一種鑑定黑木耳菌株185的方法及用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列的製作方法
2023-07-09 04:56:16
專利名稱：一種鑑定黑木耳菌株185的方法及用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑑定黑木耳菌株的方法及用於鑑定黑木耳菌株的基因序列。
背景技術：
黑木耳菌株185，隸屬於真菌門、擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，該菌株適於椴栽和袋栽的晚生品種，木耳子實體顏色黑，耐水淋，袋栽單片無耳基，是一個很優良的黑木耳菌株，擁有廣闊的市場前景。
現有鑑定黑木耳菌株185的方法主要有表觀形態鑑定法、酯酶同工酶鑑定方法和DNA分子指紋鑑定方法。
用表觀形態特徵為依據鑑定黑木耳菌株，周期長、易受環境因素的影響，而且對形態差異較小的黑木耳菌株很難區分。酯酶同工酶鑑定方法易受培養條件、培養時間和發育階段的影響。DNA分子指紋(RADP、 ISSR、 SRAP等)鑑定方法是當今較先進的黑木耳菌株鑑定技術，但需篩選大量引物進行PCR擴增，再根據獲得的數據構建遺傳聚類圖，確認菌株間的親緣關係遠近，過程繁瑣，耗時耗力。另外目前也沒有能夠準確鑑定黑木耳菌株185的基因序列。
發明內容
本發明是為了解決現有鑑定黑木耳菌株185的方法存在鑑定結果易受外界環境條件、培養時間、發育階段的影響，需要篩選大量的PCR引物、或者檢測過程繁瑣以及目前沒有能夠準確鑑定黑木耳菌株185的基因序列的問題，而提供一種鑑定黑木耳菌株185的方法及鑑定黑木耳菌株185的基因序列。
本發明鑑定黑木耳菌株185的方法按照如下步驟進行 一、提取待檢測黑木耳菌株的總DNA ，以5 '-TCAAGGCAGCTTCTCAGC-3'為正向引物、5'-GCACAAACAAAGACACGGT-3'為反向引物對提取出的DNA進行PCR擴增;二、將步驟一 PCR的擴增反應產物與3pL溴酚藍指示劑混合，用1.2%(wt.)的瓊脂糖凝膠在0.5XTBE緩衝液中以5V/cm的電壓進行電泳，電泳後用濃度為0.5pg/mL的EB對凝膠染色15min，掃描凝膠成像結果；擴增出316bpDNA片段的即為黑木耳菌株185。
本發明用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列長度為316bp。本發明用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列為黑木耳菌株185的特異性基因。
本發明的黑木耳菌株185購買於陝西寧強縣真菌研究所。
本發明通過瓊脂糖凝膠電泳檢測是否能夠擴增出316bp的DNA片段，擴增出316bp的DNA片段的即為黑木耳菌株185。
用本發明的方法鑑定黑木耳菌株不受外界環境條件、培養時間、菌株發育階段的影響；亦無需篩選大量PCR擴增引物；對PCR反應條件的改變不敏感，鑑定結果可靠性和可重複性強。
圖1為具體實施方式
二的方法鑑定黑木耳菌株結果圖，其中M代表DL2000Plus， l代表黑木耳菌株185， 2代表黑29， 3代表黑威981， 4代表黑威9， 5代表黑木耳931， 6代表黑木耳Au86， 7代表黑木耳8808。
具體實施例方式
本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式鑑定黑木耳菌株185的方法按照如下步驟進行 一、提取待檢測黑木耳菌株的總DNA，以5'-TCAAGGCAGCTTCTCAGC-3'為正向引物、5'-GCACAAACAAAGACACGGT-3'為反向引物對提取出的DNA進行PCR擴增；二、將步驟一 PCR的擴增反應產物與3pL溴酚藍指示劑混合，用1.2% (wt.)的瓊脂糖凝膠在0.5XTBE緩衝液中以5V/cm的電壓進行電泳，電泳後用濃度為0.5pg/mL的EB對凝膠染色15min，掃描凝膠成像結果；擴增出316bpDNA片段的即為黑木耳菌株185。
本實施方式能夠擴增出316bp的DNA片段的為黑木耳菌株185。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中PCR反應體系為25pL由2.5^L的10Xbuffer、2.(VL濃度為25mmol/L的MgCl2溶液、0.2|iL濃度為10 mmol/L的dNTPs、 1.0|aL濃度為20pmol/L的正向引物、1.0ML濃度為20pmol/L的反向引物、0.2pL濃度為5.0U L的TaqDNA聚合酶、0.2^L濃度為60pg/mL的DNA模板和餘量的無菌雙蒸水組成；PCR反應條件94。C預變性5min， 94。C變性40s、 53。C退火60s、 72"C延伸80s,共45個循環，72r延伸10min。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
本實施方式以DL2000 Plus為Marker, DNA Marker自上至下條帶分別為5000bp、 3000bp、 2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp。
採用本實施方式的方法分別對以下品種的黑木耳進行檢驗黑29、黑威
981、黑威9、黑木耳931、黑木耳Au86、黑木耳8808和黑木耳菌株185進行檢驗，檢測結果如圖1所示，從圖1中能夠看出本實施方式的方法能夠準確鑑定黑木耳菌株185。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中
PCR反應體系為25nL由2.5pL的10Xbuffer、2.5^L濃度為20mmol/L的MgCl2溶液、0.2pL濃度為10mmol/L的dNTPs、 l.OpL濃度為20nmmol/L的正向引物、l.OpL濃度為20|imol/L的反向引物、0.2|iL濃度為5.0U L的TaqDNA聚合酶、0.2pL濃度為60ng/mL的DNA模板和餘量的無菌雙蒸水組成；PCR反應條件94。C預變性5min， 94"C變性40s、 53。C退火60s、 72。C延伸80s,共45個循環，72"C延伸10min。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
將本實施方式鑑定為黑木耳菌株185的菌株分別進行DNA分子指紋(RADP)、酯酶同工酶和表觀形態特徵的驗證。本實施方式鑑定為黑木耳菌株185的DNA分子指紋與原保藏的黑木耳菌株185的DNA分子指紋完全一致，本實施方式鑑定為黑木耳菌株185的菌株的酯酶同工酶酶譜與原保藏的黑木耳菌株185的酯酶同工酶酶譜完全一致，本實施方式鑑定為黑木耳菌株185的菌株與原保藏黑木耳菌株185菌株形態相同並且無拮抗現象。說明本實施方式鑑定黑木耳菌株185的方法精準。
具體實施方式
四本實施方式用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列為
GCGGCGCTGGACAACATATGTAAGTTTTACTGTCAGCGGGGCCAGCGGGCGTGTCTTTGTTTGTGC 。
採用以下實驗驗證本實施方式用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列的特
異性
一、RAPD-PCR
1 、提取總DNA: (1)菌絲體製備:取cPDA液體培養基80mL裝入250mL 三角瓶，121'C滅菌30min。冷卻後，將採用本實施方式的序列判斷為黑木耳 菌株185與原保藏的黑木耳菌株185同時轉接於液體培養基內，25"C靜止培養 2 3天，再以130r/min的轉速25"C恆溫搖床培養2 5天，菌球圓潤，無色素 產生即可；(2)取新鮮菌絲稱重0.5g左右，加入液氮，待液氮蒸乾後迅速研 磨至糊狀；用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取菌絲體總DNA。
2、RAPD-PCR擴增引物用20條RAPD引物對供試黑木耳菌株進行PCR 擴增，引物編號及核苷酸序列如表1所示(由上海生工生物工程技術服務有限 公司合成)
表1 供試RAPD引物編號及核苷酸序列
編號鹼基序列(5'-3')編號鹼基序列(5'-30
S4GGACTGGAGTS24MTCGGGCTG
S6TGCTCTGCCCS29GGGTMCGCC
SuGTAGACCCGTSs2GTGAGGCGTC
S12CCTTGACGCAS68TGGACCGGTG
s13TTCCCCCGCTTGAGTGGGTG
Sl4TCCGCTCTGGSsoACTTCGCCAC
s15GGAGGGTGTTSl26GGGMTTCGG
S6TTTGCCCGGASl27CCGATATCCC
Sl9ACCCCCGAAGSl29CCMGCTTCC
S2OGGACCCTTACSl48TCACCACGGT
PCR反應體系(25^L)中含有lxPCRbuffer，濃度為2.0讓ol/L的MgCL2， 濃度為O.lmmol/L的dNTPs， l.OU的TaqDNA聚合酶，濃度為O.5pmol/L的 引物(表l中各引物)，15ng模板DNA。
PCR反應條件95。C預變性2min;進行45個循環94。C變性40s， 36°C 退火60s， 72。C延伸80s;最後72。C延伸5 min。以無菌雙蒸水代替模板DNA 設為陰性對照。
將各引物的PCR反應產物與3pL溴酚藍指示劑混合，用1.0% (wt.)瓊 脂糖凝膠，0.5xTBE緩衝液，5V/cm電壓電泳，0.5|ig/mL EB染色15min，以 DL2000為Marker,凝膠成像掃描記錄結果。將瓊脂糖凝膠上出現DNA片段
7的記為l，不出現的記為0，統計後輸入電腦，用NT-SYS軟體體系進行聚類 分析，構建遺傳相關聚類圖譜。通過NT-SYS軟體體系進行聚類分析，構建遺 傳相關聚類圖譜，採用本實施方式序列判斷為黑木耳菌株185與原保藏菌株 185相似度為100%;採用本實施方式序列判斷不是黑木耳菌株185的菌株與 原保藏菌株185相似度小於100%。
以上的實驗說明本實施方式用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列能夠準 確鑑定黑木耳菌株185。
二、 酯酶同工酶技術檢測黑木耳菌株185
將採用本實施方式序列判斷為黑木耳菌株185、採用本實施方式序列判斷 不是黑木耳菌株185的菌株與原保藏黑木耳菌株185分別轉接於OGF培養基， 靜止培養15天，培養液過濾分別收集菌絲2~3 g，用蒸餾水衝洗2 3次，分別 加入0.1mol/L TBE緩衝液1~2滴，在-20"C的條件下冷凍16h;在冰浴的條件 下將菌絲研磨成糊狀，在4"C的條件下以12000r/min的速度分別離心30min， 上清液即為各菌株的酯酶同工酶樣品。
用垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳，分離膠質量濃度為7.5%、 pH值為8.9; 濃縮膠質量濃度為2.5°/。、 pH值為6.7;電極緩衝液Tris-Glycine系統，pH值 為8.3;點樣35^iL，溴酚蘭作指示劑，在4T:的條件下電泳，濃縮膠電壓為120V, 分離膠電壓為220V，電泳4.0h，待指示劑距前沿線l.Ocm時取下凝膠；用醋 酸-a-萘酯和堅牢蘭染色，直至酯酶同工酶譜帶出現為止，用日光白板或凝膠 成像系統檢測供試黑木耳菌株的酯酶同工酶譜帶，採用本實施方式序列判斷為 黑木耳菌株185與原保藏菌株185的酯酶同工酶譜帶完全相同；採用本實施方 式序列判斷不是黑木耳菌株185的菌株與原保藏菌株185的酯酶同工酶譜帶不 完全相同。
說明本實施方式用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列能夠準確鑑定黑木 耳菌株185。
三、 表觀形態特徵
將菌絲表觀形態觀察與對峙實驗相結合鑑別黑木耳菌株185，首先採用 cPDA培養基活化黑木耳菌株。將已活化的黑木耳菌株185和其他黑木耳菌株 同時轉接於cPDA固體培養皿(培養皿直徑90mm)中。各菌株取2X2mm2， 分別與黑木耳菌株185兩兩配對接種於cPDA平皿中心兩側，相距3cm， 25。C恆溫避光培養7天後，觀察菌絲生長情況和菌落交界處情況，每一試驗組合
設3個重複。
選出與原保藏黑木耳菌株185形態相同並且無拮抗現象的菌株，這些選出 的菌株即為黑木耳菌株185，將這些選出的菌株用具體實施方式
三的方法進行 擴增檢驗，均能擴增出本實施方式用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列。
以上的實驗說明本實施方式用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列只存在 於黑木耳菌株185的DNA中，具有特異性。序列表
黑龍江省科學院微生物研究所
〈120〉 一種鑑定黑木耳菌株185的方法及用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列
〈■ 3
〈210〉 1 18 <212〉腿 <213〉人工序列
用於擴增黑木耳菌株185特異性基因的正向引物。 〈400〉 1
tcaaggcagc ttctcagc 18
〈210〉 2 19 〈212〉纖 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉用於擴增黑木耳菌株185特異性基因的反向引物。 <400〉 2
gcacaaacaa agacacggt 19
〈210> 3 〈211〉 316 〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈220〉
<223〉用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列。 〈400〉 3
tcaaggcagc ttctcagctc ctggctgacg gcatcgacgc gtgttgaacg cggcgctgga 60 caacatatgt aagttttact gtcagcgggg ccagcgggtg ttacacgttt ggattattcc 120 ctcgttttca cttcgttgat acaatctgaa tgggtctaaa gaaacccccc tccttagatt 180 tgggggctgc gtgttcagtg tagtctatgt tttaatccga tgaccttatc atttgggtcc 240cagccgactt cagggccggt cacactggaa atggctccga aagcctctcc cgctcagacc 300 gtgtctttgt ttgtgc 31權利要求
1、一種鑑定黑木耳菌株185的方法，其特徵在於鑑定黑木耳菌株185的方法按照如下步驟進行一、提取待檢測黑木耳菌株的總DNA，以5′-TCAAGGCAGCTTCTCAGC-3′為正向引物、5′-GCACAAACAAAGACACGGT-3′為反向引物對提取出的DNA進行PCR擴增；二、將步驟一PCR的擴增反應產物與3μL溴酚藍指示劑混合，用1.2％(wt.)的瓊脂糖凝膠在0.5×TBE緩衝液中以5V/cm的電壓進行電泳，電泳後用濃度為0.5μg/mL的EB對凝膠染色15min，掃描凝膠成像結果；擴增出316bpDNA片段的即為黑木耳菌株185。
2、 根據權利要求1所述的鑑定黑木耳菌株185的方法，其特徵在於步驟 一中PCR反應體系為25pL由2.5pL的10Xbuffer、 2.0pL濃度為25mmol/L 的MgCl2溶液、0.2pL濃度為10 mmol/L的dNTPs、 1.0pL濃度為20pmol/L 的正向引物、l.(HiL濃度為20pmol/L的反向引物、0.2pL濃度為的 TaqDNA聚合酶、0.2pL濃度為60pig/mL的DNA模板和餘量的無菌雙蒸水組 成；PCR反應條件94。C預變性5 min， 94。C變性40 s、 53。C退火60s、 72°C 延伸80s，共45個循環，72。C延伸10min。
3 根據權利要求1所述的鑑定黑木耳菌株185的方法，其特徵在於步驟 —中PCR反應體系為25|iL由2.5pL的10Xbuffer、 2.5jaL濃度為20mmol/L 的MgCl2溶液、0.2jaL濃度為10 mmol/L的dNTPs、 l.O]uL濃度為20|Limol/L 的正向引物、l.OpL濃度為2(^mol/L的反向引物、0.2|aL濃度為5.0U&L的 TaqDNA聚合酶、0.2pL濃度為60ng/mL的DNA模板和餘量的無菌雙蒸水組 成；PCR反應條件94。C預變性5min， 94"變性40 s、 53。C退火60s、 72°C 延伸80s，共45個循環，72'C延伸10min。
4、 一種用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列，其特徵在於用於鑑定黑木 耳菌株185的基因序列為TCAAGGCAGCTTCTCAGCTCCTGGCTGACGGCformula see original document page 3
全文摘要
一種鑑定黑木耳菌株185的方法及用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列，它涉及了一種鑑定黑木耳菌株的方法及用於鑑定黑木耳菌株的基因序列。本發明解決了現有鑑定黑木耳菌株185的方法存在鑑定結果易受外界環境條件影響、需要篩選大量引物以及目前沒有能夠準確鑑定黑木耳菌株185的基因序列的問題。本發明鑑定黑木耳菌株185的方法按照如下步驟進行一、提取總DNA，擴增；二、凝膠電泳；即可鑑定出待測菌株是否為黑木耳菌株185。本發明用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列長度為316bp。本發明的鑑定方法不受外界環境條件的影響，無需篩選大量引物。本發明用於鑑定黑木耳菌株185的基因序列為黑木耳菌株185的特異性基因。
文檔編號C12Q1/68GK101475991SQ200910071299
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月19日 優先權日2009年1月19日
發明者張丕奇, 張介馳, 馬慶芳 申請人:黑龍江省科學院微生物研究所