一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法

2023-07-05 00:32:56 3

一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法，屬於戒毒藥物領域。所述抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法包括：將甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原對產蛋雞進行免疫，收集免疫後的所述產蛋雞產下的雞蛋，提取並純化所述雞蛋中的卵黃抗體，得到的所述卵黃抗體即為抗甲基苯丙胺的卵黃抗體。所述抗甲基苯丙胺的卵黃抗體，特異性抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可以先中和患者血液中游離的甲基苯丙胺，從而減少甲基苯丙胺進入患者中樞神經系統的量，並進一步降低甲基苯丙胺對腦內神經元的毒性，同時，該抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可作為毒品分子受體阻斷劑，在一定程度上可以阻止毒品的正性強化，從而淡化了患者的心理渴求並減少患者復吸的可能性。
【專利說明】一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及戒毒藥物領域，特別涉及一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法。【背景技術】
[0002]甲基苯丙胺屬於中樞興奮劑，對動物及人類大腦神經元具有毒性作用，其半衰期長達10-30小時，其毒性作用主要表現為高熱、血壓升高、心律失常等中樞及交感神經系統的刺激症狀以及錯亂、譫妄等嚴重精神症狀，重度中毒時可至死亡，長期使用、短時間反覆使用或一次性大劑量使用甲基苯丙胺均可導致成癮。
[0003]針對甲基苯丙胺過量及復吸的防治，近年來研究者們正進行著積極的探索，但大多數防治都局限於甲基苯丙胺已經對中樞神經系統發揮毒理作用後，例如，針對多巴胺系統的藥物安非他酮、司來吉蘭、以及作用於Y -氨基丁酸系統的藥物氨己烯酸、巴氯芬等。
[0004]在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題:
[0005]上述藥物均處於實驗研究階段，並且療效不顯著且特異性不強。吸食者大多是因為吸食甲基苯丙胺過量後精神發作等原因就醫，而且這種狀況呈逐年遞增趨勢，但目前臨床上缺乏針對甲基苯丙胺的特異性治療藥物。針對甲基苯丙胺半衰期長的毒理學特點，迫切需要開發快速、高效、特異性強的解毒藥物。

【發明內容】

[0006]為了解決現有技 術中缺乏針對甲基苯丙胺的特異性治療藥物的問題，本發明實施例提供了一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法。所述技術方案如下:
[0007]本發明提供了一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法，所述方法包括:
[0008]將甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原對產蛋雞進行免疫,收集免疫後的所述產蛋雞產下的雞蛋，提取並純化所述雞蛋中的卵黃抗體，得到的所述卵黃抗體即為抗甲基苯丙胺的卵黃抗體。
[0009]進一步地，所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的製備方法為JfN- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原和牛血清白蛋白分別加入PH值為7.0的磷酸鹽緩衝液中，所述N-(4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原、所述牛血清白蛋白和所述磷酸鹽緩衝液的質量比為7:9:1，混勻後再加入質量分數為1%~2%的戊二醛試劑，攪拌至反應液清晰透明，將所述清晰透明的反應液進行第一次離心，得到上清液，將所述上清液通過所述磷酸鹽緩衝液於透析袋中進行透析，將透析後的所述反應液再進行第二次離心，得到上層清液，所述上層清液中含有所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原，即形成甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液。
[0010]具體地，所述N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原的製備方法為:將甲基苯丙胺溶於無水乙醇，加入N-(4溴丁基)鄰苯二甲醯亞胺-無水乙醇溶液，加熱回流，待回流反應結束後，加入濃度為80%的水合肼，混合均勻，再次加熱回流，待回流反應結束後，用鹽酸酸化，過濾後收集濾液，將所述濾液用三氯甲烷萃取三次，收集萃取產物，並將所述萃取產物經真空抽濾得到固體產物，將所述固體產物烘乾，得到所述N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原。[0011]具體地,所述第一次離心的轉速為4000r/min,所述第一次離心的時間為lOmin。
[0012]具體地，所述透析的時間為至少24h。
[0013]具體地，所述第二次離心的轉速為8000r/min，所述第二次離心的時間為lOmin。
[0014]進一步地，所述對產蛋雞進行免疫的方法為:對所述產蛋雞的背部進行皮下多點免疫注射，共注射4個周期，I個周期為10天，I天I次，每次注射500ug所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液，從第4個周期開始收集所述雞蛋。[0015]具體地，在免疫注射的第I個周期中，將所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，製備成第一甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑，採用所述第一甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑對所述產蛋雞進行免疫注射。
[0016]在免疫注射的第2-4個周期中，將所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液與不弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，得到第二甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑，採用所述第二甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑對所述產蛋雞進行免疫注射。
[0017]進一步地，所述採用卵黃抗體提取試劑盒提取並純化所述卵黃抗體的方法為:將免疫後的所述產蛋雞產下的所述雞蛋的蛋黃和蛋白分離；
[0018]將所述蛋黃和去脂劑按照體積比1:5混合均勻，4 °C溫育2-24小時後，經4000-10000r/min離心15min，得到上層無色透明上清液；
[0019]攪拌所述上層無色透明上清液，並加入等體積的卵黃抗體沉澱劑，混合均勻，4°C溫育1-24小時後，加入預冷的離心管中，4000-10000r/min離心15min，棄掉上清液，所得到片狀沉澱物即為所述抗甲基苯丙胺的卵黃抗體。
[0020]具體地，採用卵黃抗體提取試劑盒提取並純化所述卵黃抗體。
[0021]本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是:本發明提供的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體，一方面，在搶救甲基苯丙胺吸毒過量的患者時，特異性抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可以先中和患者血液中游離的甲基苯丙胺，從而減少甲基苯丙胺由血液進入患者中樞神經系統的量，進一步降低甲基苯丙胺對腦內神經元的毒性，使得抗甲基苯丙胺的卵黃抗體起到了 「先鋒保護」的作用，同時，抗甲基苯丙胺的卵黃抗體能夠為患者的後期治療贏得寶貴的時間。另一方面，在毒品復吸的防治中，該抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可作為毒品分子受體阻斷劑，在一定程度上可以阻止毒品的正性強化，從而淡化了患者的心理渴求並減少患者復吸的可能性，使復吸者即使加大吸食劑量也無法獲得快感，進而減少成癮及復吸行為，同時，抗甲基苯丙胺的卵黃抗體具有很高的安全性，且無成癮性，特異性高，易製備，成本低，具有廣泛的應用範圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0023]圖1是本發明實施例提供的N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原紅外吸收譜圖；
[0024]圖2是本發明實施例提供的牛血清白蛋白、甲基苯丙胺及甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的紫外可見光吸收譜圖；[0025]圖3是本發明實施例提供的甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的電泳分析圖；
[0026]圖4是本發明實施例提供的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的電泳分析圖；
[0027]圖5是本發明實施例提供的甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原經電泳並經抗甲基苯丙胺的卵黃抗體染色後的電泳分析免疫印跡圖；
[0028]圖6是本發明實施例提供的用抗甲基苯丙胺的卵黃抗體幹預後，小白鼠腦組織及血清中的甲基苯丙胺藥物濃度高效液相色譜分析圖，其中，*表示與對照組有顯著性差異，Ρ〈0.05 ；
[0029]圖7是本發明實施例提供的給予抗甲基苯丙胺的卵黃抗體幹預後，大鼠腦組織及血清中甲基苯丙胺藥物濃度與大鼠刻板行為評分的相關性分析圖；
[0030]圖8是本發明實施例提供的給予抗甲基苯丙胺的卵黃抗體幹預後，大鼠腦組織及血清中甲基苯丙胺藥物濃度與大鼠甲基苯丙胺靜脈自身給藥行為的相關性分析圖。
【具體實施方式】
[0031]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。
[0032]本發明中所用的甲基苯丙胺鹽酸鹽來源於湖北省公安廳，其他試劑均為市售試劑，其中，磷酸鹽緩衝液的成分為:濃度為0.1M的磷酸二氫鈉，濃度為0.1M的磷酸二氫鉀，濃度為0.1M的氯化鉀，濃度為0.1M的氯化鈉，且磷酸鹽緩衝液的pH值為7.0 ;戊二醛試劑為戊二醛分析純；三氯甲烷為三氯甲烷分析純；弗氏完全佐劑和不弗氏完全佐劑均由美國sigma公司提供。
[0033]實施例
[0034]一、甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的製備
[0035]I半抗原的合成與鑑定
[0036]該半抗原能與對應的抗體結合形成抗原-抗體，且該半抗原又不能單獨激發人或動物體產生抗體。
[0037]1.1 合成
[0038]稱取150mg甲基苯丙胺鹽酸鹽溶於150mg蒸懼水中，滴加濃度為lmol/L的NaOH溶液，至析出遊離態的甲基苯丙胺為止，用三氯甲烷(分析純)萃取，將萃取產物用Na2SO4乾燥析出的甲基苯丙胺，將析出的甲基苯丙胺過濾，蒸發溶劑，得到甲基苯丙胺。將120mg甲基苯丙胺溶於120ml無水乙醇(光譜純)中，再加入lOOmllmol/L的N- (4溴丁基)鄰苯二甲醯亞胺-無水乙醇溶液，可適當加入l_5ml三乙胺幫助甲基苯丙胺溶解，加熱回流，待回流反應結束後，繼續加入120ml濃度為80%的水合肼，混合均勻，再次加熱回流，待回流反應結束後，用鹽酸酸化回流產物，過濾後收集濾液，將該濾液用三氯甲烷萃取三次，收集萃取產物，並將萃取產物經真空抽濾得到固體產物，將該固體產物烘乾，得到N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原。
[0039]1.2 鑑定
[0040]將N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原通過KBr (溴化鉀)壓片法製備成壓片，測試用Nicolt的MAGNA-1R760型傅立葉變換紅外光譜儀作紅外分析，掃描波數範圍400~4000CI!!—1，結果參見圖1，由圖1可知，在波數為3400CHT1附近有一寬的峰，其為N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原中的一 NH2基團伸縮振動的吸收峰，在波數為3000CHT1附近有強烈的吸收峰，該吸收峰是由引入的-CH2-鏈伸縮振動引起的。由上述結果可判斷:甲基苯丙胺結構中成功接入一 NH2基團，且合成產物為N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原。
[0041]2抗原的合成與鑑定
[0042]2.1 合成
[0043]稱取50mgN_ (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原和64mg牛血清白蛋白分別溶於7ml磷酸鹽緩衝液(PBS)中，於4°C下攪拌混合均勻，加入質量分數為1%~2%的戊二醛試劑，室溫(23°C ±2°C)下攪拌至少1Oh至反應液清晰透明，將清晰透明的反應液進行第一次離心，離心的轉速為4000r/m1n，離心的時間為lOm1n，得到上清液，將該上清液通過pH7.0的磷酸鹽緩衝液透析於透析袋中進行透析，透析時間至少24h，將透析後的反應液再進行第二次離心，離心的轉速為8000r/m1n，離心的時間為lOm1n，得到上層清液，該上層清液中含有甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原，即形成甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液。
[0044]2.2紫外光譜鑑定
[0045]將牛血清白蛋白(S1gma, BSA)>甲基苯丙胺(Methamphetam1ne, METH)及甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原(METH-bsa)按照質量比為1:1:1配成溶液後，用紫外可見光分光光度計(H1tach1，U-3010)在波長為190~400nm範圍內測量該溶液的最大吸收波長，結果參見圖2，由圖2可知，甲基苯丙胺在波長260nm和220nm處各有一個最大吸收峰，牛血清白蛋白在波長215nm和285nm處各有一個最大吸收峰；而甲基苯丙胺_牛血清白蛋白抗原與甲基苯丙胺及牛血清白蛋白的結果有明顯的不同，甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的吸收峰在牛血清白蛋白的基礎上有所增加，且稍高於甲基苯丙胺，在260nm處抗原的吸收值高於牛血清白蛋白相應位置的吸收峰，根據紫外吸收光的加合性可認為成功合成了甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原，並根據紫外吸收光譜的加合性，推算甲基苯丙胺與牛血清白蛋白的結合比約為25:1。
[0046]2.3電泳鑑定
[0047]電泳採用聚丙烯醯胺凝膠電泳，下膠為濃度為10%的聚丙烯醯胺，上膠為濃度為5%的聚丙烯醯胺，上樣量為20 μ g，結果參見圖3，由圖3可知，甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的分子量比牛血清白蛋白的分子量大，也就是說，牛血清白蛋白偶聯到甲基苯丙胺上以後其分子量會增加，這進一步證實了牛血清白蛋白與甲基苯丙胺偶聯成功。
[0048]二、抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備
[0049] 1免疫
[0050]選取30周齡的來杭產蛋雞為產蛋雞，在30周齡的來杭產蛋雞的背部皮下多點進行免疫注射，共注射4個周期，1個周期為10天，1天1次，每次注射500ug甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液，從第4個周期開始收集雞蛋。
[0051]在免疫注射的第1個周期注射中，將甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，製備成第一甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑，採用第一甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑對產蛋雞進行免疫注射。
[0052]在免疫注射的第2-4個周期中，將甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液與不弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，得到第二甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑，採用第二甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑對產蛋雞進行免疫注射。[0053]2 提純
[0054]用卵黃抗體提取試劑盒(Thermo ,USA)提取並純化卵黃抗體，採用該提取試劑盒進行提純，可使每隻雞蛋中提取80-120mg的卵黃抗體，且提取的卵黃抗體的純度為90%。
[0055]具體提純步驟如下(參見卵黃抗體提取試劑盒說明書):
[0056]A.小心徹底的分離收集的雞蛋的蛋黃和蛋白，並準確測量所獲得的蛋黃的體積及質量。
[0057]B.去除蛋黃中的脂質成分:具體地，按蛋黃:去脂劑=1:5的體積比混合，緩慢輕柔的持續攪拌直至混合均勻，4°C溫育2-24小時後，經4000-10000g離心15min，得到上層無色透明上清液，並將該上層無色透明上清液置於量筒中記錄體積。
[0058]C.卵黃抗體沉澱
[0059]輕柔攪拌該上層無色透明上清液，同時加入等體積的卵黃抗體沉澱劑，該卵黃抗體沉澱劑由該試劑盒提供，用於將上清液混合均勻，持續輕柔攪拌2分鐘，4°C溫育1-24小時，輕柔混合混懸液，加入至預冷的離心管中，經4000-10000r/min離心15min,棄掉上清液，所得片狀沉澱物即為提純的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體，可在提純的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體中加入適量牛血清白蛋白充分溶解，製備成溶液，為後續試驗做準備，記錄其體積，於-20°C條件下凍存。
[0060] 3 鑑定
[0061]3.1聚丙烯醯胺凝膠電泳測定分子量
[0062]用濃度為15%的聚丙烯醯胺凝膠電泳分析抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的分子量，利用考馬斯亮藍R-250染色，結果參見圖4，純化後的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體在66ku和27ku處均可見明顯的電泳帶，由此可見提純的卵黃抗體為抗甲基苯丙胺的卵黃抗體。
[0063]3.2蛋白質印跡法測定抗原性
[0064]將甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原進行聚丙烯醯胺凝膠電泳後，甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原電轉至硝酸纖維素膜上，再進行蛋白質印跡法(Western Blot)進行染色，結果參見圖5，一抗為免疫後抗甲基苯丙胺的卵黃抗體(條帶1)，二抗為羊抗雞IgG HR P(條帶2)，其中，羊抗雞IgG HR P為辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG，其作用為用於顯色，免疫前條帶I為對照，可見明顯的抗原抗體反應，這進一步證實了抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備成功，且抗甲基苯丙胺的卵黃抗體具有抗原性。
[0065]三、測定體內及體外試驗中抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的中和效價，並確定最佳的中和劑量
[0066]1、體外抗甲基苯丙胺的卵黃抗體IgY的免疫中和效價檢測
[0067]米用間接ELISA 法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,酶聯免疫吸附劑測定)，以5μg/ml甲基苯丙胺完全抗原碳酸緩衝液(pH9.6) 100 μ I/孔包被96孔酶標板經4°C放置過夜後，取出後以ρΗ7.4的PBST緩衝液(含質量分數為0.05% Tween-20的上述磷酸鹽緩衝液，其中Tween-20為吐溫-20)洗滌酶標板3次，再以含質量分數為I %的牛血清白蛋白的PBST封閉液(含質量分數為0.01% Tween-20的磷酸鹽緩衝液)100 μ I每孔封閉酶標板，37°C溫育2h;取出後洗滌、甩幹，每孔加以抗甲基苯丙胺的卵黃抗體稀釋液(含質量分數為1%的牛血清白蛋白的PH7.0的上述PBST緩衝液)稀釋的不同稀釋倍數的純化抗甲基苯丙胺的卵黃抗體100 μ 1，同時以免疫前的卵黃抗體作為陰性對照，以未包被甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原孔加入經稀釋的卵黃抗體做空白對照，37°C溫育1.5h ;洗滌後加入HRP標記的兔抗雞IgG (按體積比I: 5000稀釋)100 μ 1，37°C溫育1.5h ;洗滌後每孔加入底物3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺(TMB)溶液100 μ 1，37°C顯色15min，每孔加50 μ 12mol/L H2SOjS止反應，在酶標儀上讀取波長為450nm的吸光度(A)值。結果判斷:測定孔A值>陰性對照孔均值2.1倍以上，可判定本發明所製備的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體為陽性，且最高效價達1:10240，由此可見免疫效果良好。
[0068]2、抗甲基苯丙胺的卵黃抗體灌胃後血清和腦組織中的甲基苯丙胺的藥物濃度測定
[0069]選用健康昆明小白鼠20隻，隨機分成2組，每組10隻。將50mg/kg的甲基苯丙胺與300mg/kg的純化的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體溶液混合,置37°C恆溫水浴箱中溫育60min,予以小白鼠灌胃，0.5ml/只。同時以免疫前抗甲基苯丙胺的卵黃抗體與甲基苯丙胺溶液混合，溫育後小鼠灌胃作為對照組，灌胃6小時後處死小白鼠，分別取血清及腦組織勻漿液上清進行高效液相色譜分析，測得結果參見圖6，，該圖中縱坐標表示甲基苯丙胺濃度(μ g/ml)，且圖6中*表示與對照組相比有顯著性差異，由圖6可知，給予抗甲基苯丙胺的卵黃抗體幹預，確實能顯著降低了小白鼠血清及腦組織中甲基苯丙胺的濃度，具體結果如圖6所示，對照組腦組織中為46.05ug/ml,血清為3.55ug/ml,用藥組(IgY)腦組織中為18.4ug/ml,血清為 2.4ug/ml。
[0070]四、抗甲基苯丙胺的卵黃抗體對大鼠甲基苯丙胺藥物過量模型中和能力的評估
[0071]選用健康SD大鼠20隻，隨機分成2組,每組10隻。將60mg/kg的甲基苯丙胺與300mg/kg的純化的抗甲基苯丙胺的卵黃抗 體溶液混合,置37°C恆溫水浴箱中溫育60min,予以大鼠灌胃，lml/只。同時以免疫前抗甲基苯丙胺的卵黃抗體與甲基苯丙胺溶液混合，溫育後大鼠灌胃作為對照組，灌胃6小時後進行刻板行為評分，行為學觀察結束後處死大鼠，分別取血清及腦組織勻漿液上清進行高效液相色譜分析，將比對結果以圖7形式表示，由圖7可知給予抗甲基苯丙胺的卵黃抗體幹預確實能顯著降低大鼠血清及腦組織中甲基苯丙胺的濃度，同時有效減輕甲基苯丙胺誘導的大鼠刻板行為的發生。
[0072]五、抗甲基苯丙胺的卵黃抗體對大鼠甲基苯丙胺靜脈自身給藥行為的影響
[0073]選用健康SD大鼠20隻，隨機分成2組，每組10隻。建立大鼠甲基苯丙胺靜脈自身給藥模型後，將60mg/kg的甲基苯丙胺與300mg/kg的純化的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體溶液混合，置37°C恆溫水浴箱中溫育60min，予以大鼠灌胃，Iml/只。同時以免疫前抗甲基苯丙胺的卵黃抗體與甲基苯丙胺溶液混合，溫育後大鼠灌胃作為對照組，灌胃6小時後進行甲基苯丙胺引燃的復吸行為評分(以單位時間內有效鼻觸次數為判斷標準)，行為學觀察結束後處死大鼠，分別取血清及腦組織勻漿液上清進行高效液相色譜分析，將比對結果以圖8形式表示，由圖8可知給予抗甲基苯丙胺的卵黃抗體幹預確實能顯著降低大鼠血清及腦組織中甲基苯丙胺的濃度，同時有效減輕甲基苯丙胺誘導的大鼠復吸行為的發生。
[0074]本發明提供的抗甲基苯丙胺的卵黃抗體，一方面，在搶救甲基苯丙胺吸毒過量時，特異性抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可以先中和患者血液中游離的甲基苯丙胺，從而減少甲基苯丙胺由血液進入患者中樞神經系統的量，進一步降低甲基苯丙胺對腦內神經元的毒性，使得抗甲基苯丙胺的卵黃抗體起到了 「先鋒保護」的作用，同時，抗甲基苯丙胺的卵黃抗體能夠為患者的後期治療贏得寶貴的時間。另一方面，在毒品復吸的防治中，該抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可作為毒品分子受體阻斷劑，在一定程度上可以阻止毒品的正性強化，從而淡化了患者的心理渴求並減少患者復吸的可能性，使復吸者即使加大吸食劑量也無法獲得快感，進而減少成癮及復吸行為，同時，抗甲基苯丙胺的卵黃抗體具有很高的安全性，且無成癮性，特異性高，易製備，成本低，具有廣泛的應用範圍，該抗甲基苯丙胺的卵黃抗體可以口月艮，精製後也可以 注射，還可以添加到食品、飲料中，為吸食新型毒品的食療提供更易被接受、更安全、更經濟的方法，極具社會價值，還可用作診斷試紙條的包被抗體，亦可應用於臨床診斷試劑盒的開發，較傳統的基於單克隆抗體製備的試劑盒更經濟。
[0075]以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種抗甲基苯丙胺的卵黃抗體的製備方法，其特徵在於，所述方法包括: 將甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原對產蛋雞進行免疫，收集免疫後的所述產蛋雞產下的雞蛋，提取並純化所述雞蛋中的卵黃抗體，得到的所述卵黃抗體即為抗甲基苯丙胺的卵黃抗體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原的製備方法為:將N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原和牛血清白蛋白分別加入pH值為7.0的磷酸鹽緩衝液中，所述N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原、所述牛血清白蛋白和所述磷酸鹽緩衝液的質量比為7:9:1，混勻後再加入質量分數為1%~2%的戊二醛試劑，攪拌至反應液清晰透明，將所述清晰透明的反應液進行第一次離心，得到上清液，將所述上清液通過所述磷酸鹽緩衝液於透析袋中進行透析，將透析後的所述反應液再進行第二次離心，得到上層清液，所述上層清液中含有所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原，即形成甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述N-(4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原的製備方法為:將甲基苯丙胺溶於無水乙醇中，加入N-( 4溴丁基)鄰苯二甲醯亞胺-無水乙醇溶液，加熱回流，待回流反應結束後，加入濃度為80%的水合肼，混合均勻，再次加熱回流，待回流反應結束後，用鹽酸酸化回流產物，過濾後收集濾液，將所述濾液用三氯甲烷萃取三次，收集萃取產物，並將所述萃取產物經真空抽濾得到固體產物，將所述固體產物烘乾，得到所述N- (4胺丁基)甲基苯丙胺半抗原。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述第一次離心的轉速為4000r/min，所述第一次離心的時間為IOmin。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述透析的時間為至少24h。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述第二次離心的轉速為8000r/min，所述第二次離心的時間為lOmin。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述對產蛋雞進行免疫的方法為:對所述產蛋雞的背部進行皮下多點免疫注射，共注射4個周期，I個周期為10天，I天I次，每次注射500ug所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液，從第4個周期開始收集所述雞蛋。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，在免疫注射的第I個周期中，將所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，製備成第一甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑，採用所述第一甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑對所述產蛋雞進行免疫注射； 在免疫注射的第2-4個周期中，將所述甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原溶液與不弗氏完全佐劑按體積比1:1混合，得到第二甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑，採用所述第二甲基苯丙胺-牛血清白蛋白抗原乳劑對所述產蛋雞進行免疫注射。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述採用卵黃抗體提取試劑盒提取並純化所述卵黃抗體的方法為:將免疫後的所述產蛋雞產下的所述雞蛋的蛋黃和蛋白分離； 將所述蛋黃和去脂劑按照體積比1:5混合均勻，4°C溫育2-24小時後，經4000-10000r/min離心15min，得到上層無色透明上清液； 攪拌所述上層無色透明上清液，並加入等體積的卵黃抗體沉澱劑，混合均勻，4°C溫育1-24小時後，加入預冷的 離心管中，4000-10000r/min離心15min，棄掉上清液，所得到片狀沉澱物即為所述抗甲基苯丙胺的卵黃抗體。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，採用卵黃抗體提取試劑盒提取並純化所述卵 黃抗體。
【文檔編號】C07K16/02GK103897062SQ201410066327
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】陳琳, 李超英, 樂凱, 茹琴, 馬寶苗, 田香, 熊琪 申請人:江漢大學