞信號蛋白酶切割位點，參見SPEX1b和SPEX1c)。在TEV識別序列和Gly/Pro富集錨定區之間加入蛋白間隔區可提高TEV NIa蛋白酶的效率。本發明優選間隔序列來自M6蛋白，含胺基酸殘基222至301(圖5；SPEX1d)。
蛋白酶處理之後，可使用本領域各種已知的方法純化釋放的蛋白質。適宜的純化方法包括透析、超濾、區帶離心、分子排阻層析、等電點沉澱、溶劑分級分離、電泳分離、熱沉澱、離子交換層析、親和層析等，但不限於這些方法。優選使用附加親和標記物的一步純化法。這些親和標記物，如蛋白酶切割位點可以任選地以基因工程手段插入融合蛋白的氨基末端區或羧基末端區。有用的親和標記物包括多組氨酸片段(HHHHHH)、蛋白A的IgG結合區和穀胱甘肽S-轉移酶(GST)，但不限於這些。利用金屬螯合(如Ni-瓊脂糖)柱層析、蛋白A-瓊脂糖凝膠柱層析和穀胱甘肽-瓊脂糖凝膠柱層析能使從革蘭氏陽性宿主表面釋放的重組蛋白很容易地在一步中得到純化。通過插入蛋白酶切割位點能容易地除去N-末端信號和親和標記序列，所述酶切割位點與用來從細胞表面除去蛋白質的識別序列不同。
本發明優選的親和標記物是順序連接的6至10個組氨酸殘基(HHHHHH)。已表明有6個胺基酸殘基的多組氨酸標記物免疫原性差、幾乎不影響蛋白質功能和結構。可在蛋白質的氨基末端或羧基末端以基因工程手段插入此多組氨酸親和標記物。本發明中優選位點緊鄰N-末端M6序列下遊(圖5)。
通過基因工程手段插入另一個蛋白酶切割位點可從純化的蛋白質上移去N-末端M6和親和標記物序列。本發明中優選的酶是因子Xa。優選位置緊鄰親和標記物下遊(圖5)。
為了高效表達編碼融合蛋白的重組基因，應優選包括調節序列，它能確保充分的轉錄和翻譯。這些載體應含有在所選革蘭氏陽性宿主中起作用的轉錄控制序列(即啟動子)和翻譯控制序列(即核糖體結合位點)。
多種啟動子可任選地被用於本發明實驗中。這些本領域技術人員已知的調節序列包括來自革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的異源啟動子。這些調節序列能在應答化學或物理刺激時引起基因表達的啟動或關閉。或者，也可使用組成型表達的啟動子元件。
基因劑量是可變的，已表明它對一些細菌表達系統中蛋白質的生產可能有影響。一般來說，多拷貝質粒中出現的基因會產生較高的蛋白質水平。用於本發明重組蛋白表達的質粒應該能在所選的革蘭氏陽性宿主中穩定複製。這些複製拷貝數高或者低的質粒對本領域技術人員而言是熟知的。
本發明中，質粒連接的重組基因表達中使用的染色體外因子可任選地含有用於選擇目的的合適的遺傳標記。合適的遺傳標記包括各種抗生素和重金屬抗性基因以及營養決定簇(nutritional determinants)。但也可使用其它具有選擇性特點的基因。理想的選擇性標記應該在大腸桿菌和革蘭氏陽性宿主中均能被表達。這就允許在大腸桿菌中進行起始克隆，隨後將此重組質粒轉移入革蘭氏陽性宿主中。並且，為便於異源DNA片段的插入，質粒還應含有符合讀框的包括有用限制性內切酶切割位點的多接頭或MCS。
將重組質粒導入非可轉化(nontransformable)宿主的技術是本領域技術人員熟知的。這些方法包括電穿孔(Dower，在基因工程-原理和方法第12卷，第275-296頁(1990))、化學轉化、接合、轉導等等，但不限於這些。通過轉化作用可將重組DNA容易地導入那些呈天然感受態的革蘭氏陽性菌種中。
多拷貝質粒上某些基因的存在偶而會引起毒性，且某些情況下會導致細胞死亡。通過簡單地降低要表達的決定簇(determinant)的拷貝數，可多倍降低這些基因產品的毒性效果。通過將編碼融合產品的基因穩定地直接整合入宿主染色體中可容易地達到這一結果。通常用來產生單拷貝原核表達組件的遺傳方法包括同源重組、位點特異重組和非常規(轉座)重組。
本發明優選的基因表達方法包括將重組SPEX構建物整合入格氏鏈球菌染色體中。用作表達宿主的格氏鏈球菌株包括GP230(Pozzi等，微生物學研究143449-457(1992))、GP232(Pozzi等，感染和免疫，601902-1907(1992))和GP251(Pozzi等，疫苗，121071-1077(1994)；圖7emm-6是釀膿鏈球菌6M型蛋白的結構基因。ermC和cat基因分別編碼紅黴素和氯黴素抗性。被插入(框起來的)序列旁邊的細線表示格氏鏈球菌染色體。被整合的序列位於染色體格氏鏈球菌強啟動子(P)下遊)。這些菌株包含已通過同源重組被整合入格氏鏈球菌強啟動子下遊的遺傳盒。本發明中，這些盒提供了同源側翼區，允許本領域技術人員用體內構建的重組SPEX質粒置換GP230、GP232和GP251上的序列。
下述實施例是為了更詳細地說明本發明優選實施方案。但是，在任何意義上它們都不應被解釋為限制本發明的寬範圍。
實施例1SPEX質粒的構建A.錨定型載體通過將含有無啟動子的emm-6基因和紅黴素抗性編碼基因(ermC；Horinouchi和Weisblum.，細菌學雜誌，150804-814(1982))的來自pVMB3(Pozzi等，Res.Microbiol.143449-457(1992))的3.4kb ClaI片段亞克隆入質粒pBLUESCRIPT，構建出質粒pVMB20(Pozzi等，感染和免疫601902-1907(1992))。通過KpnI和HinDIII消化作用移去emm-6基因的545bp的內部區，並用含有合成的多克隆位點(MCS)的DNA小片段置換。所得質粒稱為pSMB55(圖4)，含有M6蛋白的N-端起始122個胺基酸和C-末端最後140個胺基酸的編碼序列。編碼異源蛋白序列的DNA片段被插入到pSPEX1a或pSPEX2a的MCS，與M6 N-端和/或C-端序列一起形成符合讀框的融合體。從pSMB55的ermC決定簇之內移去SacI-HpaI片段並用含編碼卡那黴素抗性的aphIII基因(Trieu-Cuot和Courvalin，基因，23331-341(1983))的片段置換。所得質粒稱為pSMB113(圖4)。
質粒pSMB104帶有編碼M6Δ104的emm-6Δ104基因，其中M6Δ104是一種含有前16個N-端胺基酸和後220個C-端胺基酸的蛋白質(Pozzi，G.，未公開的數據)。pSMB104的ClaI-KpnI片段被用來替換pSMB113中存在的ClaI-KpnI片段。所得質粒載體稱為pSPEX1a(圖4)，可被用於構建含有M6蛋白N-端58個胺基酸和C-端140個胺基酸的蛋白融合體。當這些蛋白融合體在適當的革蘭氏陽性宿主中被表達時，會被錨定在細菌細胞表面(圖5)。
B.分泌型載體pSPEX1a中HindIII-SacI片段的缺失能有效除去M6蛋白C-末端分選信號。所得質粒稱為pSPEX2a，保留有蛋白轉位和加工過程必需的M6 N-末端58個胺基酸(圖4)。因此，與pSPEX2a形成的蛋白融合體會被分泌入生長培養基中。可分別插入TEV蛋白酶切割位點和多組氨酸標記物以便於除去非必需蛋白序列和進行純化(圖6RBS＝M6核糖體結合位點；ATG＝起始密碼子，Term＝終止密碼子；三角形＝TEV(菸草蝕刻病毒)NIa蛋白酶的基因工程切割位點；塗陰影殘基＝對正確加工過程和M6的分泌重要的殘基；豎直小箭頭＝推測的細胞信號肽酶切割位點)。
實施例2.在格氏鏈球菌中重組基因的表達本發明中，可從多拷貝質粒中表達編碼M6融合蛋白的重組基因。由於本發明中優選的表達宿主是格氏鏈球菌，可使用含有在多種鏈球菌屬中起作用的複製起點(oriV)的質粒(Horodniceanu等，抗微生物藥劑化療，10795-801(1976)；Clewell等，細菌學雜誌，117283-289(1974)；Behnke和Ferretti，質粒，4130-138(1980)；Macrina等，感染與免疫，28692-699(1980)；Macrina等，Gene 19345-353(1982))。或者，可以單拷貝形式表達重組基因，這些拷貝已被穩定插入格氏鏈球菌染色體中。
重組質粒在轉化過程中自然被線性化(Pozzi等，微生物學研究，141659-670(1990)；Pozzi等，感染和免疫，601902-1907(1992))，並且側翼同源片段的識別便於M6基因融合子與aphIII基因整合(圖8格氏鏈球菌受體株GP251上的cat基因賦予了氯黴素抗性)。根據Pozzi等人以前描述的方法(FEMS Microbiol Lett.，48189-194(1987))利用「多層」鋪平板技術篩選具卡那黴素抗性(由aphIII賦予)的重組格氏鏈球菌。然後對卡那黴素抗性轉化體評分紅黴素抗性(由ermC賦予)或氯黴素抗性(由cat賦予)的喪失(依賴於受體株)。所用抗生素濃度如下紅黴素5μg/ml，氯黴素5μg/ml，卡那黴素500μg/ml。Kmr(Cms或Ems)純化的基因組DNA的Southern印跡(Southern，分子生物學雜誌，98503(1975))；Southern，酶學方法，69152(1980))或PCR分析可被用來確立細菌染色體中表達盒的結構和拷貝數。
通過全細胞提取物的Western印跡分析可確定重組蛋白的生產(Towbin等，美國國家科學院院刊，764350(1979)；Towbin和Gordon，免疫學雜誌，72313(1984))。按照現有技術所述程序(Pozzi等，疫苗，121071-1077(1994))使用免疫螢光可檢測M6融合蛋白的表面表達。使用抗M6全分子的多克隆抗血清、直接抗M6特異性表位的單克隆抗體(Jones等，實驗醫學雜誌，1641226-1238(1986)；Jones和Fischetti實驗醫學雜誌，1671114-1123(1988))或直接抗被表達為融合蛋白的一部分的異源蛋白的抗血清，可檢測重組蛋白。
實施例3.從格氏鏈球菌中純化重組蛋白重組格氏鏈球菌生長於適宜的液體培養基中，如含卡那黴素的Todd Hewitt-酵母提取肉湯(THYEB)、腦心浸漬液(BHI)或胰腖豆腖培養液(TSB)，於37℃培養24小時或直至達到生長穩定期。離心此細菌培養物，根據重組蛋白的位置(錨定於細胞壁或被分泌於培養基)來保留細胞沉澱物或消耗的生長培養基以用於進一步分析。
收集含表面表達蛋白的格氏鏈球菌細胞，洗滌，並在蛋白酶抑制劑存在時將其再懸浮於最小量體積的PBS(150mM NaCl、16mMNa2HPO4、4mM NaH2PO4pH7.3)中。
通過力入TEV NIa蛋白酶，從細胞表面移去具有基因工程化蛋白酶切割位點的重組蛋白。在25-30℃溫育一段合適的時間後，離心除去細胞，並收集富集重組蛋白的上清液。將此上清液通過鎳螯合樹脂(ProBond，Invitrogen Corp.)柱或鎳次氮基三乙酸[Ni-NTA]瓊脂糖柱(Qiagen Inc.)可進一步純化那些含串聯組氨酸殘基的融合蛋白。洗滌之後，在溫和條件(即pH6.0)下使用咪唑梯度從柱上洗脫重組蛋白。用Bradfbrd的方法(Bradford，Anal.Biochem.，72248-254(1976))可測量純化蛋白的量。
SPEX2系列載體(圖6)的使用能產生融合蛋白，在生長過程中這些蛋白被分泌入環境培養基中。在除去細菌細胞後，保留消耗(spent)的生長培養基，將其用作純化所需產物的起始原料。如前所述，使用金屬螯合層析可純化重組蛋白質，並且用TEV NIa蛋白酶處理可除去非必需N-末端殘基。
雖然這裡通過參照各種具體的材料、方法和實施例已對本發明進行了描述和說明，該認識到本發明不限於為發明目的所選擇的材料和方法的這些特定組合。可包括這類細節的多種變化，並會被本領域技術人員所理解。
權利要求
1. 一種在革蘭氏陽性細菌中表達所需蛋白質的方法選擇一種異源細菌宿主，此宿主是革蘭氏陽性菌並能通過C-末端分選信號錨定表面蛋白；將質粒載體導入宿主，此載體包含編碼革蘭氏陽性細胞表面蛋白氨基和羧基端分選序列及所需蛋白質的DNA片段，以及在所選宿主中起作用的轉錄和翻譯控制序列；表達融合蛋白，此融合蛋白含所需蛋白、N-末端信號序列和C-末端分選序列，其中被表達的融合蛋白錨定於宿主細胞表面；使用蛋白酶從宿主細胞表面切割下被錨定的蛋白；回收並純化切割下的蛋白。
2.根據權利要求1的方法，其中宿主選自氣球菌屬、雙歧桿菌屬、Corprococcus、異常桿菌屬、異常球菌屬、腸球菌屬、孿生球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、海球菌屬、蜜蜂球菌屬、微球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、消化鏈球菌屬、動性球菌屬、瘤胃球菌屬、糖球菌屬、鹽水球菌屬、Carcina、葡萄球菌屬、口腔球菌屬、鏈球菌屬、Trichococcus或漫遊球菌屬。
3.權利要求1的方法，其中宿主來自鏈球菌屬。
4.根據權利要求1的方法，其中宿主是格氏鏈球菌。
5.權利要求1的方法，其中宿主是格氏鏈球菌V288(Challis)、GP230、GP232或GP251。
6.權利要求1的方法，其中宿主胞外蛋白酶的產生缺陷。
7.權利要求1的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白來自氣球菌屬、雙歧桿菌屬、Corprococcus、異常桿菌屬、異常球菌屬、腸球菌屬、孿生球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、海球菌屬、蜜蜂球菌屬、微球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、消化鏈球菌屬、動性球菌屬、瘤胃球菌屬、糖球菌屬、鹽水球菌屬、Carcina、葡萄球菌屬、口腔球菌屬、鏈球菌屬、Trichococcus或漫遊球菌屬。
8.權利要求7的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白是釀膿鏈球菌的6M型蛋白。
9.權利要求7的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白包括；含完整前導序列和成熟蛋白N-末端數個胺基酸殘基的N-末端信號序列；含LPXTGX基元的C-末端分選信號，其中X是任何一種胺基酸殘基，其處於Pro/Gly富集區；疏水跨膜區；和帶電荷尾部。
10.權利要求9的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白還包括具有至少一種限制性內切酶識別序列的(多克隆位點，MCS)，位於編碼氨基和羧基-末端分選信號的.DNA序列之間的DNA片段。
11.權利要求1的方法，其中質粒載體進一步包括至少一個蛋白酶切割位點。
12.權利要求1的方法，其中蛋白酶是菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶、凝血酶、腸激酶或因子Xa。
13.權利要求9的方法，其中質粒載體還包含一個可變大小的蛋白間隔序列或連接序列，此序列物理上使融合蛋白遠離細胞表面。
14.權利要求13的方法，其中在蛋白酶識別序列和C-末端分選信號區域間摻入連接序列。
15.權利要求1的方法，其中通過親和標記物的使用一步法純化被切割蛋白。
16.權利要求15的方法，其中親和標記物是含有6至10個組氨酸殘基的多組氨酸片段、蛋白A IgG結合區域或穀胱甘肽S-轉移酶。
17.權利要求1的方法，其中使用金屬螯合柱、蛋白A-Sepharose柱、穀胱甘肽-Sepharose柱層析或其結合法純化被切割的蛋白。
18.權利要求1的方法，其中質粒載體還包括染色體外遺傳標記，此標記足以使表達該標記的宿主具有能被選擇的優點。
19.權利要求18的方法，其中遺傳標記為抗生素基因、重金屬抗性基因和營養決定簇。
20.權利要求18的方法，其中遺傳標記在大腸桿菌和革蘭氏陽性宿主中均能被表達。
21.權利要求18的方法，其中質粒載體還包含多接頭或多克隆位點，所述位點包括限制性內切酶切割位點。
22.權利要求7的方法，其中質粒載體包含序列M6核糖體結合位點編碼序列、翻譯起始密碼子(ATG)、42胺基酸前導序列(-42至-1)和成熟N-末端至少5個胺基酸的一部分。
23.權利要求22的方法，其中所編碼的N-末端部分包含殘基-42至+16。
24.權利要求1的方法，其中C-末端分選信號來自釀膿鏈球菌6型M蛋白。
25.權利要求1的方法，其中質粒載體還含有M6C-末端殘基302至441、終止密碼子(TAA)和包含轉錄終止子的下遊序列。
26.權利要求1的方法，其中質粒載體是pSPEX1a。
27.權利要求26的方法，其中pSPEX1a載體還包含一個具有多於4個胺基酸殘基的切割位點的蛋白酶。
28.權利要求26的方法，其中蛋白酶是TEV NIa蛋白酶，它切割一個特定的跨越7個胺基酸序列E-X-V/I/L-Y-X-Q*S/G的共有切割位點，其中X可以是任何胺基酸殘基。
29.權利要求28的方法，其中切割位點是E-N-L-Y-F-Q*G。
30.權利要求28的方法，其中切割位點鄰接包含LPXTGX基元的Pro/Gly富集區。
31.權利要求28的方法，其中在TEV蛋白酶識別序列和Pro/Gly富集的錨定區之間加入蛋白間隔臂。
32.權利要求31的方法，其中間隔臂來自M6蛋白並且由胺基酸殘基222至301組成。
33.一種在革蘭氏陽性細菌中表達所需蛋白質的方法，包括選擇異源的革蘭氏陽性細菌宿主；將質粒載體導入宿主，此載體包含編碼革蘭氏陽性細胞表面蛋白氨基和羧基末端分選序列以及所需蛋白的DNA片段，和在所選宿主中起作用的轉錄和翻譯控制序列；表達融合蛋白，此融合蛋白含所需蛋白和N-末端信號序列，其中被表達蛋白是從細胞中分泌的；從分泌後的上清液中純化蛋白產品。
34.權利要求33的方法，其中宿主選自氣球菌屬、雙歧桿菌屬、Corprococcus、異常桿菌屬、異常球菌屬、腸球菌屬、孿生球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、海球菌屬、蜜蜂球菌屬、微球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、消化鏈球菌屬、動性球菌屬、瘤胃球菌屬、糖球菌屬、鹽水球菌屬、Carcina、葡萄球菌屬、口腔球菌屬、鏈球菌屬、Trichococcus或漫遊球菌屬。
35.權利要求33的方法，其中宿主來自鏈球菌屬。
36.權利要求33的方法，其中宿主是格氏鏈球菌。
37.權利要求33的方法，其中宿主是格氏鏈球菌V288(Challis)、GP230、GP232或GP251。
38.權利要求33的方法，其中宿主胞外蛋白酶的生產缺陷。
39.權利要求33的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白來自氣球菌屬、雙歧桿菌屬、Corprococcus、異常桿菌屬、異常球菌屬、腸球菌屬、孿生球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、海球菌屬、蜜蜂球菌屬、微球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、消化鏈球菌屬、動性球菌屬、瘤胃球菌屬、糖球菌屬、鹽水球菌屬、Carcina、葡萄球菌屬、口腔球菌屬、鏈球菌屬、Trichococcus或漫遊球菌屬。
40. 權利要求39的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白是釀膿鏈球菌6型M蛋白。
41.權利要求39的方法，其中革蘭氏陽性細胞壁表面蛋白包含包含完整前導序列和成熟蛋白N-末端數個胺基酸殘基的N-末端信號序列；包含LPXTGX基元的C-末端分選信號，其中X是任何胺基酸殘基，它存在於Pro/Gly富集區；疏水性跨膜區；和帶電荷的尾部。
42.權利要求41的方法，其中質粒載體還包含具有至少一種限制性內切酶識別序列(多克隆位點，MCS)的位於編碼氨基和羧基末端分選信號的DNA序列之間的DNA片段。
43.權利要求41的方法，其中表達載體還包含一種可變大小的蛋白間隔臂或連接序列，此序列物理上使融合蛋白遠離細胞表面。
44.權利要求43的方法，其中在蛋白酶識別序列和C-末端分選信號區之間摻入了連接序列。
45.權利要求33的方法，其中質粒載體還含有染色體外遺傳標記，該標記足以使表達所述遺傳標記的宿主具有可被選擇的優點。
46.權利要求45的方法，其中遺傳標記是抗生素基因、重金屬抗性基因和營養決定簇。
47.權利要求45的方法，其中遺傳標記在大腸桿菌和革蘭氏陽性宿主中均能被表達。
48.權利要求45的方法，其中質粒載體還包含多接頭或具有限制性內切酶切割位點的多克隆位點。
49.權利要求39的方法，其中質粒載體包含M6核糖體結合位點編碼序列、翻譯起始密碼子(ATG)、42個胺基酸的前導序列(-42至-1)和成熟N-末端的至少5個胺基酸長的一部分。
50.權利要求49的方法，其中所編碼的N-末端部分包括殘基-42至+16。
51.權利要求33的方法，其中載體是SPEX2系列載體之一。
52.權利要求33的方法，其中使用金屬螯合層析純化重組蛋白。
53.權利要求33的方法，其中可用TEV NIa蛋白酶處理除去非必需的N-末端殘基。
全文摘要
一種用來在革蘭氏陽性菌中克隆和表達基因的新系統。此表達系統是基於如下發現:許多革蘭氏陽性菌通過順式作用N－末端信號序列和C－末端錨定區將蛋白分選至其細胞表面。具體而言,鏈球菌M6蛋白,一種熟知的表面分子,其細胞分選信號被用於構建革蘭氏陽性表達系統,稱之為SPEX(鏈球菌蛋白表達)。通過將目的基因克隆入合適的SPEX盒,然後將此盒穩定導入細菌宿主如人共生格氏鏈球菌而實現表達。根據所用的SPEX載體,重組蛋白在由特定的內切蛋白酶切割釋放之前可被錨定於細胞壁上或在細菌生長過程中被分泌入培養基中。使用缺失胞外蛋白酶的宿主細菌會保護分泌的蛋白不被蛋白酶降解。此系統中一些表達載體還生產被特異性標記的重組蛋白,使所得產物可一步純化。
文檔編號A61K38/00GK1192245SQ96195892
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月7日
發明者A·達爾針斯, S·懷特赫德, D·魯拜 申請人:洛克菲勒大學