三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法
2023-08-03 04:02:16
三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法
【專利摘要】本發明涉及一種三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法。包括：取三倍體丹參莖尖或新生幼葉進行脫毒處理後作為組織培養材料，接種在1/2MS培養基上，在20-25℃，光強度3000Lux，光周期14小時/天條件下進行培養，待葉緣切割面分化出叢生芽；進行分瓶擴大繁殖，每瓶3-5棵苗；新根3-5公分時進行瓶苗移栽，按常規三倍體丹參大田種植方法進行田間栽培管理；測定丹參酮ⅡA、丹酚酸B和隱丹參酮含量；根據三倍體丹參脫毒新品種藥材產量和主要藥物有效成分含量測定結果確定三倍體丹參脫毒新品種的選育結果。本發明二年內可選育出三倍體丹參脫毒新品種，解決了因生物及非生物脅迫而引起的丹參新品種退化問題，理論上講，這種脫毒三倍體丹參優勢可以保持數百年。
【專利說明】三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法
【技術領域】 [0001] 本發明涉及一種植物新品種的選育方法，特別是三倍體丹參脫毒新品種(系)的快速選育方法。
【背景技術】
[0002]丹參miltiorrhiza Bunge)是我國傳統醫藥中應用最早、最廣泛的中藥之一，是著名的活血化淤藥，在臨床上被廣泛用於治療冠心病、心絞痛、缺血性中風等疾病。隨著我國人口老齡化，心血管疾病成為危害人類健康的主要疾病，發病率逐年上升，對藥物需求量增大。目前我國以丹參為原料生產的複方中藥有100多種，對優質丹參藥材的需求量巨大。自上世紀60~70年代，各地野生丹參轉變家種成功後，生產有了較大發展，1978年收購4 000噸，銷售6500噸，2007年產量達23000~24000噸，已成為一種重要的栽培藥用植物。最近，中藥界普遍把丹參視為中藥的「模式中藥」，中國科學院藥用植物研究所還啟動了丹參基因組測序工作，突顯了丹參作為傳統中藥研究的地位。然而，隨著栽培丹參的發展，凸顯我國丹參遺傳改良與新品種培育中的問題，主要有:①與其它栽培作物相比栽培丹參尚處在起步階段，目前我國還沒有一個通過雜交選育出來的丹參新品種，現有栽培丹參都是由野生直接變家種來，野生、半野生、栽培丹參之間的遺傳相似係數在0.75~0.8之間，說明我國栽培丹參中很少有變異的積累-人工選擇；②現在全國還沒有一個公認的丹參主栽品種，只有四川從現有混雜的川丹參群體中經過系統篩選分離純化出了大葉型(SA)和小葉型(SI)兩個品種。因此，我國丹參的遺傳改良與新品種培育勢在必行，尋找一條有效的丹參新品種培育方法已是當務之急。近年來很多單位都已開展了有關丹參雜交育種及其相關的基礎研究。高山林(2006)最先培育了丹參四倍體新品種，丹參產量提高了 50%，有效化學成分提高了 50~80%。江蘇省從栽培品種混合種植的天然雜交當代(Fl)中選出皺葉、單葉、小葉和原型4個品系新材料，正在擴大種植。河南省從裕丹參變異群體中已選出5個變異類型。山東省在對丹參開花與繁育特性研究的基礎上，提出直接利用丹參的自然變異進行系統育種是丹參初期最有效的育種方法。陝西省已篩選到丹參雄性不育系Sh-B的三個不育類型Sh-Bl、Sh-B2、Sh-B3。然而，至今尚未見丹參雜交育種取得突破性進展。
【發明內容】
[0003]本發明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的快速培育方法，可以克服常規新品種選育周期長，需要5-8年的缺陷。本發明選育周期只需2年。它是建立在本項發明人早先發明的「丹參三倍體培育方法」的基礎上，將產生變異的三倍體丹參或由於外界脅迫造成品種退化的三倍體丹參的體細胞作為外植體，採用組織培養快繁與脫毒技術相結合的方法，將其快速繁殖起來。不但第二年就可進行新品種比較試驗，而且經過脫毒處理，恢復了三倍體丹參本來就存在的多倍體優勢和雜種優勢，三倍體丹參脫毒新品種表現生長旺盛(圖5)，藥材產量和藥物有效成分都能獲得顯著提高。
[0004]本發明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的選育方.法，包括以下步驟:以三倍體丹參莖尖或新生幼葉為外植體，先進行脫毒處理，然後進行組織培養快繁。要使瓶苗達到一定數量，第2年就可進行三倍體丹參脫毒新品種評比試驗，選育出藥材產量提高20%以上，藥物有效成分丹酚酸B和丹參酮II A提高0.5-1倍以上，綜合生物性狀好的三倍體丹參脫毒新品種。
[0005]本發明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的選育方法，包括以下步驟:
⑴取材:以下3種材料來源之一，均可進行三倍體丹參毒新品種的選育工作:①在三倍
體丹參大田中新發現的變異植株莖尖或新生幼葉(圖1);②三倍體丹參雜交(2x早X4x古或4x早Χ2χ ?)當代種子幼苗莖尖或幼葉大田生產種植8年以上的三倍體丹參莖尖或新生幼葉；
⑵脫毒處理:在無菌操作條件下先用75%酒精消毒I分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無菌蒸懼水衝洗5遍；
⑶光照培養:在光照周期14小時/天，光強度3000Lux，室溫20-25°C條件下進行培養； ⑷擴大繁殖:待叢生芽生長出1-2片葉時，進行分瓶擴大繁殖，每瓶分裝3-5棵苗；
(5)瓶苗移栽:待瓶苗長出新根，根長3-5公分時，進行瓶苗移栽。移栽前2天打開瓶蓋進行練苗； (6)移栽苗管理:剛移出的瓶苗要加強管理，成活率可達90%以上；
⑴三倍體丹參脫毒新品系(種)品種評比試驗:按常規新品種評比試驗要求進行，每個新選育出來的三倍體丹參脫毒新品(種)大田種植面積要達到2-3畝；
⑶三倍體丹參脫毒新品系(種)主要藥物有效成分測定:按《藥典》規定標準，測定丹參酮II A和隱丹參酮含量。
[0006]⑶三倍體丹參脫毒新品種的確定:根據三倍體丹參脫毒新品系大田種植藥材產量和主要藥物有效成分含量測定，最後才能確定三倍體丹參脫毒新品種的選育成功。
[0007]按本發明的以上程序，2年內即可選育出藥材產量提高20%以上，藥物有效成分丹酚酸B和丹參酮II A提高0.5-1倍以上，綜合生物性狀好的三倍體丹參脫毒新品種，併科學的解決了因生物及非生物脅迫引起的三倍體丹參品種退化而造成的丹參藥材減產難題。
[0008]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1:在三倍體丹參大田中發現的變異株。
[0009]圖2:三倍體丹參取材與脫毒處理；(a)取材，(b)脫毒。
[0010]圖3:三倍體丹參組織培養與克隆快繁。
[0011]圖4:三倍體丹參瓶苗移栽。
[0012]圖5:三倍體丹參脫毒新品種大田種植生長勢。
[0013]圖6:三倍體丹參脫毒新品種根部藥材。
[0014]
【具體實施方式】
[0015]本發明突出的特點和顯著進步可以從下述實例中得以體現，但它不會對本發明作任何限制。
[0016]本發明提供的是一種三倍體丹參脫毒新品種的選育方法包括以下步驟:
取材是關健，所取的材料必須是新發現的三倍體丹參變異植株莖尖或新生長幼葉、三倍體丹參雜交當代種子幼苗新生長的幼葉或大田生產8年以上出現明顯品種退化的三倍體植株莖尖或新生幼葉。
[0017]脫毒處理必須徹底，要嚴格按著無菌操作手續，徹底消滅接種材料上可能攜帶的細菌和病毒。在超淨臺內將切取的材料先用75%酒精消毒I分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無菌蒸餾水衝洗5遍，再將材料接種在1/2MS培養基上，進行培養。
[0018]光照培養，光照培養室除滿足光照培養周期14小時/天，光強度3000Lux，室溫20-25°C條件外，還要保持光照培養室的溼度在50%左右、通風和清潔衛生，減少外來汙染。
[0019]擴大繁殖的空間很大，根據擴大繁殖的數量，時間可能拉的很長。因為取材的數量直接影響著擴大繁殖種苗的數量，為保證三倍體丹參脫毒種苗擴繁15000棵，取材步驟必須有一定數量。
[0020]瓶苗移栽，待瓶苗長出3-5公分新根時，進行瓶苗移栽，移栽前2天打開瓶蓋進行練苗。瓶苗移栽方法和營養土對瓶苗移栽成活率有很大影響。移栽前要把培養基洗淨，移栽的基質要事先經滅菌靈消毒堆肥發酵處理過的磨菇泥渣與砂土按3:1混合基質，每個營養缽移栽一棵苗。移栽瓶苗要加強管理，移栽第一周50%光照,保持50-70%溼度,成活率可達90%以上。
[0021]三倍體丹參脫毒新品系(種)新品種評比試驗，按常規新品種評比試驗要求進行。一般農作物新品種評比試驗設三亇重複，每個重複0.5-1畝地。藥用植物新品種評比試驗也可參照此要求進行,設三個重複,每個重複I畝地,每畝5000棵苗。
[0022]主要藥物有效成分測定，按《中華人民共和國藥典》規定標準，丹參酮II A不得少於0.2 %，丹酚酸B不得少於3.0%。
[0023]三倍體丹參脫毒新品種的確定。三倍體丹參脫毒新品種的確定，要根據藥材產量、主要藥物有效成分含量和主要生物學性狀三方面來確定。一般藥材產量增產20%以上，丹參酮II A提高0.5-1倍以上，丹酚酸B提高0.5倍以上，綜合生物學性狀好，抗生物及非生物脅迫能力強的三倍體丹參脫毒新品系可以確定為三倍體丹參脫毒新品種。
[0024]實施例1 2012年10月在三倍體丹參生產大田中發現2棵發生變異的三倍體丹參植株。我們暫命名為:RY1、RY2。隨後，我們採集這2棵變異植株的新生幼葉，進行脫毒處理和組培快繁:首先，用流水衝洗幼葉，洗淨泥砂，在超淨工作檯內，按無菌操作程序，用75%酒精消毒30-60秒一0.1 %升汞消毒15分鐘，無菌水衝洗5次，用解剖刀將材料切割成1-2平方釐米大小，接種在1/2MS + 6BA0.5-lmg/L培養基上，直接誘導叢生芽，接種20-30天後，待大量叢生芽產生後，進行試管苗的大量克隆增殖，待叢生芽生長出真葉時，轉接到1/2MS + IBAO0 2mg/L培養基上誘導生根，在光照12小時/天，光強度3000Lux，室溫25°C條件下培養，待試管苗新根長至1-2釐米時，打開瓶蓋，練苗3-5天，進行瓶苗移栽，用長鑷子取出瓶苗，洗去培養基，移入事先堆積發酵好的營養土中(營養土為蘑菇泥渣與砂土 3:1混合，用多菌靈消毒，堆積發酵)，移栽苗的管理，移栽的瓶苗前20天，要半遮光，保持50-70 %溼度，成活率可達90%以上。2012年12月-2013年4月移栽的瓶苗放在不加溫的溫室內，溫度保持在5°C以上。2013年4月20日移栽於大田中(圖4)，三倍體丹參脫毒新品種表現生長旺盛(圖5)。2013年11月11日收穫三倍體丹參脫毒新品種。經測算丹參藥材產量折合2000公斤/畝，丹參酮IIA、丹酚酸B、隱丹參酮均達到或超過《中華人民共和國藥典》規定標準。表1為三倍體丹參脫毒新品系(種)根部藥材藥物有效成分測定結果:採用高效液相色譜法測定其含量，主要以丹酚酸B、丹參酮II A為測定指標)
表1三倍體丹參脫毒新品系(種)根部藥材藥物有效成分測定數據
【權利要求】
1.一種三倍體丹參脫毒新品系(種)的快速選育方法，其特徵在於包括以下步驟: ⑴取材，選自:①在三倍體丹參大田中新發現的變異植株莖尖或新生幼葉(圖1);②三倍體丹參雜交(2x早Χ4χ ?或4x早Χ2χ ? )當代種子幼苗莖尖或幼葉大田生產種植8年以上的三倍體丹參莖尖或新生幼葉； ⑵脫毒處理:在無菌操作條件下，進行材料的脫毒處理； ⑶組織培養:按無菌操作程序，將材料接種在1/2MS培養基上，在20-25 °C，光強度3000LUX，光周期14小時/天條件下進行培養，20天後在葉緣切割面可分化出叢生芽；⑷組培苗克隆繁殖:待叢生芽分化出幼葉時，進行分瓶擴大繁殖，每瓶以3-5棵苗為 且； (5)瓶苗移栽:待新根3-5公分時進行瓶苗移栽，移栽前2-3天先打開瓶蓋練苗； (6)移栽苗管理:加強移栽苗管理； ⑴三倍體丹參脫毒新品種評比試驗:按通常三倍體丹參大田種植方法進行田間栽培管理； ⑶三倍體丹參脫毒新品系(種)主要藥物有效成分測定:按《中華人民共和國藥典》規定，對三倍體丹參脫毒新品系(種)丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮進行測定； ⑶三倍體丹參脫毒新品種的確定:根據三倍體丹參脫毒新品種藥材產量和主要藥物有效成分含量測定結果，最後確定三倍體丹參脫毒新品種的選育結果。
2.一種三倍體丹參脫毒新品種的快速選育方法，其特徵在於包括以下步驟: ⑴取材:選自以下三種材料來源之一:①在三倍體丹參種植大田中新發現的變異植株的莖尖或新生幼葉；②三倍體丹參雜交(2x早Χ4χ ?或4x早Χ2χ ? )當代種子幼苗之新生幼葉大田栽培生產8年以上三倍體丹參植株莖尖或新生幼葉；按無菌操作程序，在超淨工作檯上，用解剖刀切取1-2平方釐米大小的葉片，進行脫毒處理； ⑵脫毒處理:在超淨臺內將切取的材料先用75%酒精消毒I分鐘，再用0.1%升汞消毒10分鐘，無菌蒸餾水衝洗5遍，將材料接種在1/2MS培養基上，在組織培養室中進行光照培養; ⑶光照培養:⑵所述的光照培養是在周期14小時/天，光強度3000Lux，室溫20-25°C條件下進行培養；在上述條件下培養，經過20天沿接種材料切割面會產生大量叢生芽；⑷擴大繁殖:待⑶所述的叢生芽生長出1-2片葉時，進行分瓶擴大繁殖，每瓶分裝3-5棵苗； (5)瓶苗移栽:待瓶苗長出新根，根長3-5公分時，進行瓶苗移栽；移栽前2天打開瓶蓋進行練苗； (6)移栽苗管理:剛移出的瓶苗要半遮光，保持50-70%的溼度，成活率達90%以上； ⑴三倍體丹參脫毒新品種品種評比試驗:按常規新品種評比試驗要求進行，每個新選育出來的三倍體丹參脫毒新品種大田種植面積要達到1.5-3畝地； ⑶三倍體丹參脫毒新品種主要藥物有效成分含量測定:按《中華人民共和國藥典》規定標準，測定丹參酮II A、丹酚酸B和隱丹參酮含量； ⑶三倍體丹參脫毒新品種的確定:根據三倍體丹參脫毒新品系大田種植藥材產量和主要藥物有效成分含量測定，最後確定三倍體丹參脫毒新品種的選育結果。
3.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於所述的取材是選取三倍體丹參種植大田中新發現的變異植株的莖尖或新生幼葉。
4.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於步驟③要保持光照培養室的溼度在50%，並保持通風和清潔衛生。
5.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於步驟④擴大繁殖數量為15000棵。
6.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於步驟(5)所述的瓶苗移栽方法為:移栽前要把培養基洗淨，移栽的基質要事先經滅菌靈消毒堆肥發酵處理過的磨菇泥渣與砂土按3:1混合基質,每個營養缽移栽一棵苗。
7.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於步驟⑦所述的評比試驗設三亇重複，每個重複I畝地，每畝5000棵苗。
8.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於步 驟(8)主要藥物有效成分測定，丹參酮II A不得少於0.2%，丹酚酸B不得少於3.0%。
9.按照權利要求2所述的快速選育方法，其特徵在於步驟⑶所述的三倍體丹參脫毒新品種的確定:藥材產量增產20%以上，丹參酮II A提高I倍以上，丹酚酸B提高0.5倍以上。
【文檔編號】A01H4/00GK103583367SQ201310582544
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】陳瑞陽 申請人:陳瑞陽