用於分析被5，10，15，20四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp)標記的樣品的系統和方法

2023-08-03 05:31:01 2

專利名稱：用於分析被5，10，15，20四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp)標記的樣品的系統和方法
用於分析被5，10，15，20四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)標記的樣品的系統和方法相關串請的交叉引用本申請要求2009年7月17日提交的標題為「System and Method for AnalyzingSamples Labeled with5,10,15, 20, Tetrakis (4-Carboxyphenyl) Porphine (TCPP)(用於分析被5，10，15，20，四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)標記的樣品的系統和方法)」的美國臨時專利申請系列號61/226，646d的申請的優先權和權益，其說明書和權利要求書通過引用結
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不適用。
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背景技術：
研究疾病進展並分析組織樣品的異常(包括癌症在內)的病理學家已經確定，一種被稱為發育異常(dysplasia)的細胞狀態可以潛在地鑑定處於癌前狀態的細胞，所述發育異常是指細胞的異常形成或成熟。不被制止，發育異常可經由輕微的、中度的和嚴重的階段進展，最後進展為癌症。中等發育異常的病例中大約有七分之一會進展為癌症，已經報導在嚴重發育異常的病例中多至83%會進展為癌症，取決於涉及的細胞的種類。但是，除去輕微和中度的發育異常可極大地減少癌症的發展。在肺中，發育異常的細胞的除去不但極大地減少了癌細胞的形成，而且在有些情況下，肺組織會恢復至正常的形態。一般而言，越早地檢測到癌症，患者存活的預後越好。如果乳腺癌在其仍局限於單一團塊時被及早發現，五年存活率大於96%。當其已經擴散至遠端區域時，五年存活率小於20%。對於肺癌，當其作為單一團塊被發現時，五年存活大於46%。當其已經擴散時，五年存活小於14%。對於子宮頸癌，當在發展至更嚴重階段之前發現癌前病變並予以治療時，可實現存活的額外提高(Boring 和 Squiresl993, CA Cancer J Clin43:7-26 和 Fergusonl990,Hematol Oncol Clin N Am4:1053-1168)。肺癌目前是美國男性和女性的癌症死亡的首要原因(Wingo等人.1995，CAClinical J Clin45.8_30)。在1997年，估計有160，000人死於肺癌，佔美國男性總的癌症死亡的12%，佔美國女性癌症死亡總人數的2% (Boring&Squiresl993，出處同上)。肺癌也是最致命的癌症種類之一，正如五年存活率只有14%所反映的。與其他人癌症種類相比，肺癌患者的不良預後在很大程度上歸因於缺乏有效的早期檢測方法。在臨床(症狀的)呈現時期，所有患者中超過三分之二具有區域性結節累及或遠端轉移瘤(metastases)，這二者通常是無法治癒的。但是，在具有局限性(O期或I期)肺癌的患者的研究中，五年存活率已經介於40%至70%之間(Boring&Squires, 1993,出處同上；Ferguson, 1990,出處同上)。
在歷史上，唯一用來在症狀出現前檢測肺癌的診斷試驗是痰細胞學(sputumcytology)和胸部放射攝影術。結果，在過去幾十年的研究中，已經廣泛地評估了這些試驗作為大規模篩選工具的效力。兩種試驗檢測症狀發生前的早期癌症，尤其是扁平細胞癌。篩選方法的改進主要圍繞通過顯微術的技術進展來提高痰細胞學的效用。痰細胞學要求對細胞樣品進行目檢，在目檢期間，用細胞大小、形狀、構造以及細胞核與細胞質的大小比率來確定細胞的形態。因為這種細胞形態學的評估要求目檢和分類，所以該技術要求臨床觀測者具有極其大量的專業技術。已經進行的多項研究的結果提示，計算機輔助的高解析度圖像分析能夠檢測出與若干組織類型有關聯的看似正常的細胞核中無法目測的(subvisual)變化(Montag 等人.1991, Anal Quant Cytol Histol 13:159-167 ;Haroske 等人.1988, Arch Geschwulstforsch, 58:159-168 ;Hutchinson等人.1992, Anal Quant CytolEstol4 =330-334)。對細胞樣品中的DNA分布進行計算機輔助分析，會提供74%正確的細胞核形態學分類，與標準的細胞學試驗相比，該方法無需人工檢查材料，也無需存在可目測的異常細胞核。由於對肺腫瘤病理學理解的進展，也已經改善了細胞學樣本的形態學評估。許多這樣的工作已經集中在「生物標誌物」的鑑別。生物標誌物是指呼吸道黏膜的大範圍進行性表型和遺傳異常，其可用於確定支氣管上皮完全地轉變為惡性腫瘤的潛力。標誌物被大致分為:形態學改變、差異表達的蛋白的免疫/組織化學標誌物、基因組不穩定性的標誌物、表觀遺傳改變(例如，異常的甲基化)的標誌物和基因突變(Hirsh等人.1997，LungCancer 17:163-174)。現在，在從高危群體採集到的發育異常的和贅生性(neoplastic)細胞/組織學組織樣品中評價這些標誌物的表達水平。在這些樣本中，目前作為探測性標誌物分析的對象的是痰。對於痰樣品用於生物標誌物研究的興趣源自長期持有的觀點:由於肺癌最常見地發生於支氣管上皮，因而在痰中回收的脫落細胞可以是初期癌症的最早的可能的指示。通過應用複雜的分子遺傳學技術(例如，基於PCR的測定)，研究正在證實可在痰中檢測出選定的生物標誌物(Mao 等人.1994，Cancer Res54:1634-1637 ；Mao 等人.1994，Proc NatlAcad Sci USA91:9871-9875 ；Sidranskyl995, J Natl Cancer Inst87: 1201-1202 ；Tockman等人.1988，J Clin Oncol, 11:1685-1693 ；Tockman 等人.1994，Chest, 106:385s-390s)。商購可得的癌症篩選或檢測服務依賴於經過培訓的臨床醫師進行的基於細胞形態學診斷的試驗，所述醫師觀察各個樣品並確定異常細胞類型的程度和身份。該過程不僅昂貴和費時，它也引入人為判斷，並因此在操作中引入誤差。近年來，已經開發出了一種通過使用5，10，15，20-四(羧基苯基)-卟吩(TCPP)來檢測肺癌細胞的方法(Cole等人的美國專利號5，162，231)。該方法依賴於癌細胞與非癌細胞相比以更大的量從它們的環境中累積TCPP的傾向。在用200 μ g/ml TCPP溫育細胞樣品6_24小時後，TCPP進入細胞內，並與贅生性細胞的核周膜及線粒體結合。TCPP在紫外線下會發螢光，因此單獨憑藉螢光強度即可診斷出癌細胞，而無需參考形態學。該化合物用於鑑定癌前組織狀態(例如發育異常的細胞)的應用延伸，允許在高危群體中篩選以鑑別出其組織正向侵入性癌病症進展的那些個體，從而促進在最佳治療時期發現癌症或發育異常。這種篩選方法的合乎需要的特點是:快速的過程、廉價和需要最低的技術性專門技能。由於上述原因，需要用於檢測處於其最早階段的發育異常細胞的技術和方法。另夕卜，需要可客觀地提供高度可靠的診斷結果的技術，並且該技術不依賴於進行診斷的臨床醫師的主觀分析。

發明內容
本發明的一個實施方案提供一種通過獲得含有細胞的痰樣品來確定痰樣品是否含有發育異常的或癌性的細胞的方法。用TCPP標記所述痰樣品，以將疑似為發育異常的或癌性的細胞染色。將成像儀聚焦於一個或多個疑似為發育異常的或癌性的細胞的質膜上，並在聚焦於痰樣品的細胞的質膜上以後，檢測所述痰樣品的TCPP標記的細胞在約655nm+/-30nm的發射(如果存在的話)。測量傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的值。將測得的值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。另一個實施方案提供一種通過獲得疑似含有發育異常的或癌性的細胞的生物樣品來確定細胞的生物樣品是否含有發育異常的或癌性的細胞的方法。所述生物樣品被TCPP標記。用約475nm+/-30nm的激發波長的光激發所述樣品。將成像儀聚焦於疑似含有發育異常的或癌性的細胞的一個或多個細胞的質膜(plasma member)上，以獲得圖像。在聚焦於疑似含有發育異常的或癌性的細胞的生物樣品的一個或多個細胞的質膜上以後，檢測來自TCPP標記的細胞的在約655nm+/-30nm的發射(如果存在的話)。測量傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的值。將測得的值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。另一個實施方案提供一種用於使計算機能夠表徵痰樣品的計算機可讀介質，所述計算機可讀介質包含用於使計算機能夠執行預定操作的軟體指令或代碼。所述預定操作步驟包括:用約475nm+/-30nm的激發波長的光激發用TCPP標記的痰樣品；在所述標記的痰樣品內檢測來自被鑑別為巨噬細胞的細胞的、在約560nm+/-30nm的發射；將成像儀聚焦於疑似為發育異常的或癌性的一個或多個細胞的質膜上；在聚焦於痰樣品的細胞的質膜以後，檢測所述痰樣品的TCPP標記的細胞在約655nm+/-30nm處的發射(如果存在的話)；測量傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的測量值；和將測得的值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。在一個優選的實施方案中，所述TCPP是中-四(4-羧基苯基)卟吩。在另一個實施方案中，所述激發波長是約475nm+/-5nm。在另一個實施方案中，巨噬細胞的發射是約560nm+/-5nm。在另一個實施方案中，所述成像儀是螢光顯微鏡。在另一個實施方案中，TCPP標記的細胞的發射是約655nm+/-5nm。在另一個實施方案中,所述傳感器是CCD照相機。在另一個實施方案中，所述評分還包括:將測得的值與癌性的、發育異常的和非癌性的細胞的儲存值的資料庫進行對比，以基於對比結果來指定評分。在另一個實施方案中，所述痰樣品來自人。本發明的一個方面提供用中-四(4-羧基苯基)卟吩或5，10，15，20四(4_羧基苯基)卟吩(在本文中定義為「TCPP」)標記生物樣品以用於檢測癌性的和癌前細胞。本發明的另一個方面提供使用TCPP來檢測痰中的癌細胞，因為TCPP優先結合癌性的和癌前細胞。本發明的另一個方面提供一種系統和方法，其用於光學地驗證和定量TCPP的光譜特徵(spectral signature),和/或定量TCPP在用作標記化合物時的光子發射速率。
本發明的另一個方面提供使用配有可調節的濾波器和電荷耦合器件(CCD)的螢光系統分析TCPP標記的樣品。結合附圖，在以下的詳細描述閱讀中，本發明的其他目的和優點將是明顯的。附圖簡述本專利的文件含有至少一幅彩色繪製的圖。在請求並支付必要的費用後，含有彩圖的該專利的複製件將由專利和商標局(Patent and Trademark Office)提供。

圖1顯示用TCPP標記的細胞的重建的21層圖像。圖2顯示TCPP標記的質膜的螢光光譜(未校正的單元)。圖3顯示具有用紅色標記的目標區域的細胞的螢光圖像。圖4顯示來自圖1的光譜特徵的圖。圖5顯示來自圖6的藍色突出顯示區域的自身螢光的光譜特徵的圖。圖6顯示對其進行自身螢光成像且用TCPP標記的細胞。圖7顯示來自圖6的藍色突出顯示區域的TCPP標記的細胞膜的圖。圖8顯示在660nm聚焦的530nm層。圖9顯示在660nm聚焦的660nm層。發明詳述
當在本文中使用時，「一個(種)」表示一個(種)或多個(種)。當在本文中使用時，「CXD」是指電荷耦合器件。當在本文中使用時，樣品「生物樣品」或「樣品」或「樣本」是指整個生物體或其組織、細胞或組件部分(體液，包括但不限於血液、粘液、淋巴液、痰、血漿、精液、乳腺導管液、腦脊液、尿和排洩的糞便)的子集。根據本發明的一個實施方案，提供一種系統和方法，所述系統和方法用於確定:相對於來自非癌細胞的TCPP的光子發射量，與被認為是癌性的目標細胞結合的TCPP的光子發射量。由於我們是在確定相對的螢光量，並且所有細胞是在相同的環境中，所以我們不受限於各個螢光團的實際量子產率。本發明的一個實施方案提供用等式I (Eq.1)確定來自樣本的光子發射。

權利要求
1.一種確定痰樣品是否含有發育異常的或癌性的細胞的方法，所述方法包括: 獲得含有細胞的疲樣品； 用TCPP標記所述痰樣品，以將疑似為發育異常的或癌性的細胞染色； 用約475nm+/-30nm的激發波長的光激發所述標記的痰樣品； 在所述痰樣品內檢測來自被鑑定為巨噬細胞的細胞的、在約560nm+/-30nm的發射； 將成像儀聚焦於一個或多個疑似為發育異常的或癌性的細胞的質膜上； 在聚焦於所述痰樣品的細胞的質膜上以後，如果存在的話，檢測所述痰樣品的TCPP標記的細胞在約655nm+/-30nm的發射； 測量傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的值；和 對測得的值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述TCPP是中-四(4-羧基苯基)卟吩。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述激發波長是約475nm+/-5nm。
4.根據權利要求1所述的方法，其中巨噬細胞的發射是約560nm+/-5nm。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述成像儀是螢光顯微鏡。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述TCPP標記的細胞的發射是約655nm+/-5nm。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述傳感器是CCD照相機。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述評分還包括:將所述測得的值與癌性的、發育異常的和非癌性的細胞的儲存的值的資料庫進行對比，以基於所述對比的結果來分配評分。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述痰樣品來自人。
10.一種確定細胞的生物樣品是否含有發育異常的或癌性的細胞的方法，所述方法包括: 獲得疑似含有發育異常的或癌性的細胞的生物樣品； 用TCPP標記所述生物樣品，以將疑似為發育異常的或癌性的細胞染色； 用約475nm+/-30nm的激發波長的光激發所述樣品； 將成像儀聚焦於一個或多個疑似為含有發育異常的或癌性的細胞的質膜上，以獲得圖像； 在聚焦於疑似含有發育異常的或癌性的細胞的生物樣品的一個或多個細胞的質膜上以後，如果存在的話，檢測來自TCPP標記的細胞的、在約655nm+/-30nm的發射； 測量所述傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的值；和 對測得的所述值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。
11.根據權利要求10所述的方法，所述方法還包括: 檢測被鑑別為目標細胞的細胞在約560nm+/-30nm的發射。
12.根據權利要求10所述的方法，其中所述TCPP是中-四(4-羧基苯基)卟吩。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述激發波長是約475nm+/-5nm。
14.根據權利要求10所述的方法，其中巨噬細胞的發射是約560nm+/-5nm。
15.根據權利要求10所述的方法，其中所述成像儀是螢光顯微鏡。
16.根據權利要求10所述的方法，其中所述TCPP標記的細胞的發射是約655nm+/-5nm。
17.根據權利要求10所述的方法，其中所述傳感器是CCD照相機。
18.根據權利要求10所述的方法，其中所述評分還包括:將所述測得的值與癌性的、發育異常的和非癌性的細胞的儲存的值的資料庫進行對比，以基於所述對比的結果來分配評分。
19.根據權利要求10所述的方法，其中所述痰樣品來自人。
20.一種用於使計算機能夠表徵痰樣品的計算機可讀介質，所述計算機可讀介質包含使計算機能夠執行下述步驟的預定操作的軟體指令: 用約475nm+/-30nm的激發波長的光激發用TCPP標記的痰樣品； 在所述標記的痰樣品內檢測來自被鑑別為巨噬細胞的細胞的、在約560nm+/-30nm的發射； 將成像儀聚焦於一個或多個疑似為發育異常的或癌性的細胞的質膜上； 在聚焦於所述痰樣品的細胞的質膜上以後，如果存在的話，檢測所述痰樣品的TCPP標記的細胞在約655nm+/-3 0nm的發射； 測量傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的值；和 對測得的值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。
全文摘要
本發明的一個實施方案提供一種通過獲得含有細胞的痰樣品來確定痰樣品是否含有發育異常的或癌性的細胞的方法。用TCPP標記所述痰樣品，以將疑似為發育異常的或癌性的細胞染色。用約475nm+/-30nm的激發波長的光激發所述標記的痰樣品，並檢測來自被鑑定為巨噬細胞的細胞的、在約560nm+/-30nm的發射。將成像儀聚焦於一個或多個疑似為發育異常的或癌性的細胞的質膜上，並在聚焦於痰樣品的細胞的質膜以後，檢測所述痰樣品的TCPP標記的細胞在約655nm+/-30nm的發射(如果存在的話)。測量傳感器的每個像素的光子通量，以獲得成像的細胞的值。將測得的值評分，以確定細胞是否是癌性的或發育異常的。
文檔編號G01N33/48GK103168234SQ201080069134
公開日2013年6月19日 申請日期2010年7月19日 優先權日2009年7月17日
發明者康斯坦絲·多裡安, 約翰·卡曾斯, 戈登·本內特 申請人:比奧莫達公司