用於控制病原體的胺基酸序列的製作方法

2023-07-04 18:49:31 2

用於控制病原體的胺基酸序列的製作方法
【專利摘要】本發明涉及從羅非魚(O.niloticus)鰓的提取物分離和純化的抗微生物肽。這樣的肽可通過化學合成或通過在異源表達系統例如細菌和酵母中表達，通過常規分子生物學技術來產生。這些肽顯示抗多種生物體包括革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌和病毒的抗微生物活性。本發明還包括用於控制病原體的包含所述抗微生物肽的組合物。所述肽在疫苗製劑中用作分子佐劑的用途也是本發明的一部分。
【專利說明】用於控制病原體的胺基酸序列
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術學領域，具體地涉及抗微生物肽的獲得以及它們用於控制病原體的用途。當應用抗微生物肽時，它們有效地實現了由病原體引起的疾病的控制。此外，這些肽有助於增強由包含在疫苗中的各種抗原誘導的免疫應答。
現有技術
[0002]魚具有用作抗廣譜病原體的一線防禦的強大的先天免疫系統(Subramanian等人(2008)Fish and Shellfish Immunol.25:625 - 632)，和發育不良的適應性免疫系統(Magnadottir, (2010)Mar Biotechnol.12:361 - 379)。魚抵抗病原體的方式之一是通過分泌抗微生物肽(AMP)作為先天防禦機制。AMP在先天免疫系統中具有重大作用並且保護免受多種細菌、真菌、病毒和引起感染的其它病原體的侵害(Solomon，(2008)LancetNeurol.7:116 - 118)。一般地，AMP被分泌在唾液、粘液、循環系統和作為病原體的靶的其它區域中(Noga 等人(2010) Comp Biochem Physiol D:Genom Proteom.6:44-54)。
[0003]AMP基於它們的胺基酸組成和結構被分成5類。在這些分類中，包括陰離子肽，具有α-螺旋兩親結構的線性肽，富含特定胺基酸的陽離子肽，肽片段和具有形成分子內鍵的半胱；氛酸的月太(Brogden (2005) Nat Rev Microbiol.3:238 - 50; Boman (2000)Immunol Rev.173:5_16)。陰離子肽以毫摩爾濃度產生，需要鋅作為輔因子，並且顯示抗革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的抗微生物活性。具有兩親性α-螺旋結構的線性和陽離子肽具有少於40個胺基酸並且具有在中間部分具有鉸鏈區的三維結構。雖然其結構在溶液中是無序的，但當它們與膜接觸時，這些分子採取二級α-螺旋結構(Brogden(2005)Nat Rev Microbiol.3:238-50)。由富含特定胺基酸的線性陽離子肽組成的其它組不具有半胱氨酸殘基，從而這些肽在溶液中具有非常柔軟的結構(Brogden (2005)Nat Rev Microbiol.3:238 - 50)。第4組包括帶電荷的肽,其是來自更大的蛋白質的片段。這些肽具有抗微生物活性 和與其它組的肽相似的結構(Bellamy等人(1992) J ApplBacteriol.73:472-9;Zanetti 等人(1995)FEBS Lett.374:1-5)。第 5 組肽由約 380 個成員組成，所述成員包含形成分子內鍵的6個保守半胱氨酸殘基和β片結構(Brogden(2005)Nat Rev Microbiol.3:238-50)。該組包括防禦素和海帕西唳(Boman 等人(2000) ImmunolRev.173:5-16)。
[0004]雖然AMP通常通過結構特徵的差異來分類，但存在一些對於這些肽中的大部分肽是共同的特徵。例如，它們通常具有少於60個胺基酸，在生理條件下具有廣譜抗微生物活性，以及具有正電荷(Zasloff (2002)Nature415:389-395)。大多數兩親性AMP，基於其與病原體例如細菌和有包膜病毒的脂質細胞膜的相互作用，採取促成這些肽的作用機制的結構(Shai (2002)Biopolymers66:236-48; Jelinek 和 Kolusheva(2005) Curr.ProteinPept.Sc1.6:103-14)。該相互作用引起病原體脂質膜的快速去穩定/透化。幾個觀察表明除了孔形成的機制以外，AMP還可抑制細胞壁、核酸和蛋白質的合成，以及甚至抑制酶活性(Brogden 等人(2005)Nat.1mmunol.6:558-64; Campagna 等人(2007)Biochemistry46:1771-8)。
[0005]由於微生物發展抗抗生素抗性的能力以及由病原體引起的對於其還沒有適當治療的疾病的存在，需要尋找具有抗微生物活性的新型分子。
[0006]因此，要解決的重要問題是開發能夠高效地控制廣泛病原體並且對先天和適應性免疫、人和獸醫學包括水產業的極其重要的方面具有影響的新型抗微生物產品，特別是蛋白質和/或肽。
[0007]發明詳述
[0008]本發明通過提供用於控制和治療由病原體產生的感染，包括由細菌、病毒或真菌引起的感染的新型替代物解決了上述問題。在本發明中，首次報導了 SEQ ID N0.1、2和3的抗微生物肽。本發明的目的還有在它們的胺基酸序列中包含SEQ ID N0.1、2或3的胺基酸序列或與SEQID N0.1、2或3的肽具有至少80%的同一性的胺基酸序列的胺基酸序列。
[0009]從羅非魚(Oreochromis niloticus (尼羅羅非魚))觸蛋白質提取物分離了 3種肽，並且對所述肽進行了測序，所述肽稱為Oreochromicin 1、Oreochromicin II和Oreochromicin III。這些肽未曾在文獻中報導過，在本發明中表示為SEQ ID N0.1、2和3。這些肽具有抗革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、病毒和真菌的抗微生物作用。本發明的肽可通過從其天然來源分離來獲得。此外，所述肽可通過化學合成或通過重組脫氧核糖核酸(DNA)技術來獲得。
[0010]在本發明的一個實施方案中，抗微生物肽通過在細菌、酵母或高等生物的細胞中重組表達來獲得。可將這些抗微生物肽在不同的宿主系統中表達，隨後從它們分離而來。在具體的實施方案中，抗微生物肽可在酵母中表達。在優選實施方案中，在畢赤酵母(Pichiapastoris),優選在培養上清液中進行通過重組DNA技術的表達。還可在細菌中表達本發明的抗微生物肽。在另一個優選實施方案中，在大腸桿菌(Escherichia coli)中進行通過重組DNA技術的表達。可通過蛋白質分離技術從宿主獲得本發明的肽，所述技術為本【技術領域】內技術人員所公知，例如層析技術、洗滌沉澱等。
[0011]抗微生物肽的使用相較於其它抗微生物劑提供了有利方面，因為它們具有小尺寸(~5kDa)，這樣當通過浸潰施用時可通過水生生物的皮膚和黏膜被更好地吸收，所述浸潰對於水產業來說是具有有利成本和具有低汙染水平的施用途徑。另一個有利方面是抗微生物肽刺激先天和適應性免疫活性,並且增強對致病體感染的抗性。
[0012]通過考慮每一種肽的胺基酸序列，簡併寡核苷酸被設計來通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增編碼每一種成熟肽的核苷酸序列。因此，本發明的另一個目的是包含選自SEQ IDN0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6的核酸序列的核酸。
[0013]本發明的另一個目的是編碼包含SEQ ID N0.1、2或3的胺基酸序列或與SEQ IDN0.1、2或3的肽具有至少80%的同一性的胺基酸序列的肽的核酸。 [0014]本發明還提供了用於控制病原體的組合物，其包含SEQ ID N0.1、2或3的肽或與SEQ ID N0.1、2或3的肽具有至少80%的同一性的肽。
[0015]在本發明的一個實施方案中，其序列被要求保護的抗微生物肽(和包含其的組合物)可用於控制多種病原體例如細菌病原體(氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、棒狀菌(Corynebacteria)、腸桿菌(Enterobacteria)、嗜血菌屬(Haemophilus)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、諾卡爾菌屬(Nocardia)、粘細菌(Myxobacteria)、鏈黴菌屬(Streptomyces)和弧菌屬(Vibrio)等等)；病毒病原體(感染性造血組織壞死病毒、感染性胰腺壞死病毒、出血性敗血症病毒、虹彩病毒、鯉魚出血病毒、鯉春病毒、比目魚彈狀病毒或黑魚彈狀病毒、淋巴囊炎病毒、感染性鮭魚貧血等)、真菌和卵菌綱(水黴屬、綿黴屬、Ychthyosporidium hoferi等)。
[0016]在本發明的一個實施方案中，將妝Oreochromicin 1、Oreochromicin II和Oreochromicin III以及與它們具有至少80%的序列同一'丨生的肽配製成用於控制不同生物包括哺乳動物和水生生物中的病原體的組合物。在病原體的控制中預防性和治療性施用這樣的組合物。施用途徑包括用於向人施用的藥物和用於在動物的情況下施用藥劑或添加劑的所有施用途徑，所述施用途徑對於本【技術領域】內的技術人員來說是公知的。在一個實施方案中，口服、胃腸外或通過浸浴施用本發明的用於控制病原體的組合物。
[0017]也是本發明的一個方面的是包含選自SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3的胺基酸序列或與SEQ ID N0.1, SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列的肽用於製造用於控制病原體的組合物的用途。
[0018]其另一個方面是提供用於控制攻擊幾種生物體的病原體的方法，其特徵在於給所述生物施用有效量的包含選自SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2和SEQ ID N0.3的胺基酸序列或與SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列的肽。
[0019]在具體的實施方案中，通過以0.1至10 μ g/魚的濃度定期注射，通過1-15天的間隔(連日或隔日)於淡水或海水中以0.01至0.lmg/L水的肽濃度浸浴來施用本發明的肽。還可將肽用作魚的飼料添加劑，以約50-750 μ g的肽/kg飼料的濃度施用。在所有情況下，獲得了對由病原體例如病毒、細菌或真菌等引起的疾病的抗性的顯著增強。
[0020]此外，本發明提供了用作疫苗的分子佐劑的肽。在本發明的說明書中，術語"分子佐劑"是指能夠調節針對疫苗抗原的免疫應答、從而產生免疫應答的增強的蛋白質性質的分子。·
[0021]因此，本發明還提供了疫苗組合物，所述組合物包含含有選自SEQ ID N0.USEQ IDN0.2 和 SEQ ID N0.3 的胺基酸序列或與 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.3 具有至少80%的同一性的胺基酸序列的肽(作為分子佐劑)和疫苗抗原。
[0022]本發明的另一個方面提供了用於增強對疫苗抗原的免疫應答的方法，所述方法使用疫苗中的肽，所述肽包含選自SEQ ID N0.USEQ IDN0.2和SEQ ID N0.3的胺基酸序列或與SEQ ID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列作為分子佐劑。
[0023]附圖概述
[0024]圖1.將抗微生物肽克隆進入用於大腸桿菌(圖1A)和用於畢赤酵母(圖1B)的表達載體的克隆策略。
[0025]圖2.從畢赤酵母培養上清液(圖2A)和從大腸桿菌破裂上清液(圖2B)純化抗微生物妝° 泳道 I:Oreochromicin I ;泳道 2:Oreochromicin II,泳道 3:Oreochromicin
III。
[0026]圖 3.抗微生物妝 Oreochromicin 1、Oreochromicin II 和 Oreochromicin III的抗病毒活性。用 I U g 的 pTargeT-Oreochromicin 1、pTargeT-Oreochromicin I1、pTargeT-Oreochromicin III或pTargeT(作為對照)轉染接種在24孔板中的EPC(鯉魚上皮瘤細胞)細胞，進行24小時。在轉染後24小時，添加不同濃度的蛙虹彩病毒(RGV)(10550% 的病毒的感染劑量(TCID50)/ml, 104TCID50/ml, 103TCID50/ml 和 102TCID50/ml)，48小時後，收集培養上清液，測定病毒滴度。
[0027]圖4.結合脂多糖(LPS)的抗微生物妝 Oreochromicin 1、Oreochromicin I1、Oreochromicin III 的飽和曲線。產生 50% 的妝(Oreochromicina I, Oreochromicina II和 Oreochromicina III)結合的濃度(EC50)分別為 L 23 μ M、1.41 μ M 和 2.99 μ M。
[0028]圖5.羅非魚中的抗嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的抗體滴度(n=12)。值代表平均值土標準誤差(SE)。
[0029]圖 6.通過利用與妝 Oreochromicin 1、Oreochromicin II 和 Oreochromicin III共施用的OVA的免疫而在小鼠中誘導的總免疫球蛋白G(IgG)的滴度。建立4個實驗組，每組6隻動物。在第O和7天利用6 μ g的劑量的OVA(於0.2mL PBS中)腹膜內接種陰性對照組(磷酸緩衝鹽溶液(PBS) /OVA)。在第O和7天，利用6 μ g的0VA+0.5 μ g的每一種肽的劑量(於0.2mL PBS中)腹膜內接種也接受肽的組(PBS/0VA+肽)。不同字母表示統計上顯著的差異。值代表平均值土SE(n=6)。
[0030]圖 7.利用與妝 Oreochromicin 1、Oreochromicin II 和 Oreochromicin III 共施用的OVA免疫在小鼠中誘導的總免疫球蛋白G(IgG) (A)、IgGl和IgG2a(B)的滴度。在第O和14天利用單獨的OVA (5 μ g/動物)或與劑量為0.238xl020個分子/動物(分別相當於 0.1,0.12 和 0.14 μ g/ 動物的 Oreochromicina 1、II 和 III)和 2.38xl020 個分子 / 動物(分別相當於1、1.2和1.4 μ g/動物的Oreochromicina 1、II和III)的肽組合的OVA通過腹膜內注射來免疫雄性Balb/c小鼠(8隻/組)。陰性對照組利用0.1mL的PBS進行注射。在第一次免 疫後第14天和21天測試OVA-特異性體液免疫應答(總IgG)。在第一次免疫後第21天分析IgGl和IgG2a的抗體滴度。通過ELISA測定OVA-特異性抗體滴度。(A)總的IgG滴度。條柱代表1gG滴度土標準誤差(n=8)。使用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn多重比較檢驗進行統計分析。星號代表與PBS組的顯著差異(*表示p〈0.05，***表示ρ〈0.001)。(B) IgGl和IgG2a的滴度。條柱代表抗體滴度±標準誤差(n=8)。使用MannWhitney檢驗進行統計分析O表示p〈0.05)。
[0031]圖8.從免疫的動物分離的脾細胞的IFN- Y分泌。Y軸顯示利用0VA(10 μ g/ml)刺激的脾細胞的培養上清液中的IFN-Y濃度。條柱代表1FN-Y的濃度土標準偏差(n=5)。通過ANOVA檢驗和Bonferroni』 s多重比較檢驗進行數據的統計分析O:p〈0.05, ***:ρ〈0.001)。
[0032]圖9.通過用與抗微生物肽Oreochromicin I共施用的ΜΥ32蛋白免疫羅非魚(0.niloticus)而誘導的IgM滴度。在第O和14天通過腹膜內注射免疫魚(10條魚/組)。利用0.3mL的PBS注射陰性對照組。在第1次免疫後第14、21和28天分析特異於MY32的體液免疫應答。通過ELISA測定特異於MY32的IgM抗體滴度。條柱代表1gM滴度土標準差(n=10)。通過ANOVA和Newman-Keuls多重比較檢驗進行數據的統計分析O表示p〈0.05)。
實施例
[0033]實施例1.從羅非魚鰓提取物分離和純化抗微生物肽
[0034]將羅非魚(Oreochromis niloticus)鰓絲浸潰在液氮中，將所得的粉末在100°C加熱lOmin，然後讓其冷卻。通過添加150mL的2M HCl、10%(v/v)甲酸、2%(w/v)NaCl和1%(v/v)三氯乙酸的溶液，隨後勻漿l_2min來進行蛋白質的提取。將勻漿物以20000x g離心30min，將上清液調整至pH4.0並過濾。將所得濾液用作酸提取物，並應用於S印-PakC18柱(Waters, Milford, MA, USA) ?在用0.l%(v/v)三氯乙酸洗滌後，以80%乙腈/0.1%三氟乙酸洗脫對應於肽的級分。將洗脫物乾燥，隨後溶解於IM醋酸中，將其吸附至SP-SephadexC-25的基質。利用IM醋酸、2M吡啶和2M吡啶/醋酸(pH5.0)的洗脫的連續步驟產生5個級分。對於每一級分，顯示有抗微生物活性，選擇級分2來進行隨後的純化步驟。
[0035]將選擇的級分冷凍乾燥，溶解在含有0.1%三氯乙酸的40%乙腈中。將溶液的等份應用於TSKgel G2000SW柱(凝膠過濾，高效液相色譜(HPLC))，利用含有0.1%三氯乙酸的40%的乙腈進行洗脫。將相同級分重複注射入柱子，將具有低於5kDa的分子量並顯示抗微生物活性的所得級分冷凍乾燥，隨後經歷反相色譜(RP-HPLC)和質譜(ES1-MS)。該級分的分子量通過在Tricine-十二烷基硫酸鈉(16.5%T/3%C)(縮寫為Tricine-SDS-PAGE)上進行凝膠電泳來測定。
[0036]在Hewlett-Packard HP1100系統上通過HPLC分離蛋白質。溶劑A為含有0.1%三氯乙酸的5%乙腈，溶劑B為含有0.085%三氯乙酸的80%乙腈。利用溶劑A重建級分A，將其在 C8-3 柱(4.6x150mm)上經歷 RP-HPLC。梯度為 0_2min0% 溶劑 B、2-5min0_20% 溶劑B、5-55min20-47%溶劑B和55-80min47_100%溶劑B。冷凍乾燥顯示抗微生物活性的所得級分，於含有25%乙腈的KH2P04/H3P045mM(pH3.0)中進行重建，將其加載至PolySulfoethylAspartamide柱(4.6x200mm)上。利用線性梯度的KCl洗脫級分。顯示最大抗微生物活性的級分的分子量為2527.3,2981.9和3654.6Da。這些肽分別稱為Oreochromicin 1、11和III。測定每一個具有抗微生物活性的肽的胺基酸序列，在下文中分別稱為SEQ ID N0.1,2和3。此外，使用BlastX程序進行序列分析，發現這些肽先前未被報導過。
[0037]實施例2.用於在大腸·桿菌細胞內表達抗微生物肽和在畢赤酵母中細胞外表達抗微生物肽的載體的構建
[0038]通過反轉錄反應從羅非魚(0.niloticus)的觸分離的核糖核酸(RNA)獲得互補DNA(CDNA)0按照試劑盒〃反轉錄系統〃 (Promega，USA)中描述的說明書進行反應。簡而言之，將4μ g總RNA置於不含核酸酶的微量離心管中，在70°C溫育10分鐘。隨後，向其中添加其餘反應組分(4μ L的25mM MgCl2、2y L的IOmM三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的混合物、2 μ L的反轉錄IOX緩衝液、0.5 μ L核糖核酸酶抑制劑、I μ L的oligo (dT) 500 μ g/mL、20個單位的逆轉錄酶和先前利用焦碳酸二乙酯處理的水至20 μ L的終體積)。將反應物在42°C溫育15分鐘，在95 °C終止反應，進行5分鐘。
[0039]使用從每一個肽的胺基酸序列設計的簡併合成寡核苷酸，通過PCR從獲得的cDNA擴增編碼抗微生物肽的成熟區域的核苷酸序列。在所有情況下，我們獲得具有預期大小的DNA條帶。從瓊脂糖凝膠純化條帶,將其插入商業載體pGEM-TEasy (Promega)以進行測序。編碼肽的DNA序列為SEQ ID N0.4、5和6。
[0040]使用限制位點Ndel/BamHI將編碼抗微生物肽的DNA序列插入大腸桿菌表達載體pAR3040(圖1A)。為了擴增對應於每一個肽的條帶，使用識別每一個肽的5』和3』末端的特異性序列並且具有幫助克隆進入表達載體的限制性內切酶的識別位點的寡核苷酸。對於每一個肽，選擇重組克隆之一來轉化大腸桿菌BL21DE3菌株並且使用ImM異丙基-β -D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)作為誘導劑來誘導在T7啟動子調控之下的基因表達。在37°C進行基因表達6小時。通過Tricine-SDS-PAGE和ES1-MS檢查重組肽的表達。
[0041]將PPS9和pPSlO載體以及識別每一個肽的5』和3』序列並且具有限制性內切酶的識別位點的特異性寡核苷酸用於構建畢赤酵母的抗微生物肽表達載體。為了在PPS9載體中進行克隆，使用NcoI和SpeI位點，為了克隆進入pPSlO載體，使用NaeI和SpeI位點。這些克隆策略不將胺基酸添加至目標蛋白質(圖1B)。
[0042]將質粒線性化，隨後轉化畢赤酵母MP36株。通過電穿孔進行轉化。MP36株是營養缺陷型突變體his3，其在轉化後獲得His+表型。
[0043]通過斑點印跡鑑定轉化體克隆。通過使用Southern印跡技術測定了在這些克隆中通過用重組質粒的表達盒替代畢赤酵母基因AOXl發生的整合，其對應於Muts表型(低甲醇使用)和His+。畢赤酵母分泌低水平的自身蛋白質並且其培養基不需要蛋白質補充，這樣你可預期分泌至細胞外培養基的異源蛋白質，構成了培養基中的總蛋白質的大部分(超過 80%) (Tschopp 等人(1987) Bio/Technology5:1305-1308)。
[0044]通過向培養基中添加甲醇在5升中進行畢赤酵母的肽表達。重組肽的表達及其完整性通過Tricine-SDS-PAGE和ES1-MS來進行檢查。
[0045]實施例3.抗微生物肽的純化和生物活性測定
[0046]從大腸桿菌破裂上清液或從畢赤酵母培養上清液純化重組地獲得的抗微生物肽。首先，使用具有IkDa的孔徑的膜在25mM醋酸鈉(pH4.5)中進行透析。將透析的產物應用於利用25mM醋酸鈉(pH4.5)平衡的陽離交換CM-Sepharose Fast Flow樹脂,利用IM氯化鈉，Tris50mM(pH7.6)洗脫蛋白質。收集包含肽的級分，使用具有IkDa的孔徑的膜，利用超濾系統進行濃縮。為了進行檢測，我們使用254nm的波長。通過Tricine-SDS-PAGE檢查純度，通過考馬斯藍染色顯現蛋白質(圖2)。
[0047]還可使用本【技術領域】的技術人員已知的方法，通過化學合成獲得本發明的肽。肽的抗微生物活性通過微量稀釋法來測定。為了測定最小抑制濃度(MIC)，將每一種肽以1:2進行系列稀釋。用90μ L的MuellerHinton肉湯(細菌)或Sabouraund肉湯(真菌)中的細菌或酵母懸浮液(5xlOsCFU(菌落形成單位)/mL)溫育10微升的每一種稀釋的肽，在280C (對於魚病原體和真菌)或37°C (對於哺乳動物病原體)溫育18小時。MIC被定義為發生細胞生長的抑制時的最低肽濃度。以一式三份進行所有測定，將培養基(無微生物)和未對其添加肽的微生物用作對照。結果示於表1中。
[0048]表1.妝 Oreochromicin 1、0reochromicin II 和 Oreochromicin III 的抗微生物
活性
[0049]
【權利要求】
1.胺基酸序列，其特徵在於包含選自SEQID N0.USEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3的胺基酸序列或與SEQ ID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列。
2.權利要求1的胺基酸序列，其通過從其天然來源分離，通過化學合成或通過重組DNA技術獲得。
3.權利要求2的胺基酸序列，其通過在細菌、酵母或高等生物的細胞中表達獲得。
4.核酸，其特徵在於包含選自SEQID N0.4,SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6的核酸序列。
5.核酸，其編碼包含SEQID N0.K SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3的序列或與SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列的胺基酸序列。
6.用於控制病原體的組合物，其特徵在於包含具有SEQID N0.K SEQ ID N0.2或SEQID N0.3的序列或與SEQ ID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列的肽。
7.權利要求6的組合物，其中所述肽通過從其天然來源分離，通過化學合成或通過重組DNA技術獲得。
8.權利要求6的組合物，其用於控制影響哺乳動物和水生生物的細菌、病毒和真菌病原體，並且被預防性或治療性地施用。
9.權利要求6的組合物，其通過口服途徑、胃腸外途徑或通過浸浴來進行施用。
10.肽用於製造用於控制病原體的組合物的用途，所述肽包含選自SEQID N0.1、SEQID N0.2 和 SEQ ID N0.3 的胺基酸序列或與 SEQID N0.1、SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.3 具有至少80%的同一性的胺基酸序列。
11.用於控制活生物體中的病`原體的方法，其特徵在於給所述生物體施用有效量的肽，所述肽包含選自SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3的胺基酸序列或與SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列。
12.權利要求11的方法，其中所述肽被預防性或治療性地施用。
13.權利要求11的方法，其中給哺乳動物和水生生物施用所述肽。
14.權利要求13的方法，其中給魚施用所述肽，優選通過以0.1至10 μ g的肽/魚的濃度定期注射，通過以0.01至0.1mg的肽/升水的濃度浸浴,或以約50-750 μ g的肽/kg飼料的濃度作為飼料添加劑來施用。
15.包含作為分子佐劑的肽和疫苗抗原的疫苗組合物，所述肽包含選自SEQID N0.1、SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.3 的胺基酸序列或與 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2 或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列。
16.權利要求15的疫苗組合物，其中在相同的免疫方案過程中同時、分開地或相繼地施用用作疫苗佐劑的肽和抗原。
17.用於增強抗疫苗抗原的免疫應答的方法，其持徵在於使用肽作為疫苗的分子佐劑，所述肽包含選自SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3的胺基酸序列或與SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%的同一性的胺基酸序列。
【文檔編號】A61K38/17GK103874502SQ201280050943
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年10月1日 優先權日:2011年9月30日
【發明者】J·阿科斯塔阿爾巴, M·P·埃斯特拉達加西亞 申請人:遺傳工程與生物技術中心