一種穩定的α-澱粉酶檢測試劑及應用的製作方法

2023-07-09 20:35:16 4

專利名稱：一種穩定的α-澱粉酶檢測試劑及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於臨床測定血清和尿液中a -澱粉酶(AMY)活性的檢測方法及試劑。
背景技術：
a -澱粉酶(EC3.2.1.1)是最早應用於臨床檢驗的一個酶，早在20世紀初，就用來診斷急性胰腺炎，但是血清和尿液中的a -澱粉酶測定，長期以來一直是最難標準化的分析法。a -澱粉酶能水解澱粉、糖原和其它葡萄糖聚合物的a _1，4_糖苷鍵。澱粉分子是由許多葡萄糖分子組成的帶分支的大分子多糖，直鏈部分的葡萄糖單體通過a-l，4-糖苷鍵相連，分支處則以a-1，6-糖苷鍵相連，因此，澱粉經a-澱粉酶可水解生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽寡糖及糊精的混合物。大多數澱粉含2(T28%的直鏈澱粉和72 80%的支鏈澱粉。血、尿a-澱粉酶(AMY)測定在臨床上的應用已有很長的歷史，到目前為止，測定方法已不下200種。應用於澱粉酶測定的底物種類繁多，早期的測定方法所採用的底物是澱粉，六十年代出現了以染色澱粉為底物的測定方法，由於澱粉結構組成的不確定性及酶解產物的不均一性，使酶促反應不能按化學式量進行計算。應用不同來源、廠家、批號的澱粉作底物時，測得結果差別較大，方法不易標準化。染色澱粉中色素的加入量不易控制，操作繁雜，不適合自動分析。七十年代後期，國外出現了以具有明確結構組成的人工合成底物進行a-澱粉酶測定的方法，這些方法成為現在檢測a-澱粉酶的主流，但是各個方法也存在著一些弊端，IFCC批准了用亞乙基封閉的G7-PNP作底物的酶偶聯法(EPS法)作為臨時推薦方法，但該法需工具酶，並需多步水解完成，延遲時間長，這不是最理想的參考方法。使用2-氯-4-硝基苯-麥芽三糖(G3-CNP)作底物直接測定澱粉酶也有多篇文獻報導，該法延滯時間較短，CNP的摩爾消光係數不易受pH的影響，G3-CNP法更符合IFCC提出的理想AMS測定方法的條件，但因受內源性葡萄糖苷酶的幹擾，被IFCC拒絕成為參考方法。

發明內容
為了解決以上技術問題，本發明提供了一種檢測a-澱粉酶的試劑及方法，本發明以2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷(Gal-G2-CNP)為底物，在非還原性末端用半乳糖代替葡萄糖，從而避免了內源性葡萄糖苷酶的影響，使用2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷(Gal-G2-CNP)作為底物，不需要再加工具酶，延滯時間較短，反應產物CNP的摩爾消光係數不易受pH的影響，用半乳糖修飾麥芽寡糖苷的非還原端殘基，阻止底物的非特異性水解，底物的穩定性顯著提高。同時加入一些防腐劑、離子類以及一些易溶的表面活性劑，增強了溶液的穩定性，使試劑達到臨床應用要求。本發明的技術方案如下:
一種穩定的a -澱粉酶檢測試劑，包括體積比為4:1的緩衝液和底物液，
所述緩衝液的組成為:pH7.0MES 緩衝液50-200mmol/L
NaCl60-100 mmol/L
CaCl210-20 mmol/L
防腐劑 NaN3l-10g/L ；
所述底物液的組成為:
pH7.0MES 緩衝液50-200mmol/L
2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷 30-50 mmol/L 防腐劑 NaN3l-10g/L ；
所述MES緩衝液的pH值範圍為6.5-7.5 ；
進一步的，所述緩衝液和底物液中還包括十二烷基苯磺酸鈉l_20g/L。本發明採用如下步驟檢測a -澱粉酶的活性:按配比配製緩衝液和底物液；採用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，將緩衝液和底物液按照4:1的比例放置到對應的試劑位上，在樣品盤的對應位置放置好蒸餾水、朗道標準品和樣本，先通過檢測蒸餾水和朗道標準品獲得標準品檢測的吸光度變化，根據朗道標準品AMY試劑的靶值(105U/L)，得到試劑的K因子，之後根據全自動生化分析儀測定的樣本的吸光度，獲得樣本的a -澱粉酶濃度。本發明具有如下有益效果:所用的檢測底物為2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷(Gal-G2-CNP)，不需要再加工具酶，減少了試劑的成本，用半乳糖修飾麥芽寡糖苷的非還原端殘基，阻止底物的非特 異性水解，底物的穩定性顯著提高，而且反應延滯時間較短，反應產物CNP的摩爾消光係數不易受pH的影響，通過驗證，本試劑與同類檢測試劑對比相關性好，臨床檢測樣本結果一致，能夠達到市場對產品的應用要求，試劑添加表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉，穩定性更好，是一種更加穩定、良好的a -澱粉酶檢測試劑。


圖1為實施例1試劑與GmbH公司試劑盒對比檢測結果。
圖2為表面活性劑對試劑穩定性的影響圖。
具體實施例方式 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1
本實施例描述的a -澱粉酶檢測試劑，包括體積比為4:1的緩衝液和底物液:
緩衝液配比如下:
pH7.0MES 緩衝液100 mmol/L
NaCl80 mmol/L
CaCl215 mmol/L
防腐劑 NaN32g/L ；
底物液配比如下:
pH7.0MES 緩衝液100 mmol/L
2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷(Gal-G2-CNP)50 mmol/L
防腐劑 NaN32g/L。
本實施例描述的a-澱粉酶檢測試劑，在使用時，其測定方法是採用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，如東芝40全自動分析儀，將組分A和組分B按照4:1的比例放置到對應的試劑位上，在樣品盤的對應位置放置好蒸餾水、朗道標準品和樣本，先通過檢測蒸餾水和朗道標準品獲得標準品檢測的吸光度變化，根據朗道標準品AMY試劑的靶值(105U/L)，得到試劑的K因子，之後根據全自動生化分析儀測定的樣本的吸光度，就可以獲得樣本的a-澱粉酶濃度。操作如表1:
表I a-澱粉酶檢測試劑檢測方法
權利要求
1.一種穩定的a-澱粉酶檢測試劑，包括體積比為4:1的緩衝液和底物液， 所述緩衝液的組成為: pH7.0MES 緩衝液50-200mmol/LNaCl60-100 mmol/LCaCl210-20 mmol/L防腐劑 NaN3l-10g/L ； 所述底物液的組成為: pH7.0MES 緩衝液50-200mmol/L 2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷 30-50 mmol/L 防腐劑 NaN3l-10g/L ； 所述MES緩衝液的pH值範圍為6.5-7.5。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑，其特徵在於，所述緩衝液和底物液中還包括十二烷基苯磺酸鈉l-20g/L。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑，其特徵在於，包括體積比為4:1的緩衝液和底物液: 緩衝液配比如下: pH7.0MES 緩衝液100 mmol/LNaCl80 mmol/L CaCl215 mmol/L 十二燒基苯磺酸鈉lg/L防腐劑 NaN32g/L ； 底物液配比如下: pH7.0MES 緩衝液100 mmol/L2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷(Gal-G2-CNP)50 mmol/L 十二燒基苯磺酸鈉lg/L防腐劑 NaN32g/L。
4.一種應用權利要求1、2或3所述的檢測試劑檢測a-澱粉酶的方法，其特徵在於，按配比配製緩衝液和底物液；採用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，將緩衝液和底物液按照4:1的比例放置到對應的試劑位上，在樣品盤的對應位置放置好蒸餾水、朗道標準品和樣本，先通過檢測蒸餾水和朗道標準品獲得標準品檢測的吸光度變化，根據朗道標準品AMY試劑的靶值(105U/L)，得到試劑的K因子，之後根據全自動生化分析儀測定的樣本的吸光度，獲得樣本的a -澱粉酶濃度。
全文摘要
本發明涉及一種穩定的α-澱粉酶檢測試劑及應用，所述檢測試劑包括體積比為4:1的緩衝液和底物液，所述緩衝液由MES緩衝液、NaCl 、CaCl2 、十二烷基苯磺酸鈉 和防腐劑 NaN3 按一定配比配製而成；所述底物液由MES緩衝液 、2-氯-4-硝基苯-麥芽糖苷(Gal-G2-CNP) 、十二烷基苯磺酸鈉 、防腐劑 NaN3 按一定配比配製而成；本發明 在應用中不需要再加工具酶，減少了試劑的成本，用半乳糖修飾麥芽寡糖苷的非還原端殘基，阻止底物的非特異性水解，底物的穩定性顯著提高，而且反應延滯時間較短，反應產物CNP的摩爾消光係數不易受pH的影響。
文檔編號G01N21/31GK103207156SQ201310103140
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月28日 優先權日2013年3月28日
發明者譚柏清, 王進, 甘宜梧 申請人:山東博科生物產業有限公司