利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法及其製品與流程

2023-08-09 03:53:11

本發明屬於獸用生物製品技術，具體涉及一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法及其製品。
背景技術：
：豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒引起一種急性傳染病。該傳染病遍布世界主要養豬國家。免疫接種是預防豬偽狂犬病的主要措施。我國目前生產豬偽狂犬病活疫苗所用的細胞未雞胚成纖維細胞和st細胞。由於每批雞胚原材料的差異，使得雞胚成纖維原代細胞的批間差異大；用雞胚成纖維細胞培養豬偽狂犬病病毒的病毒滴度不高，給疫苗產量、效力的提高帶來困難，而且細胞碎片與雜蛋白多，容易引起過敏反應。當前豬偽狂犬病活疫苗的生產主要是轉瓶細胞培養的傳統培養方式和用st細胞生物反應器培養，轉瓶培養方式是培養細胞貼壁生長於玻璃瓶的內壁上，雖然其操作技術要求較低和技術成熟穩定；但轉瓶培養技術已經使用數十年，與當前大規模動物疫苗生產不相適應，主要表現為：(1)轉瓶細胞培養，不能做到培養條件適時調整，無法保證細胞培養處於最佳條件，培養細胞密度小，培養病毒滴度低，動物的免疫效果較差；(2)轉瓶細胞培養，細胞碎片與雜蛋白多，疫苗的雜質多，導致免疫動物副反應大；(3)轉瓶細胞培養，細胞批間差異大，產品質量不均一、不穩定；(4)轉瓶細胞培養，生產效率低，生產成本高。中國專利申請(cn101695572a)公開了一種利用生物反應器生產偽狂犬病活疫苗的方法及其製品。將生物反應器和微載體經消毒後接種所述制苗用細胞，並加入細胞生長液進行培養。將所述生物反應器接種所述含偽狂犬病病毒弱毒種的維持液，繼續培養。接毒後2～3日收穫細胞培養毒液，並加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空乾燥得到偽狂犬病活疫苗。其中，其選擇制苗用的細胞係為豬睪丸(st)細胞系，豬腎(pk15)細胞系和豬腎(ibrs-2)細胞系。並且在細胞生長液和維持液中均使用犢牛血清。而上述所用的細胞系和犢牛血清，往往容易攜帶外源病毒且不同批次間產品質量不易控制，從而對生產豬偽狂犬病活疫苗有很大的影響。技術實現要素：為解決上述技術問題，本發明提供一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法。本發明所用制苗用細胞為vero細胞，並且vero細胞由無血清添加的細胞生長液培養得到，且在病毒培養過程中所用細胞維持液同樣也無血清添加，保證了產品的質量均一穩定和產量。本發明通過以下技術方案實現：一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，包括以下步驟：s1.用細胞生長液培養制苗用細胞，待細胞密度達1.0x106～1.5x106個/ml，接種到含有15～20g/l微載體的無菌生物反應器內培養；s2.待所述步驟s1制苗用細胞培養4～5天，密度達到1.2x106～1.5x106個/ml接種豬偽狂犬病病毒弱毒株，將反應器溫度調至36℃～38℃，並加入細胞維持液進行繁殖培養；s3.在所述步驟s2得到的細胞培養液中加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空乾燥得到豬偽狂犬病活疫苗。優選地，所述制苗用細胞為vero細胞，豬偽狂犬病病毒弱毒株為bartha-k61弱毒株。優選地，所述步驟s1中制苗用細胞由無血清添加的細胞生長液培養得到，所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎培養液80～90％v/v，賴氨酸1.0～1.5g/l，甘氨酸0.5～1.0g/l，苯異亮氨酸0.75～1.5g/l，精氨酸1.5～2.0g/l，蘇氨酸0.5～1.0g/l，纈氨酸0.5～1.5g/l，枸櫞酸10～15mg/l，尾加壓素ii0.35～0.75mg/l，苦丁冬青甙h0.15～0.5g/l，轉鐵蛋白3～8g/ml，5-羥色胺0.1～2.5mg/l，edta5～7mg/l，檸檬酸鐵1.5～3.5mg/l，皮質醇0.5～0.75mg/l，成纖維因子0.1～0.5mg/l，細胞纖維連結蛋白1.5～2.5mg/l。進一步，所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液88％v/v，賴氨酸1.25g/l，甘氨酸0.75g/l，苯異亮氨酸1.35g/l，精氨酸1.65g/l，蘇氨酸0.83g/l，纈氨酸1.20g/l，枸櫞酸12.5mg/l，尾加壓素ii0.55mg/l，苦丁冬青甙h0.45g/l，轉鐵蛋白6.75g/ml，5-羥色胺0.68mg/l，edta6.5mg/l，檸檬酸鐵2.45mg/l，皮質醇0.60mg/l，成纖維因子0.35mg/l，細胞纖維連結蛋白1.75mg/l。優選地，所述生物反應器為tidecell固定床微載體生物反應器。優選地，所述步驟s2中細胞維持液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液85～92％v/v，賴氨酸1.0～1.5g/l，甘氨酸0.5～1.0g/l，苯異亮氨酸0.75～1.5g/l，精氨酸1.5～2.0g/l，蘇氨酸0.5～1.0g/l，纈氨酸0.5～1.5g/l，枸櫞酸10～15mg/l，尾加壓素ii0.35～0.75mg/l，淫羊藿苷0.2～0.5g/l，轉鐵蛋白3～8g/ml，edta5～7mg/l，檸檬酸鐵1.5～3.5mg/l，皮質醇0.1～0.5mg/l，細胞纖維連結蛋白1.5～2.5mg/l。進一步，所述步驟s2中細胞維持液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液90％v/v，賴氨酸1.25g/l，甘氨酸0.75g/l，苯異亮氨酸1.25g/l，精氨酸1.85g/l，蘇氨酸0.65g/l，纈氨酸1.35g/l，枸櫞酸12.5mg/l，尾加壓素ii0.50mg/l，淫羊藿苷0.35g/l，轉鐵蛋白6.5g/ml，edta6.5mg/l，檸檬酸鐵2.5mg/l，皮質醇0.25mg/l，細胞纖維連結蛋白2.25mg/l。優選地，所述步驟s3穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、l-穀氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和檸檬酸鈉5％w/v。本發明使用vero細胞為宿主來製備豬偽狂犬病病毒活疫苗，並使用無血清細胞生長液和細胞維持液進行培養，免除了外源病毒感染的風險，並剔除了血清對病毒生長的抑制。與現有技術相比，本發明具有以下技術優勢：(1)無血清添加細胞生長液和維持液能夠促進vero細胞的增殖和偽狂犬病病毒的大量繁殖，同時避免了外源病毒的感染；(2)利用生物反應器大規模高密度培養，使vero細胞密度大大增加，病毒濃度也極大提高；(3)獲得的豬偽狂犬病毒活疫苗效價高，性質穩定。具體實施方式下面將結合實施例進一步的詳細說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，並非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護範圍以所附權利要求書記載的內容為準。實施例1一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，包括以下步驟：s1.用無血清添加的細胞生長液培養制苗用vero細胞，待細胞密度達1.5x106個/ml，接種到含有18g/l微載體的無菌tidecell固定床微載體生物反應器內培養；所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液88％v/v，賴氨酸1.25g/l，甘氨酸0.75g/l，苯異亮氨酸1.35g/l，精氨酸1.65g/l，蘇氨酸0.83g/l，纈氨酸1.20g/l，枸櫞酸12.5mg/l，尾加壓素ii0.55mg/l，苦丁冬青甙h0.45g/l，轉鐵蛋白6.75g/ml，5-羥色胺0.68mg/l，edta6.5mg/l，檸檬酸鐵2.45mg/l，皮質醇0.60mg/l，成纖維因子0.35mg/l，細胞纖維連結蛋白1.75mg/l；s2.待所述步驟s1制苗用細胞培養4天，密度達到1.5x106個/ml接種bartha-k61弱毒株，將反應器溫度調至37℃，並加入細胞維持液進行繁殖培養；所述細胞維持液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液90％v/v，賴氨酸1.25g/l，甘氨酸0.75g/l，苯異亮氨酸1.25g/l，精氨酸1.85g/l，蘇氨酸0.65g/l，纈氨酸1.35g/l，枸櫞酸12.5mg/l，尾加壓素ii0.50mg/l，淫羊藿苷0.35g/l，轉鐵蛋白6.5g/ml，edta6.5mg/l，檸檬酸鐵2.5mg/l，皮質醇0.25mg/l，細胞纖維連結蛋白2.25mg/l；s3.在所述步驟s2得到的細胞培養液中加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空乾燥得到豬偽狂犬病活疫苗，所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、l-穀氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和檸檬酸鈉5％w/v。實施例2一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，包括以下步驟：s1.用無血清添加的細胞生長液培養制苗用vero細胞，待細胞密度達1.0x106個/ml，接種到含有15g/l微載體的無菌tidecell固定床微載體生物反應器內培養；所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎培養液80％v/v，賴氨酸1.0g/l，甘氨酸0.5g/l，苯異亮氨酸0.75g/l，精氨酸1.5g/l，蘇氨酸0.5g/l，纈氨酸0.5g/l，枸櫞酸10mg/l，尾加壓素ii0.35mg/l，苦丁冬青甙h0.15g/l，轉鐵蛋白3g/ml，5-羥色胺0.1mg/l，edta5mg/l，檸檬酸鐵1.5～mg/l，皮質醇0.5mg/l，成纖維因子0.1mg/l，細胞纖維連結蛋白1.5mg/l；s2.待所述步驟s1制苗用細胞培養5天，密度達到1.5x106個/ml接種bartha-k61弱毒株，將反應器溫度調至38℃，並加入細胞維持液進行繁殖培養；所述細胞維持液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液92％v/v，賴氨酸1.5g/l，甘氨酸1.0g/l，苯異亮氨酸1.5g/l，精氨酸2.0g/l，蘇氨酸1.0g/l，纈氨酸1.5g/l，枸櫞酸15mg/l，尾加壓素ii0.75mg/l，淫羊藿苷0.5g/l，轉鐵蛋白8g/ml，edta7mg/l，檸檬酸鐵3.5mg/l，皮質醇0.5mg/l，細胞纖維連結蛋白2.5mg/l；s3.在所述步驟s2得到的細胞培養液中加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空乾燥得到豬偽狂犬病活疫苗；所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、l-穀氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和檸檬酸鈉5％w/v。實施例3一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法，包括以下步驟：s1.用無血清添加的細胞生長液培養制苗用vero細胞，待細胞密度達1.5x106個/ml，接種到含有20g/l微載體的無菌tidecell固定床微載體生物反應器內培養；所述無血清添加的細胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem基礎培養液90％v/v，賴氨酸1.5g/l，甘氨酸1.0g/l，苯異亮氨酸1.5g/l，精氨酸2.0g/l，蘇氨酸1.0g/l，纈氨酸1.5g/l，枸櫞酸15mg/l，尾加壓素ii0.75mg/l，苦丁冬青甙h0.5g/l，轉鐵蛋白8g/ml，5-羥色胺2.5mg/l，edta7mg/l，檸檬酸鐵3.5mg/l，皮質醇0.75mg/l，成纖維因子0.5mg/l，細胞纖維連結蛋白2.5mg/l；s2.待所述步驟s1制苗用細胞培養4天，密度達到1.5x106個/ml接種bartha-k61弱毒株，將反應器溫度調至36℃，並加入細胞維持液進行繁殖培養；所述細胞維持液由以下成分及其重量份組成：dmem基礎培養液85％v/v，賴氨酸1.0g/l，甘氨酸0.5g/l，苯異亮氨酸0.75g/l，精氨酸1.5g/l，蘇氨酸0.5g/l，纈氨酸0.5g/l，枸櫞酸10mg/l，尾加壓素ii0.35mg/l，淫羊藿苷0.2g/l，轉鐵蛋白3g/ml，edta5mg/l，檸檬酸鐵1.5mg/l，皮質醇0.1mg/l，細胞纖維連結蛋白1.5mg/l。s3.在所述步驟s2得到的細胞培養液中加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空乾燥得到豬偽狂犬病活疫苗；所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、l-穀氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和檸檬酸鈉5％w/v。對比例1一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法與實施例1的區別在於所述步驟s1無血清添加的細胞生長液中不含有尾加壓素ii和苦丁冬青甙h，其它步驟均與實施例1類似。對比例2一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法與實施例1的區別在於所述步驟s1無血清添加的細胞生長液和s2無血清添加的細胞細胞維持液液中用抗菌素替換淫羊藿苷，其它步驟均與實施例1類似。對比例3一種利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法所述利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法與實施例1的區別在於所述步驟s1細胞生長液由88％體積百分比dmem培養液和12％體積百分比的犢牛血清組成；步驟s2中細胞細胞維持液由90％體積百分比dmem培養液和10％體積百分比的犢牛血清組成，其它步驟均與實施例1類似。試驗例1病毒效價檢測以vero細胞為傳代細胞，分別按照實施例1-3及對比例1-3用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法製備豬偽狂犬病病毒液b1、b2、b3、b4、b5和b6，按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)附錄15、19頁進行檢驗，結果證明無細菌、黴菌、支原體生長；並對病毒液進行效價測定，具體結果如表1所示。表1不同病毒液效價毒液效價(tcid50/ml)b1108.1b2107.8b3108.0b4107.4b5107.3b6108.2由表1可知，利用實施例1-3生產方法得到的病毒效價與對比例3製備得到的效價相近，說明本發明無血清添加的細胞生長液和細胞維持液能夠有效促進vero細胞增殖、病毒的繁殖及毒液分泌。實施例1病毒效價高於對比例1和對比例2，說明本發明無血清添加的細胞生長液中添加尾加壓素ii和苦丁冬青甙h，以及在無血清添加的細胞維持液中添加淫羊藿苷，有利於病毒繁殖和病毒液分泌。試驗例2疫苗成品檢驗取實施例1-3及對比例1-3製備得到的疫苗，按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行成品檢驗，每頭份疫苗含病毒分別為108tcid50、107.6tcid50、107.8tcid50、106.8tcid50、106.5tcid50、107.7tcid50，符合「偽狂犬病活疫苗」的規定，每頭份疫苗含病毒≥106tcid50。試驗例3疫苗的穩定性試驗將試驗例2中製備得到的每份疫苗分為兩份分別置於4℃條件下保存，不同時間取樣，測定病毒含量，分別如表2所示。表24℃條件下保存期試驗由表2數據可以看出本發明實施例1-3製備得到的豬偽狂犬活疫苗在4℃條件下，能夠保持15天，其效價下降不超過0.5個滴度，與對比例3製備得到的疫苗穩定性相當，這說明本發明利用生物反應器生產豬偽狂犬病活疫苗的方法製備得到的疫苗性質穩定。當前第1頁12