一種黃萱益肝片的製備方法及其在製備抑制黑色素瘤細胞b16細胞增殖藥物中的應用的製作方法
2023-07-05 08:48:36
一種黃萱益肝片的製備方法及其在製備抑制黑色素瘤細胞b16細胞增殖藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於中藥【技術領域】，具體涉及一種黃萱益肝片的製備方法及應用。本發明的黃萱益肝片的製備方法，由土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥製成，採用超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附製備而成，使得大黃素含量有很大提高。本發明還提供了黃萱益肝片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】-種黃萱益肝片的製備方法及其在製備抑制黑色素瘤細胞 B16細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於中藥【技術領域】，具體涉及一種黃萱益肝片的製備方法及其在製備抑制 小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 黃萱益肝散標準號WS-10465(ZD-0465)-2002,記載於國家中成藥標準彙編內科肝 膽分冊。由土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐 芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥製成，具有清熱解毒，疏肝利膽的功效。用 於肝膽溼熱所致的慢性B型肝炎。
[0003] 現有技術中，尚未有黃萱益肝散在提取製備方面採用CO2超臨界萃取、微波技術和 大孔樹脂吸附技術提取的報導，而中藥直接打粉取的方法，工藝粗糙、落後，雜質多，導致患 者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種黃萱益肝片的製備方法。
[0005] 本發明的另一個目的在於提供一種黃萱益肝片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16 細胞增殖藥物中的應用。
[0006] 本發明的目的是通過如下的方案實現的： 一種黃萱益肝片的製備方法，由土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、稱猴桃92g、紅土 茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥製成，所述的製備 方法由下列步驟組成：取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到C02超臨界萃取器 中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力20-30MPa，溫度 30-50°C，CO 2流量l-3ml/g生藥·π?η，萃取時間130-170min，得超臨界萃取物，備用；萃取 後的野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃 取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合併萃取液，濃縮， 加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮 並乾燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥， 壓片，製成200片，每片重0. 5g。
[0007] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑佔總萃取溶劑的 體積百分比為5%。
[0008] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0010] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生 藥· min〇
[0011] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為150min。
[0012] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 上述的黃萱益肝片的製備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
[0014] 上述的黃萱益肝片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
[0015] 現有技術中，黃萱益肝散口服，成人一次9g，一日3次。黃萱益肝散服藥量大。米 用本發明方法製備成的黃萱益肝片每片重〇. 5g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多 活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。
[0016] 試驗一、不同方法製備的黃萱益肝片中大黃素含量的比較 1、儀器及試藥本發明黃萱益肝片：按實施例1方法製備，使用918g原料藥，經提取製成 200片，每片重0. 5g。原黃萱益肝散，按照WS-10465 (ZD-0465) -2002標準方法製備，作為 對照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；大黃素對照品（中國藥品生物 製品檢定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0018] 色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；甲醇-0. 25% 磷酸溶液（80 : 20)為流動相；檢測波長為436nm。理論板數按大黃素峰計算應不低於 3000。
[0019] 對照品溶液的製備取經五氧化二磷乾燥至恆重的大黃素對照品適量，精密稱 定，加甲醇製成每Iml含0. 05mg的溶液，即得。
[0020] 本發明產品供試品溶液的製備取本發明的黃萱益肝片，研細，取〇.4g，精密稱 定，置索氏提取器中，加乙醇適量，加熱回流提取至無色，提取液濃縮至約5ml，放冷，加入稀 鹽酸5ml，氯仿30ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿液，水液用氯仿振搖提取2次（20ml、 15ml)，合併氯仿液，蒸乾，殘渣加甲醇使溶解並移至IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，離心，取上清液，即得。
[0021] 對照品供試品溶液的製備取本對照的黃萱益肝散，研細，混勻，取2g，精密稱定， 置索氏提取器中，加乙醇適量，加熱回流提取至無色，提取液濃縮至約5ml，放冷，加入稀鹽 酸5ml，氯仿30ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿液，水液用氯仿振搖提取2次（20ml、 15ml)，合併氯仿液，蒸乾，殘渣加甲醇使溶解並移至IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，離心，取上清液，即得。
[0022] 測定法分別精密吸取對照品溶液、本發明產品供試品溶液與對照品供試品溶液 各1〇μ1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0023] 3、結果 結果表明，本發明黃萱益肝片中大黃素的含量為2-4mg/片；而原黃萱益肝散中大黃素 的含量為〇. 21mg/粒，每片大黃素含量相當於散劑每g散劑含量的10-20倍，在服用量減少 的情況下，大黃素含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，採用本發明製備方法製備的黃萱益肝片，有效成分含量遠遠高於 WS-10465 (ZD-0465) -2002標準記載的方法製備的黃萱益肝散。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解 本發明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例，凡基於本發明上述 內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
[0026] 實施例1 取土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa， 溫度40°C，CO 2流量2ml/g生藥· min，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合併萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成 200片，每片重0. 5g。
[0027] 經檢測，成品中大黃素的含量為4. 02mg/片。
[0028] 實施例2 取土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa， 溫度50°C，CO 2流量3ml/g生藥· min，萃取時間130min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合併萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成 200片，每片重0. 5g。
[0029] 經檢測，成品中大黃素的含量為2. 03mg/片。
[0030] 實施例3 取土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力20MPa， 溫度30°C，CO 2流量lml/g生藥· min，萃取時間170min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合併萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成 200片，每片重0. 5g。
[0031] 經檢測，成品中大黃素的含量為3. 17mg/片。
[0032] 實施例4 :黃萱益肝片抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1. 1實驗用細胞株 小鼠黑色素瘤細胞B16細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規培養。
[0033] I. 2實驗藥物 研究藥物：本發明黃萱益肝片：按實施例1方法製備。
[0034] 藥液儲液：稱取IOOmg黃萱益肝片，溶於5ml無水乙醇中，0. 2Mm濾器過濾， 50(^ldoff管分裝，-20°C存儲，同時0. 2Mm濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0035] 1. 3實驗試劑 DMEM ( GIBCO公司Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) Jrypsin (AMRESC0 公司）;EDTA (AMRESC0 公司）;Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經貿有限公 司）；MTT (Biosharp 批號：0793) :PBS (實驗室自配）； 1. 4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：SPECTRAMX 190);C02培養箱（FORMA型號：3111);超淨臺（蘇淨集團安泰公司製造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號：P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風乾燥箱（上海精密實驗設備公司型號：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心機(上海安亭科學儀 器廠型號：KA-1000) ;0.2Mm 濾器（MILLIP0RE 型號：SLGP033RB) ;lcm 培養皿（NEST 公司）、 96孔培養板（NEST公司）；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實驗方法 1)B16細胞用DMEM+10%FBS於37°C、5%C02進行常規培養（10cm培養皿)，當細胞生長 至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min後，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞後將其轉入離心管中， IOOOrpm離心5min，調整細胞懸液濃度3 X IO4個/ml。
[0037] 2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液18〇μ1，培養板放入細胞培養箱 中（37°C，5%C0 2)常規培養。
[0038] 3)根據細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入黃萱益肝片溶液，繼續培養24h。
[0039] 4) 24h 後加入 2〇μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即 0· 5%MTT)，繼續培養 4h。
[0040] 5) 4h後扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍幹，每孔如入20〇μ1二甲基亞碸，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時設置本底(不加細胞，只加培養液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質、培養液、MTT、二甲基亞碸)，每組設定6個復孔。
[0042] 7)結果以藥物對細胞的抑制率表示：細胞增值抑制率（%)=(對照孔OD值-給藥 孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重複3次。
[0043] 3.統計處理 採用Microsoft Excel 2007軟體中的相關分析和Student t檢驗，數據以mean土S. D .表不。
[0044] 4.實驗結果 MTT法實驗後統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對B16細胞增殖抑 制有差異（P〈〇. 05)，劑量在lOmg/ml時該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當劑量達到15-20mg/ ml時有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1黃萱益肝片對B16細胞增殖抑制影響研究（X土 SD)
【權利要求】
1. 一種黃萱益肝片的製備方法，由土大黃291g、萱草103g、千裡光92g、稱猴桃92g、紅 土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥製成，其特徵在 於，所述的製備方法由下列步驟組成：取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細粉，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 20-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥萃取時間130-170min，得超臨界萃取 物，備用；萃取後的野薔薇、騷羊古、南五味子殘渣與其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙 醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合併 萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓 回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，60%乙 醇制顆粒，乾燥，壓片，製成200片，每片重0. 5g。
2. 根據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述C02超臨界萃取中 夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述C02超臨界萃取中 萃取壓力為25MPa。
4. 根據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述C02超臨界萃取中 萃取溫度為60°C。
5. 根據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述C02超臨界萃取中 C02 流量 2ml/g 生藥? min。
6. 據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述C02超臨界萃取中萃 取時間為150min。
7. 根據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述微波萃取功率為 700W。
8. 根據權利要求1所述的黃萱益肝片的製備方法，其特徵在於，所述微波萃取每次萃 取時間為8分鐘。
9. 權利要求1所述的黃萱益肝片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中 的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104435569SQ201410638326
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】權棟棟, 王洪濤, 劉豔輝, 權威宇, 胡乃合 申請人:山東中大藥業有限公司