一株擔子菌類的酵母菌及其培養方法
2023-08-09 07:23:56
專利名稱：一株擔子菌類的酵母菌及其培養方法
技術領域：
本發明涉及微生物，具體而言，涉及擔子菌類的酵母菌。
背景技術：
擔子菌是一群多種多樣的真菌，全世界有1100屬，16000餘種。都是由多細胞的菌絲體組成的有機體，菌絲均具橫隔膜。經檢索，涉及擔子菌的中國專利申請件有85106023號《從擔子菌菌絲體中提取有效成分的方法》、88103414. 2號《塊狀擔子菌及其栽培方法》、00806244. 7號《來源於擔子菌培養物的新型物質、其製造方法及其用途》、00806635. 3號《在液體培養基中培養擔子菌綱真菌的方法》、01807160. O號《擔子菌亞門和五加科提取物的生理活性組合物》、200410011142. 4號《牛樟芝擔子菌類的多糖體及其用途》、200480011774. 9號《擔子菌、擔子菌提取組合物、保健食品和免疫強化劑》、200680033191. 5號《擔子菌類真菌的糖組合物作為抗病原體的殺蟲劑》、200680022879. 3號《生產木質素降 解酶的木腐擔子菌》、200880012804. 6號《來自擔子菌綱的肽酶》、200980138468. 4號《用擔子菌菌絲體和酵母細胞對經預處理的含木素纖維素材料酶水解的改進》等，但迄今為止未見涉及擔子菌類的酵母菌的專利申請件。
發明內容
本發明的目的是提供一株擔子菌類的酵母菌，以便對其進行多相分類研究，了解其生理和化學分類學特徵。本發明的又一目的是提供該菌株的培養方法。發明人在研究的過程中發現該菌株屬於隱球菌屬，它和其它幾株類似菌株的基因和生物學特點均和已知的隱球菌有較大區別，各種實驗證明其符合一種新型隱球菌菌種的特點；由於該菌株發現於自然界，其毒力未知，因此對該菌的研究有助於加深對臨床病原隱球菌毒力和耐藥性進化的認識，為將來更好地預防和治療相關疾病提供依據。發明人提供的擔子菌類的酵母菌菌株屬於隱球菌屬，是從印度南部的Guindy國家公園中的一棵肉桂科的熱帶陣雨樹上分離獲得，該菌株在日本聯合保藏中心的編號為IFM56699。在我國中國典型培養物保藏中心保藏的菌株保藏號CCTCC N0:M2011246，於2011年7月10日保藏，保藏單位的地址為中國湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。上述菌株建議命名為Oypi叱叱狀 ·從sp. IFM56699，這是因為IFM56699菌株與其最相似的菌種Cryptocococcus podzoIicus兩者在D1/D2和ITS域的相似之處分別有95. 8%和92. 9% ;其形態、生理和化學分類學特徵都支持該菌株屬於隱球菌屬的觀點。但其系統發育和生理分析均表明該株菌代表了一個隱球菌屬新種。Cryptococcus cassiae IFM 56699τ 在 GenBank/EMBL/DDBJ 上註冊的 D1/D2 區和ITS域的DNA序列的編號分別是AB519799和AB519800。發明人對該菌株的基因進行了研究，結果是>Cryptococcus cassiae ITS 基因片段數據
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>Cryptococcus cassiae 的 25S rRNA 基因的 D1/D2 區域片斷數據 TAGCGGCGAGCGAAGTGGGAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCGTCCTCCGGGCGTCCGCATTGTAATCTAT
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通過實踐，發現該菌的培養較容易，一般的普通真菌培養基(沙保弱，PDA等)均能生長，生長周期短，1-2天就可能回收大量新生菌細胞，如能用於工業用途非常方便。但在臨床常規藥敏試驗的1640RPMI培養基上不能生長。發明人提供的菌株的培養方法是在YMA培養基上接入菌種，30°C條件下連續培養3天，細胞呈卵形有薄莢膜，並可單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養基上30°C條件下培養6天，細胞呈檸檬形，直徑I. 5 3. O X 3. 5 6. O微米，有厚度O. 6 O. 9微米的薄莢膜，並通過在細胞上的小預測證明其可單個或成對出芽，表現為兩極或多邊出芽；在YMA培養基上於25°C下培養19天，圓形細胞發生單個，成對或鏈狀的出芽，表現為多邊出芽。在YMA，PDA,或CMA培養基上劃線培養出的是粘稠的菌落呈粘液狀，光滑，整個菌落邊緣晶瑩透亮。培養1-3天菌落呈白色，I周后變為奶油色，3個星期以後成為橙色。在CMA或PDA培養基上半厭氧環境中生長超過15天會產生假菌絲。不生產芽分生孢子。有性型未知。發酵能力陰性。上述YMA (Yeast Morphology Agar)培養基是指酵母菌形態瓊脂培養基,上述PDA(Potato Dextrose Agar)培養基是指馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基,上述CMA(Corn Meal Agar)培養基是指麥芽浸膏瓊脂培養基。IFM56699T菌株的特徵性碳和氮化合物的同化模式列於表I。
表 I 比較 C cassiae IFM 56699T 和podzolicus CBS 6819T 的生理
特性
表中一，沒有增長；+，增長；D，延遲增長(超過4天)；W，增長乏力。能被該菌株同化的碳化合物有D -葡萄糖，菊粉，蔗糖，棉子糖，D -半乳糖，海藻糖(延遲)，麥芽糖，α-甲基-D-葡萄糖苷(弱)，山梨醇(弱)，澱粉，纖維二糖，水楊素，L-鼠李糖(弱)，D -木糖，L -阿拉伯糖，乙醇(延遲)，核糖醇(弱)，D -甘露醇(延遲)，肌醇，琥珀酸，D-葡萄糖醛酸脂和D -葡萄糖。沒有同化的碳化合物有蜜二糖，山梨糖，乳糖，D -核糖，赤蘚糖醇，甲醇，D -阿拉伯糖，和檸檬酸。這個新穎的菌株同化的氮化合物有D-氨基葡萄糖和L -賴氨酸(弱)。不同化的氮化合物有亞硝酸鹽，硝酸鹽和肌酐。從表I中看出在沒有維生素的培養基上生長延遲，其可以在42°C下生長，但不能在45°C的YM肉湯培養基中生長。最適生長溫度介於27°C和37°C之間。據觀察在50%或60% (質量分數)葡萄糖/酵母浸膏瓊脂培養基上沒有生長。在含有O. 01%和0.1%酮的培養基中培養結果陰性。尿素水解和重氮藍反應試驗的結果是陽性的。無澱粉狀化合物的產生。主要的輔酶類型是Q- 10。本發明的一株擔子菌類的酵母菌，對該菌株進行了多相分類研究、了解其生理和化學分類學特徵，本發明的培養方法為其研究提供了基礎，從而為加深對臨床病原隱球菌毒力和耐藥性進化的認識，為將來更好地預防和治療相關疾病提供依據。
圖I為檸檬形的C. cassiae IFM 56699T營養細胞，在PDA培養基上30°C生長6天的狀態，圖中可見細胞有薄薄的莢膜，比例尺表示10微米；圖2為在YMA培養基中25 0C生長19天的狀態，圖中可見圓形至橢圓形的成對或鏈狀的C. cassiae IFM 56699τ營養細胞，比例尺表示10微米；圖3為cassiae IFM 56699τ在PDA培養基上30°C生長7天的狀態，圖中可見掃描電子顯微照片顯示出芽細胞和budding scars芽痕，比例尺表示10微米；圖4為cassiae IFM 56699τ在PDA培養基上30°C生長7天的放大狀態，圖中用箭頭指出buddingscars芽痕，比例尺表示5微米；圖5為以26S rDNA的D1/D2區和ITS域的串聯序列為基礎的IFM 56699τ和相關菌株的NJ (Neighbor-Join)系統發育樹，圖中IFM56699T屬於層菌綱層菌綱(Hymenomycetes)酵母的銀耳目(Tremellales)分支；在D1/D2和ITS聯合的系統發育樹上，菌株IFM56699最接近的系統進化真菌菌種是Crjpiococci/s podzolicus和Bullera 但是在進化樹上可見IFM56699T與其相鄰的已知菌種在進化距離上明顯較遠，說明IFM56699T代表的相關類似菌株很有可能在分類上屬於一個新的隱球菌菌種類型。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述。實施例
按照以下方法培養擔子菌類的酵母菌
在YMA培養基即酵母菌形態瓊脂培養基上接入擔子菌類的酵母菌菌種，於30°C條件下連續培養3天，細胞呈卵形有薄莢膜，並可單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養基即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上30°C條件下培養6天，細胞呈檸檬形如圖1，直徑I. 5 3. 0X3. 5 6. O微米，有厚度O. 6 O. 9微米的薄莢膜，並通過在細胞上可單個或成對出芽，表現為兩極或多邊出芽；在YMA培養基即酵母菌形態瓊脂培養基上於25°C下培養19天，圓形細胞發生單個如圖2，成對或鏈狀的出芽，為多邊出芽。在YMA，PDA，或CMA培養基即麥芽浸膏瓊脂培養基上劃線培養出的是粘稠的菌落呈粘液狀，光滑，整個菌落邊緣晶瑩透亮；培養I 天菌落呈白色，I周后變為奶油色，3個星期以後成為橙色；在CMA或PDA培 養基上半厭氧環境中生長超過15天會產生假菌絲，不生產芽分生孢子。
權利要求
1.一株擔子菌類的酵母菌,其特徵在於該菌株屬於隱球菌屬，是從印度南部的Guindy國家公園中的一棵肉桂科的熱帶陣雨樹上分離獲得，該菌株為IFM56699，菌株保藏號CCTCC N0:M2011246，2011年7月10日在中國典型培養物保藏中心保藏。
2.如權利要求I所述酵母菌菌株的培養方法，其特徵是在YMA培養基上接入菌種，30°C條件下連續培養3天，細胞呈卵形有薄莢膜，並可單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養基上30°C條件下培養6天，細胞呈檸檬形，直徑I. 5 3. 0X3. 5 6. 0微米，有厚度0.6 0. 9微米的薄莢膜，並通過在細胞上可單個或成對出芽，表現為兩極或多邊出芽；在YMA培養基上於25°C下培養19天，圓形細胞發生單個，成對或鏈狀的出芽，表現為多邊出芽；在YMA，PDA,或CMA培養基上劃線培養出的是粘稠的菌落呈粘液狀，光滑，整個菌落邊緣晶瑩透亮；培養I 3天菌落呈白色，I周后變為奶油色，3個星期以後成為橙色；在CMA或PDA培養基上半厭氧環境中生長超過15天會產生假菌絲，不生產芽分生孢子。
3.如權利要求2所述菌株的培養方法，其特徵在於所述YMA培養基是酵母菌形態瓊脂培養基，所述PDA培養基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，所述CMA培養基是麥芽浸膏瓊脂培養基。
全文摘要
本發明公開了一株擔子菌類的酵母菌，屬於隱球菌屬，是從印度南部的Guindy國家公園中的一棵肉桂科的熱帶陣雨樹上分離獲得，該菌株為IFM56699，菌株保藏號CCTCC NOM2011246，2011年7月10日在中國典型培養物保藏中心保藏。該菌株的培養方法是在YMA培養基上接入菌種，30℃條件下連續培養3天，細胞呈卵形有薄莢膜，單個出芽或是兩邊頂端出芽；在PDA培養基上30℃條件下培養6天，細胞呈檸檬形，有薄莢膜，單個或成對出芽，表現為兩極或多邊出芽；在YMA培養基上於25℃下培養19天，圓形細胞發生單個，成對或鏈狀的出芽，表現為多邊出芽。本發明對該菌株進行的多相分類研究、了解其生理和化學分類學特徵，本發明的培養方法為其利用提供了基礎。
文檔編號C12N1/16GK102816705SQ20121015193
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者康穎倩 申請人:康穎倩