稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼蛋白與應用的製作方法

2023-07-09 11:36:21 1

專利名稱：稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因及其編碼蛋白與應用，特別是涉及一個磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼蛋白與其在提高植物光合作用效率中的應用。
背景技術：
植物界光合碳同化方式上有C3途徑和C4途徑的區分。由於光呼吸的存在，C3途徑所固定的碳相當一部分被光呼吸消耗掉，生物量的形成減少50％以上。C4光合途徑中固定CO2的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)對CO2的親和力遠遠超過C3光合途徑中的核酮糖二磷酸羧化酶(RuBPase)，而且磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有濃縮CO2的機制，CO2濃度的升高有利於雙功能酶RuBPase的羧化活性，抑制其加氧活性，從而有效降低了植物的光呼吸。因此，C4植物具有光合速率高，CO2補償點低，幾乎沒有光呼吸等優點，特別是在強光、高溫、乾旱等條件下，C4植物具有明顯的生長、水分及營養利用率高的優勢，光合效率比C3植物高出二倍，生物產量也較高。但地球上95％以上的植物，包括許多重要的糧食作物和經濟作物如水稻、小麥、菠菜、菸草等都是C3植物，在常規的大氣環境下(21％的O2，0.035％的CO2)，其光合效率比C4植物低40％，而在高溫、乾旱使氣孔關閉，CO2濃度降低的情況下，光合效率則更低。只有少數熱帶和亞熱帶禾本科植物如玉米、甘蔗、高粱和稗草等是C4植物，具有對付光呼吸的策略。
許多C3植物中C3光合途徑和C4光合途徑並存，在不同環境條件下或人工誘導下，其C4光合酶活性會大大提高，表明C4光合途徑的關鍵不在於細胞區域化結構，而在於C4光合關鍵酶，如PEPC，PPDK，NADP-Me等。因此，將C4光合途徑關鍵酶基因導入C3植物中，有可能提高C3植物的光合效率。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)存在於所有能進行光合作用的有機體中，許多高等植物如玉米(Z.mays)、高粱(S.vulgare)、水稻、黃花菊屬(Flaveria)等植物的PEPC基因相繼克隆成功，並且對其序列特徵及結構進行了詳盡的解析。
研究證明，高等植物的PEPC是由一小段多基因家族編碼的。這一家族中的多個成員已在不同植物如玉米，高粱，冰葉日中花以及Flaveria trinervia等中被確認。ppc基因存在多種同工酶形式C4光合型、C3光合型、CAM型及非綠色型等，甚至在每種植物中的ppc基因至少存在有1-3個類型，在玉米中已發現有5個類型，分別存在於葉和根組織中。C4光合型PEPC基因在玉米和高粱中以單拷貝形式存在，而在Flaceria屬植物中則以多拷貝形式存在，其表達主要在葉肉細胞中進行，並且受光調控，具有組織特異性。
C4植物的PEPC多基因家族成員的一級結構基本相似。由於C4形式的PEPC在C4光合作用中起到的重要作用，目前大量的研究主要集中在C4形式的PEPC上。對ppc基因研究較多的是玉米、高粱和Flaveria屬等植物，通過序列比對同樣發現，存在於不同植物的同一類型的ppc基因具有較高的同源性，2個玉米及1個高粱的C4型ppc基因全序列的同源性為57.9％，轉錄區同源性為80.3％。表明不同物種間同一類型ppc基因的同源性較高。
第一個嘗試轉C4ppc基因使用的嵌合基因是將玉米的C4特異的PEPC的cDNA(ppccDNA)融合到Nicotiana phimbaginifolia的葉綠素a/b結合蛋白基因(Cab)的5『和3』的旁側序列上構成的，這種嵌合基因導入菸草後，葉中PEPC的活性比非轉基因植物提高了2.2倍。同樣，在諸如Cab，rbcS啟動子和花椰菜花葉病毒35S啟動子等強啟動子控制下的C4酶的cDNA的表達，也獲得使PEPC、PPDK和NADP-MDH的活性提高了2-5倍的結果。為提高C4酶的表達水平，可以在引入的基因中包括具有增強子作用的序列，通過檢測歐芹的查爾酮合成酶基因的5『端非編碼區(UTR)後發現，它的存在可以使C.glutamicum的Ppc基因在35S啟動子下的表達水平提高。PEPC活性的最高水平達到非轉基因植株的5倍。玉米C4特異基因的啟動子，如Ppc，Pdk可以大大提高報告基因在水稻中的表達水平，而且可以像在玉米中那樣進行微管特異、葉肉細胞特異和依賴光的方式進行表達。此研究結果表明水稻具有高水平表達C4特異基因所許的調控因子，而且暗示完整玉米基因的導入可以導致水稻葉中C4酶的高表達。1999年，Ku等(Ku MSB，Agarie S，Nomura M，Fukayama H，Tsuchida H，Ono K，Hirose S，Toki S，MiyaoM，Matsuoka M.High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylasein transgenic rice plants. Nature Biotech.，1999，17，76-80.)首先將C4植物玉米的C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(包括啟動子和終止子序列)通過農桿菌介導導入了C3植物水稻，並實現了有效表達，使水稻葉片中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性穩定提高，85％的轉基因植株的PEPC活性比對照高2-30倍，15％比對照高30-110倍，甚至高於玉米2-3倍甚至比玉米高2-3倍，達到葉片可溶蛋白的12％。Ku等(Ku MSB，Agarie S，Nomura M，Fukayama H，Tsuchida H，Ono K，Hirose S，Toki S，Miyao M，Matsuoka M.High-level expression of maizephosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Nature Biotech.，1999，17，76-80)獲得的超表達玉米PEPC的轉基因水稻植株能顯著減弱氧氣對光合的抑制作用，在同樣的大氣條件下，光合速率比對照提高了2倍。據報導這種轉基因水稻能增產35％。焦德茂等人(焦德茂，匡廷雲，李霞等.2003.轉PEPC基因水稻具有初級CO2濃縮機制的生理特點.中國科學(C輯)，33，33-39；遲偉，焦德茂，黃雪清等.2001.轉PEPC基因水稻的光合生理特性.植物學報，43，657-660.)檢測了轉Ppc基因水稻植株的生理指標，結果表明，與對照植株相比，光飽和速率提高55％，CO2補償點下降27％。在南京自然條件下比較，轉PEPC基因水稻的光合能力顯著增強，單株產量增加了14％-22％，表明通過基因工程的方法提高作物的光合生產力具有廣闊前景。
稻田中的優勢雜草稗草(Echinochloa crusgalli)為典型的C4光合類型植物，它的地上、地下部分生長優勢遠超於水稻，研究結果表明，稗草類植物既能很好地適應水中環境，又能適應極度乾旱、高溫條件。與其它旱作的C4作物玉米、高粱和穀子相比，具有光合速率高、PEPCase含量高等特點。因此它是一種開展轉PEPCase基因以改造C3作物光合效率的最優秀的野生資源供體。到目前為止，報導較多的是將玉米、高粱等C4農作物的ppc、pdk等基因轉入如菸草、水稻和小麥等C3植物，但對野生植物資源的光合基因獲得成功利用的少見報導。有關對稗草資源的開發利用及光合功能基因的克隆研究在國際上仍屬空白。
水稻在其進化過程中保留了適於在水田中生長並且同時需要相對較高的溫度和充足的陽光照射。而高溫和高光強的生長環境正是C4植物生長所必須。因此水稻的生長很容易受到水田C4雜草的影響，稗草正是在此條件下與水稻形成了強烈的抗衡，因此提高水稻等農作物的光合作用效率具有重要的實際意義。

發明內容
本發明的目的是提供一個來源於稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼蛋白。
本發明所提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，名稱為Eppc，來源於稗屬稗草(Echinochloa crusgalli)，它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交並洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由2886個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1-2886位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質。
本發明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因所編碼的蛋白(PEPC)，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物光合作用效率的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №2由961個胺基酸殘基組成。
含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
本發明的另一個目的是提供一種提高植物光合作用效率的方法。
本發明所提供的提高植物光合作用效率的方法，是將所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因導入外植體，得到光合作用效率提高的植物。
所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因可通過含有所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體導入外植體；用於構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種雙元農桿菌載體或可用於植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1300等，其中，pCAMBIA1301為優選的出發載體。
使用Eppc構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如泛生素基因Ubiquitn啟動子(pUbi)、在葉組織特異性表達的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因啟動子rbcS、玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異啟動子、花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
以pCAMBIA1301為出發載體，構建的含有泛生素基因Ubiquitin1啟動子(pUb1)、和稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表達載體為pUbi-Eppc。
以pCAMBIA1301為出發載體，構建的含有在葉組織特異性表達的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因rbcS啟動子和稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體為pRbcS-Eppc。
以pCAMBIA1301為出發載體，構建的含有玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異啟動子和稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體為pZMp-Eppc。
攜帶有本發明Eppe的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物細胞或組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、小麥、菸草、大豆、擬南芥等C3植物。
將本發明稗草的Eppc對水稻進行轉化以首先提高其光合速率，進而使其更好的適應高溫和高光強的生活環境。在C4植物群體中，從起源和進化的角度看，稗草與其它C4型作物(玉米、高粱、穀子等)相比，屬於與水稻親緣關係較近的同一族植物，有可能其有關光合酶基因的調控機制與水稻有關光合酶基因的調控機制相接近，有利於基因轉移後在水稻中的高活性表達。本發明的來源於稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc可顯著提高植物的光合作用效率，將在提高農作物，特別是C3農作物(如水稻)的產量中發揮重要的作用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。


圖1為Eppc的植物表達載體pUbi-Eppc的構建流程1a為質粒載體pUC-Pubi的物理圖譜圖1b為載體pCAMBIA1301的物理圖譜圖2為Eppc的植物表達載體pUbi-Eppc的酶切鑑定結果圖3為Eppc的植物表達載體pRbcS-Eppc的構建流程3a為載體pRGN的物理圖譜圖4為Eppc的植物表達載體pRbcS-Eppc的酶切鑑定結果圖5為Eppc的植物表達載體pZMp-Eppc的構建流程5a為載體PUCm-T-ZMp的物理圖譜圖6為Eppc的植物表達載體pZMp-Eppc的酶切鑑定結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物均由上海生工合成。
實施例1、稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc的克隆1、稗草總RNA的提取及eDNA的合成取光照4h後的稗草植株的綠葉，使用Trizol試劑盒(Gibeco公司)並參照試劑盒說明書提取總RNA，具體方法為剪取1g新鮮的稗草葉片，置液氮中迅速研磨成凍乾粉，收入1.5mL離心管中並加入1mL Trizol試劑，充分混勻，室溫放置5min後4℃、12000g離心10min，將上清轉至另一離心管中，室溫放置5min，再加入0.2mL氯仿，搖震15sec，室溫放置5min，4℃、12000g離心15min，將上清轉入另一離心管中，加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃、12000g離心10min，棄上清，加入75％乙醇1mL，洗滌沉澱，4℃、7500g離心5min，最後將沉澱乾燥後，溶解於經DEPC處理的滅菌水中，得到稗草葉片的總RNA。以此稗草葉片的總RNA為模板，用ImProm-IITMReverseTranscriptase試劑盒(promega公司)反轉錄合成cDNA，反應體系為RNA 1μg，oligo(dT)150.5μg，用經DEPC處理的滅菌水補足至5μL。70℃，5min，再4℃，5min後迅速冰浴。然後分別加入ImProm-IITM5×Reaction Buffer 4μL，MgCl2(25mM)2.4μL，dNTP mix(10mM)1μL，rRNasin Ribonuclease Inhibitor 20u，ImProm-IITMReverse Transcriptase 1μL，用經DEPC處理的滅菌水補足反應體系至20μL，充分混勻。反應條件為25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 15min，4℃保存，得到稗草的cDNA。
2、稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc的克隆對甘蔗、玉米、小麥、水稻等數種C3和C4禾本科植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA序列進行同源性比對，比對結果表明ppc的5』端和3』端序列均比較保守。因此，根據已報導的甘蔗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的cDNA全長序列，設計一對引物，引物序列為P15』-ACTTCTAGAATGGCGTCCGAGCGGCACC-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Xba I識別位點)P25』-GTAGGTACCCTAGCCGGTGTTCTGCA-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Kpn I識別位點)以步驟1得到的稗草cDNA為模板，在引物P1和引物P2的引導下，進行PCR擴增。50μL PCR反應體系為2×GC緩衝液(TaKaRa公司)25μL，dNTPmix 16μL，P1 1μL(5μM)，P2 1μL(5μM)，LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)2.5U，模板DNA約1μg，用經DEPC處理的滅菌水補足至50μL。PCR反應條件為先94℃ 5min；然後94℃ 30s，70℃ 30s，70℃ 3min，共30個循環，最後70℃ 10min。反應結束後，將PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下約3000bp的目的條帶，用PCR產物純化試劑盒(北京博大泰克公司)回收DNA。將回收的DNA用T4DNA連接酶(Promega公司)與載體pUCm-T(上海生工)連接，將連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，取200μL菌液與4μL IPTG及40μL X-gal(20mg/mL)在LB平板進行藍白斑篩選，長出單菌落後，挑取若干白斑菌落提質粒，對所提的質粒DNA用限制性內切酶Xba I和Kpn I進行酶切鑑定，可產生約2900bp和2700bp條帶的為陽性克隆，將陽性克隆送至上海生物工程公司進行序列測定，測序結果表明PCR擴增產物長度為2906bp，其開放閱讀框(ORF)為自5』端第1-2886位鹼基，具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，編碼具有序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質，將該序列命名為Eppc，將含有Eppc的重組質粒載體命名為PUCm-Eppc。在NCBI網站上用BLAST搜索軟體對該基因的核苷酸序列進行同源性檢索，結果在GenBank、EMBL、DDBJ和PDB資料庫中均顯示該序列為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因序列，用Clustal W軟體對篩選出的部分C3、C4植物進行核苷酸序列的多重比對分析，其中同源率較高的植物依次是穀子(Setariaitalica)、高粱(Sorgham bicolor)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza stativa)，相應同源區段的同源率分別為94.8％、93.2％、93.0％和89.7％。證明所克隆的DNA片段為稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化基因的全長cDNA。再篩選幾種典型的C3、C4植物的不同形式的PEPCase蛋白序列運用ClustalW軟體進行胺基酸序列的多重比對分析，結果與玉米、高粱的根型，穀子和水稻的C3型PEPCase同源性極高，可分別達到96.5％、96.4％、96.4％和94.3％，與穀子、玉米、甘蔗和高粱的C4型PEPCase的同源性分別為82.2％、79.1％、77.1％、76.6％。
實施例2、稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc的功能驗證一、含有Eppc的植物表達載體的構建1、植物表達載體pUbi-Eppc的構建含有Eppc的植物表達載體pUbi-Eppc的構建流程如圖1所示，具體方法如下先用限制性內切酶Hind III和EcoR I雙酶切含Ubiquitin1啟動子和NOS終止子的質粒載體pUC-Pubi(其物理圖譜如圖1a所示)，對酶切產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大小約為2.0kb的目的條帶，將回收片段與經相同酶雙酶切載體pCAMBIA1301(其物理圖譜如圖1b所示，購自澳大利亞CAMBIA公司)連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經藍白斑篩選後獲得中間載體，命名為pCAMBIA1301-pUbiFPF1；再用限制性內切酶Xba I和Kpn I對載體pCAMBIA1301-pUbiFPF1進行雙酶切，對酶切產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大小約為12，000kb的含NOS終止子的大片段，將該片段命名為pCAMBIA1301-NOS-Ter，用相同酶對實施例1構建的載體PUCm-Eppc進行雙酶切，對酶切產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大小約為2.9kb的目的基因Eppc片段，然後將2.9Kb的Eppc片段與pCAMBIA1301-NOS-Ter連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經篩選後獲得中間載體，命名為pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter，最後用限制性內切酶Xba I單酶切pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter和pUC-Pubi，去磷酸化後進行連接，將Ubiquitin1啟動子連入pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter中的Eppc前端，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，對其進行藍白篩選，挑選陽性單克隆提質粒並進行酶切鑑定，酶切鑑定結果如圖2所示(泳道1為1kb DNA Ladder，泳道2為所提質粒，泳道3為經Sal I和Kpn I雙酶切的質粒，泳道4為經Xba I和Kpn I雙酶切的質粒，泳道5為經Hind III和Kpn I雙酶切的質粒)，經Hind III和SalI雙酶切可得到大小約16，000kb條帶的為正向連接的陽性克隆，將該陽性克隆質粒命名為pUbi-Eppc。
2、植物表達載體pRbcS-Eppc的構建含有Eppc的植物表達載體pRbcS-Eppc的構建流程如圖3所示，具體方法如下先用限制性內切酶PstI對載體pCAMBI1301進行酶切，片斷回收後去磷酸化處理，將去磷酸化的酶切片段與經相同酶酶切且經去磷酸化處理的含RuBPCase基因小亞基啟動子的載體pRGN(其物理圖譜如圖3a所示)連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經篩選後獲得中間載體，命名為pCB-PRbcS，然後用限制性內切酶HindIII和Xba I雙酶切質粒載體pCB-PRbcS，對酶切產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大小約為2.7kb的RuBPCase基因小亞基啟動子片段，然後將該啟動子片段與步驟1構建的經Hind III和Xba I雙酶切的載體pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，對其進行藍白篩選，挑選陽性單克隆提質粒並進行酶切鑑定，酶切鑑定結果如圖4所示(泳道1為經Xba I和Kpn I雙酶切的質粒，泳道2為經Xba I和Hind III雙酶切的質粒，泳道3為經Hind III和EcoR I雙酶切的質粒，泳道4為經Hind III和EcoR V雙酶切的質粒，泳道5為DL15，000 DNAMarker，泳道6為所提質粒)，經HInd III和EcoRV雙酶切可得到大小約2.4kb條帶的為正向連接的陽性克隆，將該陽性克隆質粒命名為pRbcS-Eppc。
3、植物表達載體pZMp-Eppc的構建含有Eppc的植物表達載體pZMp-Eppc的構建流程如圖5所示，具體方法如下先用限制性內切酶Hind III和Xba I對含有玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的啟動子的載體PUCm-T-ZMp(其物理圖譜如圖5a所示)進行酶切，對酶切產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大小約為1.3kb的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的啟動子序列片段，然後將該啟動子片段與步驟1構建的經相同酶雙酶切的載體pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，對其進行藍白斑篩選，挑選陽性單克隆提質粒進行酶切鑑定，酶切鑑定結果如圖6所示(泳道1為DL15，000DNA Marker，泳道2為所提質粒，泳道3為經Xba I和Kpn I雙酶切的質粒，泳道4為經Hind III和Xba I雙酶切的質粒，泳道5為經Hind III和Kpn I雙酶切的質粒，泳道6為1kb DNA Ladder)。
二、Eppc轉基因植株的獲得及其光合作用的功能驗證植物材料中花8號水稻和旱稻65分別將步驟一構建的Eppc的植物表達載體pUbi-Eppc、pRbcS-Eppc、pZMp-Eppc用農桿菌介導法轉化水稻，得到219株轉稗草Eppc的T0代植株(由愈傷組織分化得到的轉基因植株)。對其中30株轉基因植株進行光合性能鑑定，結果如表1和表2所示，光合速率高於對照30％的植株佔23.33％(共計7株)，光合速率最高的植株高於對照(未轉基因植株)45％。表明轉Eppc能夠顯著提高C3作物的光合速率、蒸騰速率和水分利用效率。同時，對轉入玉米PEPC基因的水稻，共測定5個單株(株號ZH65，ZH65-1，ZH65-2，ZM-2，ZM-3)，其中只有1株(ZH65)的光合速率略高於對照，其餘均低於對照。
表1轉入Ubiquitin和Rubisco啟動子控制轉稗草Eppc基因的水稻淨光合速率

表2轉稗草Eppc基因的水稻淨光合速率Pn、氣孔導度Gs、胞間CO2濃度Ci、蒸騰速率E及水分利用效率WUE(Pn/Trmmol)各頻率區平均植變化趨勢

注1.蒸騰速率E的單位μmol·m-2·S-1；2.氣孔導度Gs的單位為mmol·m-2·S-1；3.淨光合速率Pn的單位為μmol·m-2·S-14.胞間CO2濃度Ci的單位為ppm(mg/L)。
序列表160221012112886212DNA213稗屬稗草(Echinochloa crusgalli)4001atggcgtccg agcggcacca gtcgatcgac gcgcagctgc ggctgctggc gccgggcaag60gtctccgagg acgacaagct cgtcgagtac gacgccctcc tcgtcgaccg cttcctcgac120atcctacagg acctgcacgg cccgcacctc cgcgaattcg tgcaggagtg ctacgagctg180tcggcggagt acgagaacga ccgcgacgag gcgcggctcg gcgagctcgg gagcaagctc240accagcctgc ccccggggga gtccatcgtc gtcgccagct ccttctcgca catgctcaac300ctcgccaacc tcgccgagga agtgcagatc gcgcaccgcc gccggatcaa gctcaagcgc360ggggacttcg ccgacgaggc ctcggcgccc accgagtccg acatcgagga gacgctcaag420cgcctcgtct cgcagctcgg caagtcgcgc gaggaggtct tcgacgcgct caagaatcag480accgtcgacc tcgtcttcac ggcgcaccct acgcagtccg tcaggaggtc cctgctccag540aagcacggca ggatccggaa ttgcctgagg cagctgtatg ccaaggacat cactgctgat600gacaagcagg agcttgatga ggctcttcag agggagattc aggctgcttt cagaactgat660gaaatccgca gaacccctcc cactcctcaa gatgaaatgc gtgctggaat gagttacttc720catgaaacta tatggaaggg tgtaccaaaa ttcttgcgtc gtattgacac tgctctgaaa780aatattggga tcaatgagcg tctcccttac aatgcccctc ttattcagtt ctcttcctgg840atgggtggtg atcgtgatgg aaatccaaga gttacaccgg aggttacacg ggatgtgtgc900ttgttggcga gaatgatggc tgctaacctg tacttctctc agatagaaga tctaatgttt960gagctctcta tgtggcgctg cagtgatgaa cttcggatcc gtgcagatga tttacatcgg1020tctacaaaaa gggctgcaga gcactatata gaattctgga agcaagttcc tccaaatgaa1080ccttatcgtg tcatacttgg tgatgtcagg gataaattgt attatacacg agaacgttct1140cgtcatttgt tgacaactgg aatttctgag attcctgagg atgcaacttt tacgaatgtt1200gaacagtttc tggaacctct tgagctctgt tatagatcat tatgtgcctg tggtgacaaa1260cctatagctg acggaagtct ccttgatttc ttgcgtcaag tatcaacttt cgggcttgct1320
cttgtgaaac tcgacatcag gcaggaatct gatcggcaca ctgacgtcct tgattcaata1380accacacatc ctggaattgg atcctatgct gagtggtcgg aggagaaacg ccaggattgg1440ctgttgtctg aactgagggg caagcgtcca ttgtttggtt ctgatcttcc tctgactgaa1500gagactgctg atgttttggg cacatttcat gtcctcgcag agctcccaac agattgcttt1560ggcgcgtata tcatctcgat ggcaactgcc ccgtctgatg tgcttgctgt cgagcttttg1620cagcgtgagt gccatgtaaa acagccactg agagttgttc cactctttga gaaacttgca1680gatcttgaag cagccccagc agccgtagca cgactctttt ctattgactg gtacatgaat1740aggattaatg gcaagcagga ggtgatgatt ggatactcag actctggtaa agacgctgga1800cgtctctctg caacatggca aatgtataaa gcacaagagg agctgatcaa ggtggcaaag1860cattatggag taaagttgac aatgtttcac ggaaggggtg gaactgttgg cagaggaggt1920ggtcccactc atctggccat attatctcag ccaccagaca ctatacatgg atcacttcgt1980gtaacagtac aaggtgaggt tattgagcac tcctttggag aggagctctt gtgctttagg2040actttgcaac gctacactgc agctaccctt gagcatggca tgcatcctcc aatttcccca2100aagccagaat ggcgtgctct gatggatgaa atggctattg tggcaaccaa agaatatcga2160tcaattgtct tccaagaacc acgctttgtc gaatacttcg ggtcggccac acctgagact2220gaatatggta ggatgaatat tgatagtcgt ccatcgaaga ggaggcctag tgggggaata2280gaatcgctcc gtgcaattcc atggatcttt gcttggacac agacaaggtt ccatccccct2340gtttggctgg gatttggtgc agcgttcaag catatcatgc agaaggacat caggaacacc2400catactctga aagaaatgta caatgagtgg ccattctcca gggtaactct tgacttgctt2460gagatggttt tcgccaaggg agacccggga atcgcagctg tatacgacaa attgctagtt2520gctgatgatc tgcaatcctt cggagagcag ctgaggaaga actatgagga gacaaaagag2580ctactccttc aggttgctgg tcacaaggac gtccttgaag gcgatcctta cctgaagcag2640cgtctgcgcc tgcgtgagtc gtacatcacc accctgaacg tatgccaggc gtacaccctg2700aagcggattc gcgaccccag cttccaggtg agcccgcagc cggccctgtc caaggagttc2760gttgacgaga gccagcctgc ggagctggtg cgactgaacc ctgagagcga gtacgcgccg2820ggcctggaga acacgctgat cctgaccatg aagggcattg ccgccggcat gcagaacacc2880ggctag 28862102211961212PRT213稗屬稗草(Echiochloa crusgalli)
4002Met Ala Ser Glu Arg His Gln Ser Ile Asp Ala Gln Leu Arg Leu Leu1 5 10 15Ala Pro Gly Lys Val Ser Glu Asp Asp Lys Leu Val Glu Tyr Asp Ala20 25 30Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln Asp Leu His Gly Pro35 40 45His Leu Arg Glu Phe Val Gln Glu Cys Tyr Glu Leu Ser Ala Glu Tyr50 55 60Glu Asn Asp Arg Asp Glu Ala Arg Leu Gly Glu Leu Gly Ser Lys Leu65 70 75 80Thr Ser Leu Pro Pro Gly Glu Ser Ile Val Val Ala Ser Ser Phe Ser85 90 95His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Gln Ile Ala His100 105 110Arg Arg Arg Ile Lys Leu Lys Arg Gly Asp Phe Ala Asp Glu Ala Ser115 120 125Ala Pro Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu Val Ser130 135 140Gln Leu Gly Lys Ser Arg Glu Glu Val Phe Asp Ala Leu Lys Asn Gln145 150 155 160Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gln Ser Val Arg Arg165 170 175Ser Leu Leu Gln Lys His Gly Arg Ile Arg Asn Cys Leu Arg Gln Leu180 185 190Tyr Ala Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asp Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ala195 200 205Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr Asp Glu Ile Arg Arg210 215 220Thr Pro Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Ala Gly Met Ser Tyr Phe225 230 235 240
His Glu Thr Ile Trp Lys Gly Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Ile Asp245 250 255Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asn Ala260 265 270Pro Leu Ile Gln Phe Ser Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn275 280 285Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ala Arg290 295 300Met Met Ala Ala Asn Leu Tyr Phe Ser Gln Ile Glu Asp Leu Met Phe305 310 315 320Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Ser Asp Glu Leu Arg Ile Arg Ala Asp325 330 335Asp Leu His Arg Ser Thr Lys Arg Ala Ala Glu His TyrIle Glu Phe340 345 350Trp Lys Gln Val Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg ValIle Leu Gly Asp355 360 365Val Arg Asp Lys Leu Tyr Tyr Thr Arg Glu Arg Ser Arg His Leu Leu370 375 380Thr Thr Gly Ile Ser Glu Ile Pro Glu Asp Ala Thr Phe Thr Asn Val385 390 395 400Glu Gln Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr Arg Ser Leu Cys Ala405 410 415Cys Gly Asp Lys Pro Ile Ala Asp Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg420 425 430Gln Val Ser Thr Phe Gly Leu Ala Leu Val Lys Leu Asp Ile Arg Gln435 440 445Glu Ser Asp Arg His Thr Asp Val Leu Asp Ser Ile Thr Thr His Pro450 455 460Gly Ile Gly Ser Tyr Ala Glu Trp Ser Glu Glu Lys Arg Gln Asp Trp465 470 475 480Leu Leu Ser Glu Leu Arg Gly Lys Arg Pro Leu Phe Gly Ser Asp Leu485 490 495
Pro Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Val Leu Gly Thr Phe His Val Leu500 505 510Ala Glu Leu Pro Thr Asp Cys Phe Gly Ala Tyr Ile Ile Ser Met Ala515 520 525Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gln Arg Glu Cys530 535 540His Val Lys Gln Pro Leu Arg Val Val Pro Leu Phe Glu Lys Leu Ala545 550 555 560Asp Leu Glu Ala Ala Pro Ala Ala Val Ala Arg Leu Phe Ser Ile Gly565 570 575Trp Tyr Met Asn Arg Ile Asn Gly Lys Gln Glu Val Met Ile Gly Tyr580 585 590Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Thr Trp Gln Met595 600 605Tyr Lys Ala Gln Glu Glu Leu Ile Lys Val Ala Lys His Tyr Gly Val610 615 620Lys Leu Thr Met Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly625 630 635 640Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro Pro Asp Thr Ile His645 650 655Gly Ser Leu Arg Val Thr Val Gln Gly Glu Val Ile Glu His Ser Phe660 665 670Gly Glu Glu Leu Leu Cys Phe Arg Thr Leu Gln Arg Tyr Thr Ala Ala675 680 685Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Ile Ser Pro Lys Pro Glu Trp690 695 700Arg Ala Leu Met Asp Glu Met Ala Ile Val Ala Thr Lys Glu Tyr Arg705 710 715 720Ser Ile Val Phe Gln Glu Pro Arg Phe Val Glu Tyr Phe Gly Ser Ala725 730 735Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Arg Met Asn Ile Asp Ser Arg Pro Ser740 745 750
Lys Arg Arg Pro Ser Gly Gly Ile Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp755 760 765Ile Phe Ala Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Pro Pro Val Trp Leu Gly770 775 780Phe Gly Ala Ala Phe Lys His Ile Met Gln Lys Asp Ile Arg Asn Thr785 790 795 800His Thr Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Ser Arg Val Thr805 810 815Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly Ile Ala820 825 830Ala Val Tyr Asp Lys Leu Leu Val Ala Asp Asp Leu Gln Ser Phe Gly835 840 845Glu Gln Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Thr Lys Glu Leu Leu Leu Gln850 855 860Val Ala Gly His Lys Asp Val Leu Glu Gly Asp Pro Tyr Leu Lys Gln865 870 875 880Arg Leu Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Val Cys Gln885 890 895Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro Ser Phe Gln Val Ser Pro900 905 910Gln Pro Ala Leu Ser Lys Glu Phe Val Asp Glu Ser Gln Pro Ala Glu915 920 925Leu Val Arg Leu Asn Pro Glu Ser Glu Tyr Ala Pro Gly Leu Glu Asn930 935 940Thr Leu lle Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala Ala Gly Met Gln Asn Thr945 950 955 960Gly
權利要求
1.稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特徵在於所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物光合作用效率的蛋白質。
4.含有權利要求1或2所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
5.一種提高植物光合作用效率的方法，是將權利要求1或2所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因導入外植體，得到光合作用效率提高的植物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因可通過含有所述稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達載體導入植物外植體；用於構建所述植物表達載體的出發載體為pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於用於構建所述植物表達載體的出發載體為pCAMBIA1301。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述植物表達載體為pUbi-Eppc。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述植物表達載體為pRbcS-Eppc
10.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述植物表達載體為pZMp-Eppc。
全文摘要
本發明公開了一個稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼蛋白與應用，本發明提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，該基因編碼的蛋白是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物光合作用效率的蛋白質。本發明的稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因可顯著提高植物的光合作用效率，將在提高農作物的產量中發揮重要的作用。
文檔編號C12N9/00GK1865443SQ20051007062
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月17日 優先權日2005年5月17日
發明者趙明, 張桂芳, 丁在松 申請人:中國農業科學院作物科學研究所