一種快速定量檢測c-反應蛋白的膠體金法及其應用的製作方法

2023-08-03 05:36:01 1

專利名稱：：一種快速定量檢測c-反應蛋白的膠體金法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於臨床免疫學檢測領域，具體涉及一種快速定量檢測c一反應蛋白的膠體金法及其在診斷試劑盒製備中的應用。
背景技術：
：C反應蛋白(CRP)是一種能和肺炎鏈球菌的莢膜C多糖結合，由TillettandFrancis(1930)發現並由AbernethyandAvery(1941)得到研究，CRP是由5個相同的亞單位(23KD)以非共價鏈聚集形成的環狀五聚體蛋白，分子量為115KD,是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎性刺激時肝細胞合成的急性時相蛋白。在炎症開始數小時CRP就升高，隨著組織結構和功能的復原其含量恢復正常。因此，CRP的測定對病程監測、治療效果判斷和預後評價有重大意義。健康人無感染時的CRP水平還可預測將來心肌梗塞及中風的危險性。健康人CRP參考範圍的中位數基本為O.58—1.13mg/L.CRP含量〉2.lmg/L的人，比較CRP含量《lmg/L者，將來發生心肌梗塞的危險性為後者的2.9倍；發生缺血性中風的危險性為後者的1.9倍；發生外周動脈血管性疾病的危險性為後者的4.l倍。CRP與血脂(總膽固醇，總膽固醇高密度脂蛋白膽固醇的比值)的聯合測定，較其他的危險因子更能預示發生心、腦血管疾病的危險性，是目前進行冠心病危險評估的最佳模型。免疫金標記技術(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這種方法山於快速、簡便、準確和無汙染等優點，在檢測抗原、抗體中得到了廣泛使用。免疫膠體金在醫學檢驗中最常使用的有二個方法1)免疫膠體金斑點滲濾試驗2)免疫膠體金層析試驗。免疫膠體金斑點滲濾技術快速又簡便，廣受歡迎，但要測定結果非常敏感、非常可重複，免疫膠體金與樣品中待測物之間的呈色標記反應在均相介質中進行，使反應充分，才能使測定結果更敏感、重複性更好。這在免疫膠體金斑點滲濾定量檢測中尤為重要，是發展敏感度和準確性更好的金標法快速斑點滲濾定量檢測診斷試劑盒的前提。C-反應蛋白在人體細菌感染的早期就迅速產生，是細菌感染性疾病診斷的敏感指標，在國外廣泛應用於早期的細菌感染性疾病的診斷，但需要昂貴的儀器和配套試劑，測定往往在中心實驗室進行，不能立等結果。近年國際上已有商品化免疫膠體金斑點滲濾定量檢測試劑盒供應，較有代表性的是挪威Axis-Shield公司生產的NycoCardC反應蛋白定量試劑盒。挪威Axis-Shield公司生產的NycoCardC反應蛋白定量試劑盒將稀釋樣品直接加在反應小盒中，樣品中待測物和膜上致敏配基先起免疫反應，被捕獲在膜上的待測物和隨後加在膜上的免疫膠體餘再起呈色標記反應。這樣的反應模式導致免疫膠體金與待測物之間的呈色標記反應只在免疫膠體金試劑流經膜上時瞬間進行，缺點是反應均相性差、反應時間短(NycoCardl114365.Ed.581July2001)。本發明採用樣品與膠體金在試管內反應後再加入反應板的新斑點滲濾試驗操作方法，由於樣品與膠體金在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，增加樣品稀釋倍數，去除樣品介質效應，使定量結果有很好的可重複性，而且此方法省略了直接加樣歩驟，提高了定量結果的精密度和準確度。
發明內容本發明所要解決的技術問題之一是克服常規c-反應蛋白檢測方法不適合單人份測試、檢測時間較長、反應均相性差的缺點，提供了一種快速、簡便、準確的快速定量檢測C一反應蛋白的膠體金法。本發明提供的快速定量檢測C一反應蛋白的膠體金法，其反應原理為固相雙抗體夾心法的金標免疫斑點滲濾法，待測樣品經40—480倍稀釋後與適當比例的免疫膠體金在液相均質介質中充分混和均勻並起專一性呈色標記反應，在此過程中樣品中的待測物能專一性地與膠體金抗此待測物單抗綴合物充分結合，然後再轉加到反應板上，流經反應板中的硝基纖維素膜時，其中所含的、已反應結合在一起的待測物一抗待測呈色複合物能為膜上固定的抗待測物另一側決定簇的單抗或多抗特異性地捕獲，呈紅色斑點(固定在膜上的抗待測物單抗或多抗與綴合膠體金的抗待測物單抗是二株不同的抗體，有不同的結合位點)，斑點紅色強度可用儀器定量測試，它與樣品中CRP濃度呈正比。具體包括如下歩驟1.從冷藏處取出抗CRP金標液凍幹品，室溫至少平衡半小時，在抗CRP金標液凍幹品中，準確加入標貼或說明書中規定體積的凍幹品復溶液搖勻。2.吸取復溶後的金標液，加入空的反應管；3.待測樣品加入樣品稀釋液進行40—480倍稀釋，充分混勻。4.將反應板平放於實驗臺上，於反應孔內滴加2滴封閉液，待完全滲入；5.吸取稀釋樣品到反應管金標液中，充分混勻後立刻將反應混合物全部加入到封閉後的反應板孔中；6.待完全滲入後，加入4滴洗滌液；7.待洗滌液完全滲入後，於5分鐘內在U2金標定量儀CRP項目下測讀CRP值。冷凍乾燥抗CRP免疫膠體金和反應板的製備按呂繩凱等介紹的方法(中華微生物學和免疫學雜誌，13(2):125，1993;上海醫學檢驗雜誌，5(1):62，1990)製備膠體金和抗CRP免疫膠體金綴合物。但包被膠體金的是純化CRP單抗，0.15mgCRP單抗用於包被10ml膠體金，2500ml膠體金在包被離心洗滌後，最終以pH7.4，0.01mol/L磷酸鹽緩衝液恢復到1500ml抗CRP免疫膠體金應用液，緩衝液含1%BSA、0.5tng/mlPEG20M、0.1%疊氮鈉。冷凍乾燥預冷溫度-38°C，最高升溫3(TC，抽真空時間20小時，瓶分裝量按需設定，但液體厚度不超過lcm(本公司凍幹膠體金製備發明專利ZL2004100180513)。包被反應板上硝基纖維膜的是針對不同反應決定簇的另一純化CRP單抗，濃度lmg/ml，點樣量3ul/點，點樣用的稀釋CRP單抗稀釋液是20raM/L醋酸鹽緩衝液，pH4.0，內含3%乙醇，反應板是膠體金定量檢測板(本公司中國外觀設計專利，專利號ZL033435278)。反應板點樣用的稀釋CRP單抗或多抗純化物指定稀釋液是20raM/L以下的甘氨酸-HCl或醋酸鹽緩衝液，pH2.4—6.0，內含3%乙醇。樣品稀釋液是甘氨酸一NaOH緩衝液，離子強度20-200mM/L，PH7.0-8.0，確保樣品中的CRP與免疫膠體金在混勻後、加入反應板前快速地完全反應。本發明的液相反應方法與常規金標免疫滲濾法的比較見表1表l液相反應操作模式與常規金標免疫滲濾法的比較常規金標免疫滲濾法液相反應操作模式~~~~樣品稀釋倍數不稀釋或2080倍40480倍定量結果CVX(變異係數)15%20%<10%體液樣品種類不同對結果的影響不可忽略可忽略根據本發明提供的快速定量檢測C一反應蛋白的膠體金法製備成C-反應蛋白快速定量試劑盒(膠體金法)。所製備的試劑盒CRP-DOT在U2儀上測讀與同類進口試劑盒NycoCard比較結果見表2:tableseeoriginaldocumentpage6所製備的CRP-DOT試劑盒在瑞金醫院與國際著名的進口IMMAGEBECKMANCOULTER儀器及配套C-reactionproteinreagent定量試劑盒(批號M606025)做平行比較測定的結果如圖l所示。Beckman儀器和配套微顆粒膠乳免疫濁度CRP定量測定試劑盒是很高級的進口儀器和原裝試劑盒，價格昂貴，一般只有大醫院中心實驗室才有配置，其精度和結果公認可靠。由圖1顯示可知本發明的試劑盒測定結果與Beck隨n儀器和配套微顆粒膠乳免疫濁度CRP定量測定試劑盒測定的結果相關係數為0.9752，相關性很好。本發明可以在人體發生疾病時醫生當場可獲CRP測定結果，能快速判斷病人有否細菌感染，是否需抗生素治療，從而更有針對性地對病人進行有效處理，縮短治癒時間，減低醫療費用。圖1CRP-DOT和BeckmanCRP定量的結果對比；圖2CRP-D0T在U2上的標準曲線圖。Tn是U2儀器原始測定值具體實施例方式下面結合具體實施例，進一歩闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實例1使用二個單抗的CRP金標法快速定量檢測試劑的製備1.冷凍乾燥抗CRP免疫膠體金和反應板的製備按呂繩凱等介紹的方法(中華微生物學和免疫學雜誌，13(2):125，1993;上海醫學檢驗雜誌，5(1):62，1990)製備膠體金和抗CRP免疫膠體金綴合物。但包被膠體金的是純化CRP單抗，0.15mgCRP單抗用於包被10ml膠體金，2500ml膠體金在包被離心洗滌後，最終以pH7.4，0.01mol/L磷酸鹽緩衝液恢復到1500ml抗CRP免疫膠體金應用液，緩衝液含1腿SA、0.5mg/mlPEG20M、0.1%疊氮鈉。冷凍乾燥預冷溫度-35°C，最高升溫3(TC，抽真空時間20小時，瓶分裝量按需設定，但液體厚度不超過lcm(本公司凍幹膠體金製備發明專利ZL2004100180513)。包被反應板上硝基纖維膜的是針對另一反應決定簇的另一純化CRP單抗，濃度lmg/ml，點樣量3ul/點，點樣用的稀釋CRP單抗稀釋液是20mM/L醋酸鹽緩衝液，pH4.0，內含3%乙醇，反應板是膠體金定量檢測板(本公司中國外觀設計專利，專利號ZL033435278)。2.樣品稀釋液的製備樣品稀釋液按以下配方製備，PH7.47.6。tableseeoriginaldocumentpage73.凍幹膠體金恢復液含O.5mgNaN3/ml純淨水。4.洗滌液製備pH7.6tableseeoriginaldocumentpage75.封閉液製備:pH7.4~7.6、50mMPBS、含1MBSA(小牛血清白蛋白)。純化CRP單抗購自芬蘭MedixBiocheraica公司。測試方法採用本發明所述的稀釋樣品與膠體金在試管內反應後再加入反應板的斑點滲濾試驗液相反應操作模式，測試CRP標準品(參照國際標準CRM470)，U2在出廠前輸入各CRP標準品濃度測定值(見圖2)，固定貯存於U2儀器，醫院立即可用U2做樣品的定量測試。實例2CRP膠體金法快速定量檢測方法1.從冷藏處取出試劑，室溫至少平衡半小時，在抗CRP金標液凍幹品中，準確加入CRP凍幹品復溶液1.lml搖勻。2.使用清潔吸頭吸取100u1復溶後的CRP金標液，加入空的反應管，該吸頭只吸CRP金標液，防止任何汙染。3.將CRP反應板平放於頭'驗臺上，於反應孔內滴加2滴CRP封閉液，待完全滲入4.新鮮血清樣品不需要預處理，冰凍或r8。C存儲多閂的血清離心後取上清使用；精確吸取10ul血清加入CRP稀釋管(稀釋液體積見瓶貼，稀釋倍數一般不低於1:160)，充分混勻。5.吸取100li1稀釋樣品到反應管100u1CRP餘標液中，充分混勻(移液器反覆吸注10次必能混勻)，立刻將混勻物全部加入到封閉後的CRP反應板孔中。6.待完全滲入後，加入4滴CRP洗滌液7.待洗滌液完全滲入後，於5分鐘內在U2金標定量儀CRP項目下測讀CRP值。8.UpperGoldU-2金標法定量讀數儀按該儀器說明書操作。權利要求1.一種快速定量檢測C-反應蛋白(CRP)的膠體金法，其特徵在於待測樣品經40-480倍稀釋後與適當比例的抗待測物免疫膠體金在液相均質介質中充分混和均勻，再轉加到反應板上，具體包括下列步驟(1)從冷藏處取出抗CRP金標液凍幹品，室溫至少平衡半小時，在抗CRP金標液凍幹品中，準確加入標貼或說明書中規定體積的凍幹品復溶液搖勻；(2)吸取復溶後的金標液，加入空的反應管；(3)待測樣品加入樣品稀釋液進行40-480倍稀釋，充分混勻；(4)將反應板平放於實驗臺上，於反應孔內滴加封閉液，待完全滲入；(5)吸取稀釋樣品到反應管金標液中，充分混勻後將反應混合物全部加入到封閉後的反應板孔中；(6)待完全滲入後，加入洗滌液；(7)待洗滌液完全滲入後，測讀CRP值。2.如權利要求1所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於歩驟(1)中所述的抗CRP金標液中包被膠體金的是純化CRP單抗。3.如權利要求1所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於步驟(3)的樣品稀釋液為甘氨酸一NaOH緩衝液，離子強度20-200mM/L，pH7.0-8.0。4.如權利要求3所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於所述的甘氨酸一NaOH緩衝液pH7.4-7.6。5.如權利要求1所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於歩驟(3)中待測樣品加入樣品稀釋液進行160倍稀釋。6.如權利要求1所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於歩驟(4)中的封閉液為50mMPBS，含1WBSA(小牛血清白蛋白)，pH7.4—7.6。7.如權利要求1所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於步驟(5)中所述的反應板中包被反應板上硝基纖維膜的是針對不同反應決定簇的另一純化CRP單抗。8.如權利要求1所述的一種快速定量檢測CRP的膠體金法，其特徵在於步驟(6)中所述的洗滌液為0.0鵬S溶液，含Tween-20，pH7.6。9.一種快速定量檢測C一反應蛋白的膠體金法在製備C-反應蛋白快速定量試劑盒(膠體金法)中的應用。全文摘要本發明克服了常規C-反應蛋白(CRP)定量檢測方法不適合單人份測試、檢測時間較長等缺點，提供了一種快速、簡便、準確的快速定量檢測C-反應蛋白的膠體金法。反應原理為固相雙抗體夾心法的金標免疫斑點滲濾試驗，待測樣品經40-480倍稀釋後與免疫膠體金在液相均質介質中混和均勻，再轉加到反應板上，其中所含的、已與免疫膠體金在一起的待測物能為膜上固定的抗待測物另一決定簇的單抗或多抗特異性地捕獲，呈紅色斑點，斑點色澤與樣品中CRP濃度呈正比。文檔編號G01N33/577GK101320041SQ200710044730公開日2008年12月10日申請日期2007年8月9日優先權日2007年8月9日發明者徐建新申請人:上海奧普生物醫藥有限公司