水中病毒分離提取裝置及水中札幌病毒的提取方法
2023-08-02 16:12:51
水中病毒分離提取裝置及水中札幌病毒的提取方法
【專利摘要】水中病毒分離提取裝置及水中札幌病毒的提取方法，屬於水中病毒提取領域。本發明解決現有微生物過濾器存在容易漏氣的技術問題，並提供了一種提取效率高、提取產物幹擾少、提取產物適用於多種檢測平臺的水中札幌病毒提取方法。該裝置存儲罐設有穹頂，穹頂設有弧形縮口，頂蓋底端設有外翻沿，頂蓋由弧形縮口伸入並可通過密封圈卡在弧形縮口內，頂蓋頂端對稱設有耳座，耳座內裝有槓桿，出水管穿過穹頂伸入到存儲罐底部，進氣管與氮氣壓力罐連接，出水管與過濾器連接，過濾器與濾膜支架連接。方法：水樣過濾，用牛肉浸提物溶液洗脫，再等電點沉降法處理後離心，重溶後二次濃縮，再提取核酸；即完成了札幌病毒的提取。本發明用於分離提取水中病毒。
【專利說明】水中病毒分離提取裝置及水中札幌病毒的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於水中病毒提取領域；具體涉及水中病毒分離提取裝置及利用該裝置提取水中札幌病毒的方法。
【背景技術】
[0002]水中的病毒對人體健康的風險日益受到關注，對環境水體中病毒的檢測是預防疾病、評估水源衛生質量、環境衛生狀況的一項有價值的工作。
[0003]現有水中微生物過濾器的內膽與上蓋的重合性不好，隨壓力增大，上蓋的密閉性降低，容易漏氣。
[0004]病毒引起的胃腸疾病對人類有著極大的危害。札幌病毒(Sapovirus/SaV)是引起急性腹瀉的常見病毒，該病毒於1977年日本札幌地區腸道疾病暴發流行過程中被發現，SaV屬於杯狀病毒家族，由單鏈RNA構成無衣殼結構，在環境中可以穩定存在，能夠引起人胃腸疾病，其擁有極低的感染劑量，在感染後又具有極高的釋放量(達到每克糞便樣本IO11個病毒顆粒)。 [0005]目前，已有報導的病毒的傳播途徑包括被汙染的食物、水、人與人接觸和嘔吐氣濁物接觸。相對於細菌來說，病毒更加難以滅活和消除。這些病毒通常能夠在各種水樣中被監測到，如:汙水，河水，地下水，海水甚至飲用水。由這些水體中檢測病毒的存在與否，關鍵環節在於如何由水中將病毒分離提取出來。由於水中病毒的含量相對較低，且病毒顆粒較小，難以利用離心、過濾等分離細菌的常規富集方法收集。由於設備和提取方法的限制，水體中病毒的提取和檢出費時費力。
【發明內容】
[0006]本發明要解決現有微生物過濾器存在容易漏氣的技術問題；而提供一種密封性好、過濾水中病毒效果好，易於拆卸組裝，易於多次重複滅菌使用的的水中病毒分離提取裝置。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的水中病毒分離提取裝置包括氮氣壓力罐、存儲罐、過濾器和濾膜支架，所述的存儲罐包括罐體和頂蓋，罐體設有穹頂，穹頂設有弧形縮口，頂蓋底端設有外翻沿，密封圈置於外翻沿內，頂蓋由弧形縮口伸入並可通過密封圈卡在弧形縮口內，頂蓋頂端對稱設有耳座，耳座內裝有槓桿，槓桿包括一個「η」字形的提杆、兩個弧形的連接杆及兩個橫折形的支撐杆，所述提杆兩端與連接杆通過過渡圓弧連接，連接杆的另一端與支撐杆圓弧過渡連接，槓桿的支撐杆套在耳座內，支撐杆的底端可抵在穹頂上，過渡圓弧可抵在穹頂上，穹頂上分別設有壓力表、進氣管和出水管，存儲罐的進氣管與氮氣壓力罐連接，出水管底端穿過穹頂伸入到罐體底部，出水管頂端設有控制閥，控制閥與過濾器通過兩端連接快速接頭的導管連接，過濾器與濾膜支架通過兩端連接快速接頭的導管連接，濾膜支架設有放水管；所述濾膜支架內設有正電荷濾膜。
[0008]出水管底端面與存儲罐底部的距離為0.1~0.2mm,使分離水中病毒的效果好，分離的徹底。
[0009]密封圈的截面為圓形或橢圓形，使密閉性更好。
[0010]本發明中頂蓋通過槓桿將其由內向外卡在穹頂上，易於安裝拆卸，並且隨著存儲罐壓力變大，頂蓋與存儲罐結合更加緊密，因此，密閉性就更好，不易產生洩漏氣體的現象。
[0011]本發明採用的過濾器通過快速接頭與導管連接，可以根據不同水質需要組合濾芯種類和濾器數量，降低水樣水中雜質含量，降低濾膜因雜質幹擾帶來的損耗影響。
[0012]存儲罐即可採用消毒液浸泡滅菌也可採用高溫高壓滅菌，或採用兩種方法相結合滅菌，可以徹底消除二次汙染對分子診斷學檢測帶來的影響。
[0013]本發明的裝置結構簡單，構思巧妙。
[0014]另外，本發明又提供了一種提取效率高、提取產物幹擾少、提取產物適用於多種檢測平臺的水中札幌病毒提取方法。[0015]水中札幌病毒提取方法中利用上述的裝置進行過濾、洗脫，具體提取方法是按下述步驟進行的:
[0016]步驟一、將水樣裝入存儲罐中，閉合頂蓋，通入氮氣，存儲罐內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，打開控制閥，使水樣通過過濾器流向濾膜支架，待水樣全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜後停止進樣，關閉氮氣存儲罐，使罐體洩壓，更換新的存儲罐；
[0017]步驟二、將pH值為9.5~9.75的牛肉浸提物溶液加入更換後的存儲罐內，通入氮氣，存儲罐內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，打開控制閥，使牛肉浸提物溶液流向濾膜支架進行洗脫，待全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜後停止進樣，通過放水管收集洗脫液，關閉氮氣存儲罐，使罐體洩壓；
[0018]步驟三、然後進行等電點沉降法處理後離心，重溶後二次濃縮，再提取核酸；即完成了札幌病毒的提取。
[0019]步驟三所述的等電點沉降法是按下述步驟進行的:利用1.2mol/L HCl調節洗脫液的PH值至4.0，然後加入獲得洗脫液0.1 % (V/V)的0.5mol/L FeCl3 (約1.8mL)，用1.2mol/LHCl 調節 pH 值至 3.5。
[0020]步驟三在4°C條件下3000 Xg離心力作用下離心15min。
[0021]步驟三所述重溶具體操作:在生物安全櫃中，小心棄上清，過程中不要懸浮沉澱；然後用IOmLPBS小心溶解沉澱，轉移至50mL離心管中；再加入帶有抗生素的I XMEM至終體積30mL，0.22 μ M濾器過濾溶液，_70°C保藏備用。
[0022]步驟三中二次濃縮是按下述步驟進行的:(一)配製5%牛肉浸提物溶液:取1.5克牛肉浸提物粉、0.375克甘氨酸、溶解於IOOmL無菌水中，121°C 15min高壓滅菌；(二)向Centricon Plus-70離心杯式濾器加入70mL去離子水，以2000g的離心力離心5min,棄濾液；(三)倒置離心杯式濾器連接收集管，以800g的離心力離心2min ;(四)取30mLl.5%牛肉浸提物溶液加入離心杯式濾器後，以2000g的離心力離心30min，棄濾液；(五)將第一次過濾後獲得的30mL病毒儲液加入離心杯式濾器中，以2000g的離心力離心45min，棄濾液；(六)倒置離心杯式濾器連接收集管，以800g的離心力離心2min ;(七)將收集管中離心產物轉移至螺口管中，-70°C保藏備用。
[0023]步驟三種利用核酸提取試劑盒Promega MagaZorb Total RNA Min1-Prep Kit提取札幌病毒核酸。該試劑盒利用磁珠吸附核酸、純化、洗脫獲得核酸提取物，相對於目前RNA提取常用的TRIzol法和膜吸附試劑盒具有提取效率高、不含有乙醇等影響後期PCR檢出的組分、後期核酸檢出效率高的優點。
[0024]本發明中水樣的清潔程度決定過濾過程所需要的時間，一般情況下清潔水源需要IOmin左右，雜質較多的水過濾需要2小時或更長時間。
[0025]本發明方法的優點是:病毒提取效率高，在提取過程中，通過利用初濾除雜、膜吸附、蛋白洗脫、等電點沉降、離心重溶、磁珠試劑盒提取等步驟，降低了提取產物中幹擾組分的含量，使得通過本發明獲得的樣本提取物能夠適用於多種檢測平臺。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1是本發明結構的示意圖(頂蓋處於閉合狀態)；圖2是頂蓋的結構示意圖；圖3是頂蓋與存儲罐連接示意圖(頂蓋處於閉合狀態)；圖1_3中I——氮氣壓力罐，2——存儲罐，3——過濾器，4——濾膜支架，5——放水管，6——壓力表，7——頂蓋，8——進氣管，9——出水管，10——存儲罐，11——穹頂，12——弧形縮口，13——密封圈，14——外翻沿，15——耳座，16——槓桿，161——提杆，162——連接杆，163——支撐杆，164——過渡圓弧，17——控制閥；圖4是SYBRGreen試劑檢驗水中病毒提取樣本擴增曲線；圖5是SYBRGreen試劑擴增熔解曲線；圖6是TaqMan試劑檢驗水中病毒提取樣本擴增曲線。
【具體實施方式】 [0027]【具體實施方式】一、結合圖1、2和3進行說明，本發明的水中病毒分離提取裝置包括氮氣壓力罐1、存儲罐2、過濾器3和濾膜支架4，所述的存儲罐2包括罐體10和頂蓋7，罐體10設有穹頂U，穹頂11設有弧形縮口 12，頂蓋7底端設有外翻沿14，密封圈13置於外翻沿14內，頂蓋7由弧形縮口 12伸入並可通過密封圈13卡在弧形縮口 12內，頂蓋7頂端對稱設有耳座15，耳座15內裝有槓桿16，槓桿16包括一個「η」字形的提杆161、兩個弧形的連接杆162及兩個橫折形的支撐杆163，所述提杆161兩端與連接杆162通過過渡圓弧164連接，連接杆162的另一端與支撐杆163圓弧過渡連接，槓桿16的支撐杆163套在耳座15內，支撐杆163的底端可抵在穹頂11上，過渡圓弧164可抵在穹頂11上，穹頂11上分別設有壓力表6、進氣管8和出水管9，存儲罐2的進氣管8與氮氣壓力罐I連接，出水管9底端穿過穹頂11伸入到罐體10底部，出水管9頂端設有控制閥17，控制閥17與過濾器3通過兩端連接快速接頭的導管連接，過濾器3與濾膜支架4通過兩端連接快速接頭的導管連接，濾膜支架4設有放水管5 ;所述濾膜支架4內設有正電荷濾膜；出水管9底端面與存儲罐10底部的距離為0.1mm，密封圈13的截面為圓形。
[0028]【具體實施方式】二、結合圖1、2和3進行說明，本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:出水管9底端面與存儲罐10底部的距離為0.2mm。其它結構與連接方式與【具體實施方式】一相同。
[0029]【具體實施方式】三:結合圖1、2和3進行說明，本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:所述的正電荷濾膜為NanoCeram正電荷濾膜。其它結構與連接方式與【具體實施方式】一相同。
[0030]【具體實施方式】四:本實施方式採用【具體實施方式】三中的裝置進行過濾、洗脫，具體提取方法是按下述步驟進行的:[0031]步驟一、將水樣裝入存儲罐2中，閉合頂蓋，通入氮氣，存儲罐2內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，打開控制閥，使水樣通過過濾器流向濾膜支架，待水樣全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜後停止進樣，關閉氮氣存儲罐，使罐體洩壓，更換新的存儲罐；
[0032]步驟二、將pH值為9.5~9.75的牛肉浸提物溶液加入更換後的存儲罐內，通入氮氣，存儲罐2內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，打開控制閥，使牛肉浸提物溶液流向濾膜支架進行洗脫，待全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜後停止進樣，通過放水管收集洗脫液，關閉氮氣存儲罐，使罐體洩壓；
[0033]步驟三、然後進行等電點沉降法處理後在4°C條件下3000g離心力離心15分鐘，重溶後二次濃縮，再用核酸提取試劑盒Promega MagaZorb Total RNA Min1-Prep Kit提取札幌病毒核酸提取核酸；即完成了札幌病毒的提取。
[0034]步驟三所述的等電點沉降法是按下述步驟進行的:在生物安全櫃中，小心棄上清，過程中不要懸浮沉澱；然後用IOmLPBS小心溶解沉澱，轉移至50mL離心管中；再加入帶有抗生素的I XMEM至終體積30mL。
[0035]步驟三中重溶具體操作:在生物安全櫃中，小心棄上清，過程中不要懸浮沉澱；然後用IOmLPBS小心 溶解沉澱，轉移至50mL離心管中；再加入帶有抗生素的I XMEM至終體積30mL，0.22 μ M濾器過濾溶液，_70°C保藏備用。
[0036]步驟三中二次濃縮是按下述步驟進行的:(一)配製5%牛肉浸提物溶液:取1.5克牛肉浸提物粉、0.375克甘氨酸、溶解於IOOmL無菌水中，121°C 15min高壓滅菌；(二)向Centricon Plus-70離心杯式濾器加入70mL去離子水，以2000g的離心力離心5min,棄濾液；(三)倒置離心杯式濾器連接收集管，以800g的離心力離心2min ;(四)取30mLl.5%牛肉浸提物溶液加入離心杯式濾器後，以2000g的離心力離心30min，棄濾液；(五)將第一次過濾後獲得的30mL病毒儲液加入離心杯式濾器中，以2000g的離心力離心45min，棄濾液；(六)倒置離心杯式濾器連接收集管，以800g的離心力離心2min ;(七)將收集管中離心產物轉移至螺口管中，-70°C保藏備用。
[0037]水中病毒提取過程中，本發明利用自行設計的水體病毒分離提取系統實施提取，通過陽性濾膜過濾，經過調整電荷洗脫，蛋白沉降包裹及復溶後，通過RNA提取反轉錄後獲得的cDNA能夠應用螢光定量PCR體系檢測出陽性結果。
[0038]為對比SYBRGreen染料法與Taqman探針法PCR擴增結果，將兩種檢測方法PCR產物進行凝膠電泳檢驗。檢測結果見圖4。
[0039]本發明能夠高效富集水中病毒的設備，利用該設備結合發明中病毒分離提取方法，應用SYBRGreen染料法和TaqMan探針法兩種螢光定量PCR方法進行檢測，都能夠成功檢出札幌病毒。
[0040]由圖5可知，在應用SYBRGreen染料法時，融解曲線中74°C左右處有一個非特異擴增峰，可能由於存在少量引物二聚體幹擾，但並不影響陽性檢出結果；
[0041]由圖6可知，在利用TaqMan探針法進行檢測時，檢出結果與染料法基本一致，能夠檢出水中札幌病毒。
[0042]利用螢光定量PCR進行定量及定性檢測時，由於不同廠家提供的材料存在差異，不同反應體系對螢光定量PCR擴增結果有直接影響，在本發明中，通過本發明提供的分離提取裝置和提取方法進行提取時，不同廠商的SYBRGreen染料試劑和TaqMan探針試劑基本能夠在反應中得到相 近的結果，因此本發明適用於多種檢測平臺。
【權利要求】
1.水中病毒分離提取裝置，它包括氮氣壓力罐(I)、存儲罐(2)、過濾器(3)和濾膜支架(4)，其特徵在於所述的存儲罐(2)包括罐體(10)和頂蓋(7)，罐體(10)設有穹頂(11)，穹頂(11)設有弧形縮口(12)，頂蓋(7)底端設有外翻沿(14)，密封圈(13)置於外翻沿(14)內，頂蓋(7)由弧形縮口(12)伸入並可通過密封圈(13)卡在弧形縮口(12)內，頂蓋(7)頂端對稱設有耳座(15)，耳座(15)內裝有槓桿(16)，槓桿(16)包括一個「η」字形的提杆(161)、兩個弧形的連接杆(162)及兩個橫折形的支撐杆(163)，所述提杆(161)兩端與連接杆(162)通過過渡圓弧(164)連接，連接杆(162)的另一端與支撐杆(163)圓弧過渡連接，槓桿(16)的支撐杆(163)套在耳座(15)內，支撐杆(163)的底端可抵在穹頂(11)上，過渡圓弧(164)可抵在穹頂(11)上，穹頂(11)上分別設有壓力表(6)、進氣管⑶和出水管(9)，存儲罐(2)的進氣管(8)與氮氣壓力罐(I)連接，出水管(9)底端穿過穹頂(11)伸入到罐體(10)底部，出水管(9)頂端設有控制閥(17)，控制閥(17)與過濾器(3)通過兩端連接快速接頭的導管連接，過濾器(3)與濾膜支架(4)通過兩端連接快速接頭的導管連接，濾膜支架(4)設有放水管(5);所述濾膜支架(4)內設有正電荷濾膜。
2.根據權利要求1所述水中病毒分離提取裝置，其特徵在於出水管(9)底端面與罐體(10)底部的距離為0.1~0.2mmο
3.根據權利要求1所述水中病毒分離提取裝置，其特徵在於密封圈(13)的截面為圓形或橢圓形。
4.根據權利要求1所述水中病毒分離提取裝置，其特徵在於所述的正電荷濾膜為NanoCeram正電荷濾膜。
5.水中札幌病毒的提取方法，其特徵在於水中札幌病毒提取方法中利用權利要求1所述的裝置進行過濾、洗脫，具體提取方法是按下述步驟進行的: 步驟一、將水樣裝入存儲罐(2)中，閉合頂蓋(7)，通入氮氣，存儲罐⑵內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，打開控制閥(17)，使水樣通過過濾器(3)流向濾膜支架(4)，待水樣全部通過濾膜支架(4)內的正電荷濾膜後停止進樣，關閉氮氣存儲罐(2)，使存儲罐(2)內洩壓，更換新的存儲罐(2); 步驟二、將pH值為9.5~9.75的牛肉浸提物溶液加入更換後的存儲罐(2)內，通入氮氣，存儲罐(2)內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，打開控制閥17，使牛肉浸提物溶液流向濾膜支架(4)進行洗脫，待全部通過濾膜支架(4)內的正電荷濾膜後停止進樣，通過放水管(5)收集洗脫液，關閉氮氣存儲罐(2)，使存儲罐(2)內洩壓； 步驟三、然後進行等電點沉降法處理後離心，重溶後二次濃縮，再提取核酸；即完成了札幌病毒的提取。
6.根據權利要求5所述的水中札幌病毒的提取方法，其特徵在於步驟三所述的等電點沉降法是按下述步驟進行的:利用1.2mol/L HCl調節洗脫液的pH值至4.0，然後加入獲得洗脫液體積 0.1% 的 0.5mol/L FeCl3，用 1.2mol/LHCl 調節 pH 值至 3.5。
7.根據權利要求6所述的水中札幌病毒核酸提取方法，其特徵在於步驟三在4°C條件下離心15min。
8.根據權利要求7所述的水中札幌病毒核酸提取方法，其特徵在於步驟三所述重溶具體操作:在生物安全櫃中，小心棄上清，過程中不要懸浮沉澱；然後用IOmLPBS小心溶解沉澱，轉移至50mL離心管中；再加入帶有抗生素的1父1^1至終體積301^，0.22 μ M濾器過濾溶液，-70°C保藏備用。
9.根據權利要求8所述的水中札幌病毒的提取方法，其特徵在於步驟三中二次濃縮是按下述步驟進行的: (一)配製5%牛肉浸提物溶液:取1.5克牛肉浸提物粉、0.375克甘氨酸、溶解於IOOmL無菌水中，121 °C 15min高壓滅菌； (二)向CentriconPlus-70離心杯式濾器加入70mL去離子水，以2000g的離心力離心5min，棄濾液； (三)倒置離心杯式濾器連接收集管，以800g的離心力離心2min； (四)取30mLl.5%牛肉浸提物溶液加入離心杯式濾器後，以2000g的離心力離心30min,棄濾液； (五)將第一次過濾後獲得的30mL病毒儲液加入離心杯式濾器中，以2000g的離心力離心45min,棄濾液； (六)倒置離心杯式濾器連接收集管，以800g的離心力離心2min； (七)將收集管中離心產物轉移至螺口管中，_70°C保藏備用。
10.根據權 利要求9所述的水中札幌病毒的提取方法，其特徵在於步驟三種利用核酸提取試劑盒Promega MagaZorb Total RNA Min1-Prep Kit提取札幌病毒核酸。
【文檔編號】C12Q1/70GK103981084SQ201410234128
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】原韜, 夏海華, 於衝, 王金英, 曲曉軍, 孫建華 申請人:黑龍江省科學院微生物研究所