一種鯉春病毒血症病毒dna疫苗及其製備方法

2023-08-09 11:29:16 4

專利名稱：：一種鯉春病毒血症病毒dna疫苗及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及鯉春病毒血症病毒的DNA疫苗及製備技術。
背景技術：
：將克隆化基因插入合適載體後導入大腸桿菌用於表達大量蛋白質的方法稱為原核表達。大腸桿菌用於表達重組蛋白有以下特點大腸桿菌生長速度快、操作容易且易於控制；成本低並可高密度培養；宿主菌的遺傳背景清楚，可根據不同目的對其進行改造；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，表達一般程序如下獲得目的基因一準備表達載體一將目的基因插入表達載體中(測序驗證)一轉化表達宿主菌一誘導靶蛋白的表達一表達蛋白的分析一擴增、純化、進一歩檢DNA疫苗是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質粒DNA。它可經一定途徑進入動物體內，被動物宿主細胞攝取後能轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能夠刺激機體產生非特異性和特異性兩種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。DNA疫苗的基本設計並不複雜。通常是將我們想要預防的病原微生物的某個基因，利用適當的載體送入體內既可。DNA疫苗最常用的設計是利用雙股環狀的質體來當作載體，將微生物具有抗原性的基因克隆入質體中。為使該質體可以大量表現該基因，產生大量的蛋白質產物，該質體必須具有一個很強的啟動子。然後將此含有病原微生物DNA的質體，溶於生理鹽水或其它的溶液，然後以肌肉注射等方式送入肌肉細胞內。肌肉注射以後，肌細胞會攝取此質體帶入細胞內，並進行轉錄及轉譯的工作，表達出抗原蛋白進而誘導免疫反應。
發明內容本發明的目的在於針對鯉春病毒血症病毒治療上存在的不足，提供一種能有效抵抗鯉春病毒血症病毒的DNA疫苗。本發明的另一個目的是提供上述DNA疫苗的製備方法。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案-一種鯉春病毒血症病毒疫苗DNA疫苗，由SVCVG蛋白全長基因和原核表達載體pET32a(+)質粒構成。上述鯉春病毒血症病毒疫苗DNA疫苗的製備方法，包括如下歩驟(1)SVCVG蛋白全長基因的克隆；(2)SVCVG基因的原核表達及抗體製備；(3)SVCVG基因DNA疫苗的構建。步驟(1)所述的SVCVG蛋白全長基因的克隆引物序列為(方框中序列為酶切位點)SVC-Gly-Full-F:5'-CC(^GGTACC^AAACTAACAGACATCATGT-3'I位點)SVC-Gly-Full-R:5'-GCC|TCTAG^ACTCTCAAACTAAAGACCGCA-3'位點)步驟(2)所述的SVCVG基因的原核表達引物序列為(方框中序列為酶切位點)SVC-Gly-Full-F:5'-CGJGAATTC|CAGCCTGTAATTCAGCCATTT-3'(￡coRI位點)SVC-Gly-Full-R:5'-GCG^AGCtI]CAGCCATCTAACTCCCAGTCGTC-3'(歷"dIII位點)步驟(2)所述的SVCVG基因的原核表達的反應溫度為37'C。步驟(2)所述的SVCVG基因的原核表達的誘導條件為0.4mMIPTG，5h。步驟(3)所述的SVCVG基因DNA疫苗的構建引物序列為pSVCV-Sig,F:CGGGTACCAAAACTAACAGACATCATGGCTpSVCV隱Sig,R:CGTCTAGAATTATAGACTAGTTCCCCACCCACTGpSVCV-Tr纖-F:CAGGTACCATGGCCATATTTGTTCCATCCpSVCV-T腦，R:CGTCTAGACTCAAACTAAAGACCGCATTTCGpSVCV-Null-F:CAGGTACCATGGCCATATTTGTTCCATCCpSVCV-Null-R:CGTCTAGAATTATAGACTAGTTCCCCACCCACTG用於評估SVCVDNA疫苗免疫效果的檢驗用引物序列為D-SVC-Gly-F:5'隱TCTGTTCATTTGGAGCCG-3'D陽SVC陽Gly-R:5'-GGATTTCATCGTCGTCAT-3'評估SVCVDNA疫苗免疫效果的特異擴增序列為SVCVG蛋白第451位核苷酸到1303位核苷酸的853bp的序列。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明創造性地將DNA疫苗技術應用於鯉春病毒血症的防治。與其他疫苗相比，DNA疫苗能同時誘導機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答，同時具有高效、安全、便於貯運及易於大量生產等優點。圖1為質粒pcDNA3.0物理圖譜；圖2A為pET32a(+)質粒圖譜；圖2B為pET32a(+)質粒多克隆位點附近的序列；圖3為SVCV糖蛋白基因PCR擴增電泳結果；圖4為SVCVG基因原核表達序列的PCR擴增電泳結果；圖5為重組質粒pET-SVCV-Gly在大腸桿菌中誘導表達的SDS-PAGE分析；圖6為重組菌誘導不同時間不同IPTG濃度的SDS-PAGE分析；圖7為抗血清的Western-blot分析；圖8為SVCV糖蛋白基因片段PCR擴增電泳結果；圖9為RT-PCR產物跑膠結果；圖IO為轉染FHM細胞的RT-PCR檢測結果；圖11為魚體注射部位(引自LorenzenNetal.,2002);圖12為攻毒實驗結果。其中，圖3中，M:Marker-DL2000;1:SVCVG基因的PCR產物；2:RT陰性對照；2:PCR陰性對照。圖4中，M:Marker-DL2000;1:SVCVG基因原核表達序列的PCR產物；2:PCR陰性對照。圖5中，M:蛋白質Marker;1:37'C誘導的重組菌超聲後上清；2:37'C誘導的重組菌超聲後沉澱；3:未經誘導的pET-SVCV-Gly重組菌全菌蛋白。圖6中，M:蛋白質Marker;1-6分別為O.OlmM、0.05mM、O.lmM、0.4mM、lmM和OmM誘導的全菌蛋白；7-12:分別為pET-SVCV-Gly誘導5h，4h，3h，2h，lh和0h。圖7中，M:預染蛋白質Marker;+:誘導後的全菌蛋白；-:未誘導的全菌蛋白。圖8中，M:Marker-DL2000;1:pSVCV-Sig.引物對擴增產物；2.PCR陰性對照；3.pSVCV-Trans.引物對擴增產物；4.PCR陰性對照；5.pSVCV-Null引物對擴增產物；6.PCR陰性對照。圖9中，M:Marker-DL15,000;1、3、5:提取的斑馬魚RNART-PCR結果；2、4、6:PCR陰性對照；7:RT陰性對照；+:陽性對照。圖10中，M:Marker-DL2,000;1~5:分別為轉染空載pcDNA3.0，重組質粒pSVCV-Sig.、pSVCV-Trans.、pSVCV-Null和pSVCV-Full的FHM細胞總RNART-PCR結果；6:RT陰性對照；7:PCR陰性對照；+:陽性對照。具體實施例方式實施例lSVCVG蛋白全長基因的克隆1.1材料與方法1.1.1材料l丄l.l病毒和細胞鯉春病毒血症病毒(SVCV)Al株由本實驗室分離，保存於-8(TC。草魚卵巢細胞系(Grasscarpovaries,CO)由本實驗室傳代培養保存。1丄1.2細胞培養相關試劑抗生素青黴素(80萬單位/瓶)和鏈黴素(100萬單位/瓶)用滅菌雙蒸水融解，0.22ixm濾膜過濾除菌，配成終濃度各為10,000U/mL的雙抗混合液。培養基M199(Medium199，GIBCO)配製方法見說明書。0.22Pm濾膜過濾除菌後，按比例加入雙抗至終濃度各為IOOU/mL。胎牛血清(fetalbovineserum，FBS):Gibco。0.05%胰蛋白酶(含EDTA):GIBCO，使用前-20。C保存，開瓶後4。C保存。1丄1.3細菌培養相關試劑LB液體培養基蛋白腖(trytone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl10g，加800mL蒸餾水，用5MNaOH調節pH至7.27.4，定容至1000mL，分裝，高壓滅菌，4'C保存。LB固體培養基在LB液體培養基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%，高壓滅菌，倒平板後4'C保存。氨苄青黴素儲存液購自MBCHEM，滅菌水溶解後0.22pm濾膜過濾除菌。小份分裝後-2(TC保存。貯液濃度為100mg/mL。使用時l:1000加到培養基中。1.1.1.4質粒載體和受體菌株質粒載體pcDNA3.0(圖1)。受體菌大腸桿菌菌株DH5a，基因型F-/flcZ4il^5zl(7acZZ4-arg"e<iv47rec^J7(^A:-，mA:+」swp五44義-決/7gy^4P6_p/zc^4。1.1丄5酶類及其他試劑PyrobestTMDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、MMLV(RNaseH，反轉錄酶、RNase抑制劑、DL-2000及DL-15，000均購自TaKaRa公司。Trizol試劑(Invitrogen):4。C保存；苯酚4。C保存；氯仿、異丙醇、無水乙醇，常溫避光保存。隨機引物(N)6:申能博彩生物公司。DNA凝膠回收試劑盒及PCR產物回收試劑盒購自TaKaRa公司。H.Q.&Q.質粒微量提取試劑盒購自安徽優晶生物工程有限公司。0.1M氯化鈣1.47gCaCl2*2H20溶於水後定容至100mL，0.22pm濾膜過濾，4'C保存。1.1.2方法1丄2.1總RNA的提取1丄2丄1病毒的增殖SVCV感染其敏感細胞CO，25"C培養，待30%~40%的細胞出現細胞病變效應(CPE)時，棄原液，加2mL冰冷的DEPC處理PBS輕輕地洗一次，然後用lmLTRIzol反覆吹打，直至細胞完全脫落(約10min)，將細胞懸液轉移入1.5mL的離心管子，用於病毒RNA的提取。1.1.2.1.2病毒RNA的提取在RNA相關的實驗過程中，所有離心管、槍頭及水均用DEPC水浸泡處理過並經高壓滅菌，移液器為RNA專用。操作方法按試劑盒說明書進行，簡述如下1)加Trizol的病毒懸液，15-30'C靜置5min，徹底裂解病毒蛋白；2)加0.2mL氯仿，用力搖動Eppdorf管15s，15-30。C靜置2-3min;3)2-8。C不超過12000g離心15min;4)小心取出上層水相到另一乾淨的Eppendorf管中，加等體積的異丙醇混勻，15-30。C靜置10min;5)2-8。C不超過12000g離心10min;6)lmL75X預冷的乙醇清洗兩次，2-8。C不超過7500g離心5min;7)空氣中乾燥約10min，注意不要使沉澱過分乾燥，否則，RNA不易溶解；8)力口20pLDEPC處理水，-80匸保存備用。1.1.2.2引物設計及目的片段的PCR擴增1.1.2.2.1引物設計根據SVCVAl株(accessionnumber:DQ097384)G基因序列設計引物。為方便後續操作，在5'端引入酶切位點，並在5'端加3個保護鹼基。1丄2.2.2目的片段的PCR擴增1.1.2.2.2.1cDNA第一鏈的合成cDNA第一鏈的合成按照說明書進行，具體步驟如下1、在微量離心管中配置下列模板RNA/引物混合液，全量6pL。表ltableseeoriginaldocumentpage7*TotalRNA的使用量一般為1ng~l嗎；mRNA的使用量一般為lOpg~l嗎。2、將以上成分混勻，瞬離，65。C保溫5分鐘後迅速在冰上急冷2min以上。3、離心數秒鐘使模板RNA/弓I物的變性溶液聚集於微量離心管底部。4、在上述微量離心管中配置下列反轉錄反應液。tableseeoriginaldocumentpage7dNTPMixture(10mM)0.5RnaseInhibitor(10U/jxL)0.5Retra(M-MLV)(100U)0.5RNasefreedH2C)_upto105、37'C保溫lh。6、70'C保溫10min後冰上冷卻，得到的cDNA溶液直接用於PCR擴增。1.1.2.2.2.2目的基因的PCR擴增在微量離心管按下述體系配置反應液:表3tableseeoriginaldocumentpage8表4tableseeoriginaldocumentpage8將PCR產物克隆到pcDNA3.0載體，構建重組質粒pcDNA-SVC-Gly-Full載體(為方便書寫，記為pSVCV-Full)。1.1.2.3.1PCR產物的純化與酶切1.1.2.3.1.1PCR產物的純化PCR產物用1%瓊脂糖/溴化乙錠凝膠進行電泳，條帶單一，用TaKaRaDNAFragmentPurificationKit純化目的DNA片段。操作方法簡述如下①PCR反應液中加入3倍體積的DBBuffer,混勻；②將SpinColumn安置於CollectionTube上，上述溶液轉入SpinColumn,12,000rpm離心1min，棄濾液；③SpinColumn放回原CollectionTube中，加入500pLRinseA，12,000rpm離心30S，棄濾液；④SpinColumn放回原CollectionTube中，加入700pLRinseB，12,000rpm離心30s，棄濾液；⑤重複操作步驟④；⑥將SpinColumn置於一潔淨的1.5mL離心管中，在silica膜中央加入25pL30^L滅菌雙蒸水或ElutionBuffer,室溫靜置lmin。12000rpm離心lmin洗脫DNA。.2(TC保存。1.1.2.3.1.2PCR產物的酶切根據純化PCR產物的濃度(電泳檢測或測OD260nm的吸收值計算)，用@wI和力al雙酶切。酶切體系總體積為50uL，按以下配方配製反應體系表5滅菌雙蒸水補足至50yL，37'C水浴酶切3h，酶切片段回收用試劑盒，方法見1丄2.3丄2，純化產物-2(TC保存備用。1.1.2.3.2質粒DNA的提取、酶切及純化1.1.2.3.2.1質粒DNA的提取劃線接種帶pcDNA3.0質粒的大腸桿菌，隔日挑單克隆於裝有5mLLB/Amp液體培養基的培養管中，37°C200rpm搖床培養12h16h。用H.Q.&Q.質粒微量提取試劑盒提取質粒，其步驟如下①取L5mL5mL過夜培養的菌液，10,000g離心lmin，最後一步棄盡培養液；②力n250pLBufferZL-I/RnaseA(4'C保存)完全懸浮細菌沉澱；③往重懸液中加250pLBufferZL-II，溫和但充分地上下翻轉混合46次，至溶液澄清，此步驟不宜超過5min;④加350(xLBufferZL-III，溫和地上下顛倒離心管數次，直至形成白色絮狀沉澱，10,000g離心10min;⑤將一乾淨的Mu-Pu質粒微量分離柱置於2-mLMicrofligeTube上，將步驟中的離心上清移入Mu-Pu質粒微量分離柱中，10,000g離心lmin，棄濾液；⑥將Mu-Pu質粒微量分離柱放回原2-mLMicrofogeTube中，加入500pLBufferZL，IO，OOOg離心lmin，棄濾液；PCR純化產物10XMBuffer，I勘I15pL5(jL2|jL2pL⑦將Mu-Pu質粒微量分離柱放回原2-mLMicrofogeTube中，加入720pLDNA洗滌液，10,000g離心lmin，棄濾液；⑧重複操作歩驟⑦；⑨將Mu-Pu質粒微量分離柱放回原2-mLMicrofogeTube中，10,000g離心lmin;⑩將Mu-Pu質粒微量分離柱置於一潔淨的1.5mL離心管中，在silica膜中央加入50pL10(^L滅菌雙蒸水或ElutionBuffer,室溫靜置2min，10,000g離心lmin洗脫質粒DNA，-20匸保存。1.1.2.3.2.2質粒DNA的酶切及純化根據所提取質粒DNA的濃度(電泳檢測或測OD260nm的吸收值計算)，使用《p"I和J^flI進行雙酶切。酶切體系總體積為5(^L，具體操作參照限制性酶的說明書。酶切於37'C水浴消化4h6h，其間取3pL進行瓊脂糖凝膠電泳以監測酶切程度。酶切片段回收用試劑盒(TaKaRaAgaroseGelDNAPurifocationKit)，操作方法簡述如下①在紫外燈下切出含目的DNA的凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體，稱重，按lmg二lpL換算凝膠體積；②按3倍凝膠重量加入DR-IBuffer;③於75。C加熱，每隔lmin2min振蕩混勻，直至凝膠塊完全融化(6min10min);加入DR-IBuffer量的二分之一體積量DR-IIBuffer,混合均勻；⑤將SpinColumn置於2mLCollectionTube中，將步驟④中的混合液移入SpinColumn中，12,000rpm離心lmin，棄濾液；將SpinColumn放回原2mLCollectionTube中，加入500pLRinseA，12,000rp離心30s，棄濾液；⑦將SpinColumn放回原2mLCollectionTube中，加入700pL已加無水乙醇的RinseB，12,000rpm離心30s。棄濾液；⑧重複操作步驟⑦；⑨將SpinColumn放回原2mLCollectionTube中，12000rpm離心lmin;⑩將SpinColumn置於一潔淨的1.5mL離心管中，在silica膜中央加入25pL30pL滅菌雙蒸水或Elutionbuffer,室溫靜置lmin。12000rpm離心lmin洗脫DNA。-2(TC保存。1丄2.4感受態細胞的製備採用CaCV法製備大腸桿菌感受態細胞。劃線接種受體菌，隔日挑單克隆於裝有LB液體培養基的試管中，37°C、200rpm震蕩培養過夜；次日按1:100體積比接種於新鮮LB液體培養基中，37°C、200rpm震蕩培養約3h，至0060值0.6左右；菌液冰浴30min，然後於10,000rpm離心lmin，棄盡上清，加原體積二分之一的預冷的0.1MCaCl2重懸沉澱，冰浴20min後10000rpm離心lmin，棄盡上清，最後以原體積二十五分之一的預冷的0.1MCaCl2重懸沉澱，加甘油至終濃度為15%，分裝成若干管，每管1004，-S(TC保存備用。1丄2.5連接與轉化1丄2.5.1DNA片段和載體的連接在微型離心管中製備下列連接反應液_表610XT4DNALigaseBufferDNA片段載體DNAT4DNALigaseddH2Q_16"C下連接過夜。Ll.2.5.2連接產物的轉化將5^L連接產物加入100pL感受態中，混勻，冰浴30min;42。C水浴熱激90s，然後馬上冰浴5min。加入新鮮LB液體培養基至lmL,搖床37°C200rpm復甦lh。室溫8,000rpm離心lmin，吸走lmL上清，剩餘lOOpL混勻，塗布於LB/Amp平板。靜置平板30min40min後倒置於37'C培養箱培養12h16h,4'C存放。1.1.2.6陽性克隆的篩選與鑑定從平板上挑取菌落於LB/Amp液體培養基中，37°C、200rpm震蕩培養12h16h,按前述PCR體系進行PCR擴增，取5pLPCR產物電泳檢測。菌液PCR篩選出來的陽性重組子搖菌提取質粒，《pI和J^aI雙酶切進一步鑑定。據菌液PCR和酶切結果將篩選出的陽性克隆送測序，測序工作由上海英駿生物技術有限公司負責完成。1.2結果分析根據SVCVAl株(accessionnumber:DQ09738勺G基因序列設計引物。為方便後續操作，在5'端引入酶切位點，並在5'端加3個保護鹼基。引物在賽百勝生物工程公司合成，糖蛋白基因經PCR擴增後的預期序列大小為1568bp。序列如下(方框中序列為酶切位點)2^約0.3pmol約0.03pmol1(iLupto20fxLSVC-Gly-Full-F:5'隱CC(^GGTACC^AAACTAACAGACATCATGT-3(一I位點)SVC-Gly-Full-R:5'-GCC|TCTAGA|ACTCTCAAACTAAAGACCGCA-3'位點)根據選定的引物成功地擴增出了SVCVAl株G基因的全長，該區域共1568bp(圖3)。實施例2SVCVG基因的原核表達及抗體製備2.1材料與方法2丄1材料2丄1.1質粒載體和受體菌株質粒載體原核表達載體pET-32a(+)(圖2A,圖2B)。受體菌大腸桿菌菌株DH5a，基因型見前；大腸桿菌菌株BL21(DE3)，基因型F-om;rfcAB(rB-mB-)ga/fDE3)。2丄1.2酶類及其他試劑限制性核酸內切酶購自TaKaRa公司。其他工具酶及試劑盒同上。2.1.1.3蛋白電泳所用溶液30%丙烯醯胺貯存液將29g丙烯醯胺和lgN,N-亞甲雙丙烯醯胺溶於80mL雙蒸水中，37r溶解，定容到100mL，濾紙過濾後4t:避光保存。4X分離膠緩衝液(pH8.8):18.15gTris鹼溶解於80mL雙蒸水中，用濃鹽酸調節至pH8.8，加0.4gSDS，定容至100mL。4X濃縮膠緩衝液(pH6.8):12.11gTris鹼溶解於80mL雙蒸水中，用濃鹽酸調節至pH6.8，加0.4gSDS，定容至100mL。5X電泳緩衝液(pH8.3):15.1gTris鹼，94g甘氨酸，溶於800ml雙蒸水中，調節pH至8.3，加入50ml10%SDS，定容至1000mL。2X上樣緩衝液100mMTris-Cl(pH6.8)，20%(V/V)甘油，200mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.2%溴酚藍，4。/。SDS(電泳級)。10%過硫酸胺(Ap):O.lg過硫酸胺溶於lmL去離子水，4X:避光保存。染色液:2.5g考馬斯亮藍R-250溶解於450mL甲醇、100mL冰醋酸和450mL去離子水中配成1000mL,充分溶解，濾紙過濾後使用。脫色液甲醇、冰乙酸和雙蒸水按照3:1:6的比例配製而成。濃縮膠(5%)及各種濃度分離膠(12%,15%)的配方參照《分子克隆實驗指南》。2.1.1.4處理包涵體的試劑裂解緩衝液50mmol/LTris'Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl;洗滌液A:在裂解緩衝液中加入TritonX-100至終濃度為0.5%;洗滌液B:0.1mmol/LTris*Cl(pH8.0)，1mol/L尿素，調pH至8.0;洗滌液C:0.1mmol/LTris*Cl(pH8.0)，2mol/L尿素，調pH至8.0;洗滌液D:0.1mmol/LTris*Cl(pH8.0)，4mol/L尿素，調pH至8.0。2.1.1.5Western雜交所用溶液和試劑Western-Blot轉移緩衝液2.9g甘氨酸、5.8gTris鹼、0.37gSDS、200mL甲醇，加水至總量為1L。0.1MTBS:32g氯化鈉、0.8g氯化鉀、12gTris鹼，加800mL雙蒸水溶解，調節pH至7.4，定容至1000mL，高壓滅菌後室溫保存。0.1MTTBS:0.1MTBS中加入TWEEN20至終濃度為0.1%。封閉液含5M脫脂奶粉的0.1MTTBS。脫脂奶粉完全溶解後，過濾，4'C保存。DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。HRP-標記的羊抗鼠IgG:Boster公司產品。硝酸纖維素膜(NC):Pall-Gelman公司產品。2丄1.6免疫用小鼠和免疫佐劑免疫用7周齡雄性BALB/cA小鼠，購自中山大學北校區動物實驗中心。完全弗氏佐劑和不完全弗式佐劑為Sigma公司產品。2丄2方法2丄2.1重組質粒的構建重組質粒的構建策略簡敘如下。即以構建好的全長pSVCV-Full質粒為模板，用f寺異引物擴增獲得目的片段，與&oRI/歷^III雙酶切的載體連接，得到得重組表達質粒命名為pET-SVCV-Gly。2丄2丄1引物設計及目的片段的PCR擴增2丄2丄1.1弓l物設計根據構建的pSVCV-Full克隆的序列設計引物。設計合成了分別含五coRI、///7^m兩個酶切位點的SVCVG基因原核表達用引物，且在3'、5'端加2~3個保護鹼基，擴增N端約lOOObp序列(去信號肽)。引物在上海英駿生物技術有限公司合成，經PCR擴增後的預期序列大小為1072bp。2.1.2.1.1.2目的片段的PCR擴增方法見1,1.2.2.2.2。2.1.2.1.2DNA片段與pET-32a(+)載體的連接PCR產物的酶切純化方法見1丄2.3.1;質粒的提取、酶切及純化方法見1.1.2.3.2。雙酶切後的質粒載體pET-32a(+)與雙酶切後的PCR產物連接。根據目的基因和線性化質粒DNA的濃度及分子量大小，在兩者摩爾數比h3~10的連接體系中以T4Ligase連接。連接總體積為10pL。16'C連接過夜，-2(TC保存備用。2丄2丄3連接產物轉化入DH5a並篩選陽性克隆方法見U.2.5.2及1丄2.6。2.1.2.2重組質粒轉入表達載體BL21(DE3)BL21(DE3)感受態的製作方法見1丄2.4。pET-SVCV-Gly重組質粒轉化100pL感受態細胞中加入0.5-lpL質粒，混勻，冰浴30min;42。C水浴熱激90s，然後馬上冰浴5min。加入新鮮LB液體培養基lmL，搖床37°C200rpm復甦10min。室溫8,000rpm離心lmin，吸走lmL上清，剩餘100pL混勻，塗布於LB/Amp平板上。靜置平板5min10min,然後倒置於37。C培養箱培養12h16h,4。C存放。2.1.2.3重組蛋白的誘導表達2丄2.3.1重組質粒pET-SVCV-Gly在大腸桿菌中的誘導表達及表達條件摸索2丄2.3.1.1重組質粒pET-SVCV-Gly在大腸桿菌中的誘導表達從轉化平板中挑單菌落接種至!l35mL含Amp的LB/Amp培養基中，37°C,200rpm振搖過夜，次日按l:lOO的比例接種到新鮮的含Amp的液體培養基中，於37。C培養至OD600約為0.6，加IPTG至終濃度為lmM，37'C繼續震搖培養5h後10,000rpm離心lmin收菌。超聲破碎，上清液和沉澱分別進行SDS-PAGE分析。2丄23丄2重組質粒pET-SVCV-Gly在大腸桿菌中的表達條件摸索在其他條件不變的情況下(參考步驟2丄2,2丄1)，在不同的誘導時間lh,2h,3h,4h，5h分別離心收集菌體，進行SDS-PAGE分析。在其他條件不變的情況下(參考步驟2丄2.2丄1)，在不同的IPTG濃度O.OlmM、0.05mM、O.lmM、0.4mM禾卩lmM下誘導，分別離心收集菌體，進行SDS-PAGE分析。2.1.2.3.2菌體的超聲破碎離心收集的菌體加十分之一體積的PBS重懸，在冰浴中進行超聲波破碎至菌液變澄清為止，超聲波處理的條件是300W，5s超聲破碎，5s間歇。4°C，12000g，離心15min;收集上清液，沉澱用與上清液等體積的1XPBS重溶，—20'C保存。2.1.2.3.3SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在BIO-RAD小型蛋白電泳裝置上進行恆壓電泳，所用的分離膠濃度為12%，濃縮膠為5%。以45V電壓跑濃縮膠，100V跑分離膠。至溴酚藍跑至膠底時關閉電源，小心取下膠塊，染色液染色30min以上，脫色液脫色至背景乾淨。觀察蛋白帶型，拍照記錄。2.1.2.5重組蛋白多克隆抗體的製備2.1.2.5.1免疫抗原的製備2.1.2.5.1.1包涵體的粗提和純化將含有重組質粒pET-SVCV-Gly的表達菌株接種於100mLLB/Amp中大量誘導表達，離心收集誘導表達後的菌體，稱取溼重，並用每克溼重5mLPBS的比例重懸菌體，超聲使細胞裂解(方法見2丄2.2.2)，離心收集沉澱沉澱即為粗提的包涵體。用包涵體裂解緩衝液使包涵體充分溶解，不易溶解時可藉助超聲波處理或勻漿法等使之溶解，4'C，12000g，離心15分鐘收集沉澱。依次用包涵體洗滌液A、B、C、D洗滌包涵體各一次，再用1XPBS洗滌一次，離心收集包涵體，加入適量lXPBS溶解，取IO^L進行SDS-PAGE電泳分析。2.1.2.5.1.2重組蛋白的切膠純化純化後的包涵體跑SDS-PAGE膠，將SDS-PAGE膠上含有目的蛋白的條帶割下，經1XPBS漂洗後，加入適量1XPBS用研缽充分研磨成漿與等體積的完全佐劑或不完全佐劑混勻免疫動物。2.1.2.5.2免疫動物取7周齡雄性BALB/c小鼠八隻，七隻注射用SDS-PAGE膠純化的蛋白製備的抗原，一隻注射PBS/佐劑作為對照。注射採用皮下多點注射，每隔七天免疫一次，共免疫四次。首次注射的抗原為重組蛋白或PBS與完全佐劑的混勻物，之後三次注射的抗原均為重組蛋白或PBS與不完全佐劑的混勻物。2丄2.5.3抗血清的製備在第四次免疫動物後的第七天取血，轉入1.5mL離心管中，室溫下或37。C下放置30分鐘。待其凝固後，4'C過夜使血塊收縮。吸出上清液(血清)，沉澱4°C2500g離心30分鐘，取上清液即血清與前面的上清液混合。4'C，1500g離心全部分離的血清部分。低溫保存。2.1.2.5.4抗血清特異性檢測誘導表達後的重組菌進行SDS-PAGE電泳後，用注射抗原和注射佐劑PBS對照的血清分別進行Western-blot分析。用BIO-RAD公司的蛋白轉印裝置進行WesternBlot檢測。按常規方法進行蛋白轉移。4°C，70mA轉印約2h。用乾淨的平頭鑷子取出硝酸纖維素膜，浸泡於封閉液中，置脫色搖床上室溫輕輕搖動數小時或於4'C冰箱放置過夜，然後用TTBS清洗四次，每次10min。加製備的抗血清，室溫孵育2h，然後用TTBS清洗四次，每次10min。再用HRP-標記的羊抗鼠IgG室溫孵育2h，然後用TTBS清洗四次，每次10min。加入DAB顯色液顯色至有清晰的目標蛋白帶出現，用ddH20終止反應，並衝洗10min以終止顯色，把膜置於濾紙上，自然乾燥。2.2結果分析2.2.1原核表達載體的構建根據構建的pSVCV-Full克隆的序列設計引物。設計合成了分別含五coRI、歷m/ni兩個酶切位點的SVCVG基因原核表達用引物，且在3'、5'端加2~3個保護鹼基，擴增N端約1000bp序列(去信號肽)。引物在上海英駿生物技術有限公司合成，序列如下(方框中序列為酶切位點)SVC-Gly-Full-F:5'-CGGAATTCCAGCCTGTAATTCAGCCATTT-3'(五coRI位點)SVC-Gly-Full-R:5'-GCG^AGCTTlCAGCCATCTAACTCCCAGTCGTC-3'(歷mnii位點)以質粒pSVCV-Full為模板，根據選定的引物成功地擴增到了目的條帶(圖4)。PCR產物酶切純化後與經相應的內切酶酶切的pET32a載體連接，菌落PCR篩選為陽性後送測序得正確克隆。2.2.2.原核表達及條件優化2.2.2.1將pET-SVCV-Gly質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導，可以表達出分子量約57.4kDa(圖5)重組蛋白，與預測出來的大小相符(57348Da)。其中重組質粒pET-SVCV-GIy表達出來的蛋白的預計分子量為37.0kDa，pET-32a(+)表達的融合標籤為20.4kDa。在加IPTG誘導前，取出lmL菌液作為陰性對照。從下面的電泳圖可以看出，在57KDa的位置有很強的蛋白帶，與預期相符，說明了目的蛋白的成功表達。37'C誘導的重組蛋白幾乎不可溶，全部以包涵體形式存在，因為後續實驗的主要目的是製備SVCVG蛋白特異的抗體，蛋白以包涵體形式存在方便後面純化，且不會影響抗體的特異性，因此就選用37'C表達蛋白製備抗體。誘導時間是影響重組蛋白表達量的重要因素，比較了5個誘導時間lh、2h、3h、4h和5h的表達量。SDS-PAGE結果表明(圖6)，誘導時間在所分析的5h內，隨誘導時間的增長，重組蛋白的表達量增高，因此我們選擇的誘導時間為5h。從圖6，選定濃度的IPTG均能明顯地誘導重組蛋白的表達，但從表達量上看，0.4mMIPTG誘導的重組蛋白相對最多，所以最終我們選擇0.4mMIPTG作為最佳IPTG濃度。因此重組蛋白在大腸桿菌中誘導表達的最佳條件為37°C、0.4mMIPTG誘導表達5h。2.2.2.2第四次免疫後的第七天採血。用抗血清進行Western-blot分析發現，只有免疫了重組蛋白抗原後製備的抗血清才能與57.4kDa蛋白帶發生反應(圖7)。實施例3SVCVG基因DNA疫苗的構建3.1材料與方法3丄1材料PrimeSTARHSDNA聚合酶購自TaKaRa公司。細菌培養相關試劑、質粒載體及受體菌同第一部分。3丄2方法3.1.2.1引物設計及目的基因片段的PCR擴增3.1.2.1.1引物設計共設計合成了三對引物，在每對引物的上遊引物中均加入Kozak序列，以便目標蛋白能在魚體中獲得高效表達。引物在上海英駿生物技術有限公司合成。目的片段的PCR擴增方法見l丄2.2.2.2;PCR產物的酶切純化方法見1.1.2.3.1;質粒的提取、酶切及純化方法見1丄2.3.2。雙酶切後的質粒pET與雙酶切後的PCR產物連接方法見1丄2.5.1;連接產物轉化入DH5a並篩選陽性克隆方法見1.1.2.5.2及1丄2.6。3.2結果分析共設計合成了三對引物，在每對引物的上遊引物中均加入Kozak序列，以便目標蛋白能在魚體中獲得高效表達。引物在上海英駿生物技術有限公司合成，序列如下(方框中序列為酶切位點)(表7)。表7SVCVG基因片段DNA疫苗用引物引物名稱引物序列(5'~>3')pSVCV-Sig.-FpSVCV-Sig,RpSVCV-T薩.-FpSVCV-Trans.-RpSVCV-Null-FpSVCV-Null-RCGGGTACCAAAACTAACAGACATCATGGCTCGTCTAGAATTATAGACTAGTTCCCCACCCACTGCAGGTACCATGGCCATATTTGTTCCATCCCGTCTAGACTCAAACTAAAGACCGCATTTCGCAGGTACCATGGCCATATTTGTTCCATCCCGTCTAGAATTATAGACTAGTTCCCCACCCACTG注加邊框的序列為酶切位點，其中上遊引物用的是iCpwI，下遊引物用的是;H)aI;粗體標記序列為起始密碼子；下劃線標記序列為終止密碼子。三對引物中，pSVCV-Sig.引物對擴增的是缺失信號肽的SVCVG基因；pSVCV-Trans.引物對擴增的是缺失跨膜區及其後序列的SVCVG基因；pSVCV-Null引物對擴增的是同時去信號肽和跨膜區的SVCVG基因。經PCR擴增後的序列大小分別為1431bp、1493bp、1361bp(圖8)。實施例4SVCVDNA疫苗免疫效果的評估4.1材料與方法4.1.1材料胖頭魚尾柄細胞系(fatheadminnow,FHM)由本實驗室傳代培養保存。培養基MEM配製方法見說明書。0.22ym濾膜過濾除菌後，按比例加入雙抗至終濃度各為IOOU/mL。Lipofectamine2000，Invitrogen公司；Opti-MEMIReducedSerumMedium,GIBCO公司。0.05。/。MS-222(垸基磺酸鹽同位氨基苯甲酸乙酯)購自SIGMA,lgMS-222加適量水溶解後定容到2000mL。高錳酸鉀，天津市福晨化學試劑廠。斑馬魚體重0.2~0.4§，購自廣州市芳村花鳥魚市場，在實驗室暫養一周後用於免疫實驗。魚缸34cmX22cmX27cm(長X寬X高)；魚糧金彩虹微顆粒魚糧，廣州金彩虹水族用品有限公司。EndofreeplasmidMaxkit，QIAGEN公司。50pL微量進樣器，上海伊玻玻璃器械有限公司。其餘同前。4.1.2.方法4丄2.1去內毒素質粒DNA的提取及濃度的測定4.1.2.1.1去內毒素質粒DNA的提取在去內毒素質粒DNA提取相關的實驗過程中，所有的玻璃器皿，如量筒、燒杯及稱量用的勺子均在18(TC烘烤8h，以破壞內毒素。劃線接種重組質粒pSVCV-Full、pSVCV-Sig.、pSVCV-Trans.、pSVCV-Null及pcDNA3.0，隔日挑單克隆於裝有25mLLB/Amp液體培養基的培養管中，37°C300rpm搖床培養8h左右。菌落PCR鑑定為陽性後1/500~1/1000接種於含100mLLB/Amp液體培養基的1000mL錐形瓶中，37°C300rpm搖床培養12h16h左右。用QIAGENEndofreeplasmidMaxkit提取，具體步驟如下(1)4°C，6000g離心15min收菌；(2)劇烈搖晃盛BufferPI的試劑瓶以完全懸浮LyseBlue顆粒，力B10mLBufferPl/RnaseA(4'C保存)完全懸浮細菌沉澱；(3)往重懸液中加10mLBufferP2，溫和但充分地上下翻轉混合46次，室溫放置5min。因為LyseBlue的緣故，加BufferP2後溶液變藍，充分混合直至整個溶液呈現一片均勻的藍色；(4)加10mL冰預冷的BufferP3，立即溫和地上下顛倒離心管數次，直至看不到藍色；(5)將一乾淨的QIAlilterMaxiCartridge置於一合適的支架上，擰上螺帽，將步驟4的裂解液倒入QIAlilterMaxiCartridge中，室溫放置lOmin;(6)移去螺帽，輕輕地將活塞(plunger)插入QIAlilterMaxiCartridge中，過濾入一乾淨50mL離心管中，這一步大約能夠收集到25mL濾液；(7)加2.5mLBfferER到濾液中，溫和但充分地上下翻轉混合10次，冰上放置30min;(8)加10mLBufferQBT到QIAGEN-tip500中，讓其自然流幹以平衡吸附柱；(9)30mLBfferQC洗QIAGEN-tip500柱；(10)重複步驟(9);(11)15mLBfferQN洗脫；(12)加10.5mL異丙醇(室溫放置)沉澱質粒DNA，混勻後4'C、>15,000g離心30min，棄上清；(13)5mL70。/。的酒精(室溫放置)洗滌，4°C、>15,000g離心10min，棄上清；(14)空氣中乾燥5min10min，適量endotoxin-freeBufferTE溶解，-20°C保存備用。4.1.2.1.2質粒DNA濃度的測定質粒DNA濃度通過測定其在OD260的吸收值來確定。提取的5個質粒分別用endotoxin-freeBufferTE做100倍和50倍稀釋，在兩臺不同的紫外分光光度計測定OD260以確定各個質粒的濃度。4.1.2.2病毒滴度的測定用空斑法測定病毒滴度，具體步驟如下傳FHM細胞到24孔板內，20~22h後細胞長成單層。以無血清培養基將待測病毒SVCV進行IO倍梯度稀釋到10—8。棄去細胞板中的培養液，每孔內加入IOOPL的病毒稀釋液，每個濃度設3個復孔，並且設立陰性對照。25。C下吸附lh，期間不時輕搖細胞板。吸附lh後棄去孔內病毒稀釋液，加入650IIL的滅菌瓊脂糖(終濃度0.7%)-M199培養基混合液，室溫(15-20min)冷凝後，加入lmL含有Herpes的M199培養液。5天後計數每孔內空斑的數目。病毒病毒滴度用PFU/mL表示。以最低稀釋度內的空斑總數平均數計算其滴度。4.1.2.3接種DNA疫苗前斑馬魚體內SVCV的檢驗在注射DNA疫苗進行免疫學實驗之前，需對受免魚進行SVCV的檢驗。隨機挑取9條斑馬魚，取肝、脾、腎，三條魚作為一個樣品，用TRIzolReagents提取組織的總RNA。組織經液氮凍脆研磨後加入10倍體積的Trizol。研碎後用移液槍移入無RNase的1.5mL離心管中，接下來的步驟同2丄2丄2。脂A提取後按照2丄2.2.2進行反轉及PCR擴增，設RT和PCR陰性對照，陽性對照使用已確定感染SVCV的斑馬魚所提取的RNA。4.1.2.4DNA疫苗的細胞內表達DNA疫苗的細胞內表達研究採用重組質粒轉染FHM細胞，提取總RNA後RT-PCR檢測。具體方法如下轉染前一天，接種2~6><105個細胞於6孔板，至轉染時有90~95%的匯合度；4.0Ug質粒和10LLipofectamine2000分別用Opti-MEM培養基稀釋至250uL，輕輕混勻，室溫孵育5min;將兩者輕輕混勻，室溫孵育20min;棄原培養板孔中的培養液，力nlmL無血清的MEM培養基，再加入DNA和Lipofectamine2000的混合液，輕搖培養板以使混合液與細胞充分接觸；25'C恆溫培養箱中培養4~6h後，吸走混合液，加2mL含10%胎牛血清的MEM培養基，30h後取出培養板，-80°(:保存。總RNA提取及RT-PCR檢測方法見1丄2.1.2、1.1.2.2.2。PCR檢測用引物同4丄2.3中斑馬魚體內SVCV的檢驗用引物。4丄2.5免疫魚體實驗4丄2.5.1免疫前的準備工作在養斑馬魚之前，所有的魚缸均用高錳酸鉀溶液浸泡過夜。根據紫外分光光度計測定的結果，將每個質粒用PBS稀釋至終濃度為0.1(ig/)oL。4.1.2.5.2免疫魚體實驗將斑馬魚放入0.05。/。的MS-222溶液中，待魚麻醉後立即進行免疫接種，每條魚肌肉注射接種5yL。實驗共分7個組1、未注射對照組；2、注射PBS對照組；3、注射pcDNA3.0對照組；4、注射pSVCV-Full重組質粒實驗組；5、注射pSVCV-Sig.重組質粒實驗組；6、注射pSVCV-Trans.重組質粒實驗組；7、注射pSVCV-Null重組質粒實驗組。其中第1組接種約30條魚；第2~7組各接種約60條魚。除了第1組外，其它每組魚分養於兩個魚缸。整個實驗過程中水溫維持在21°C，接種前一天停止餵食，接種當日記為第零天，第二天開始正常換水和餵食。4.1.2.6攻毒實驗攻毒前將分開養的每組斑馬魚的兩個缸中的魚合在一起，接種DNA疫苗後第七天進行攻毒實驗。第1組作為對照，其餘每組每條魚腹腔注射用PBS1000倍稀釋的病毒原液l(HiL。注射後每組的魚仍然分成兩個魚缸養殖，養在原缸的記為①，所有的記為①的魚缸作為第一大組；養在新缸的記為②，所有的記為①的魚缸作為第二大組。攻毒前一天停止餵食，攻毒當日記為第零天，攻毒後第二天開始正常換水和餵食。每日統計死亡魚數，統計到第6天。4.2結果分析4.2.1接種前斑馬魚體內SVCV的檢驗檢驗用弓I物特異擴增SVCVG蛋白第451位核苷酸到1303位核苷酸的853bp的序列，引物序列如下D-SVC-Gly-F:5'-TCTGTTCATTTGGAGCCG陽3'D-SVC-Gly隱R:5'-GGATTTCATCGTCGTCAT-3'PCR結束後lc/。瓊脂糖凝膠電泳檢測。設RT和PCR陰性對照，陽性對照使用己確定感染SVCV的斑馬魚所提取的RNA。圖9為隨機取樣的斑馬魚RNA的RT-PCR結果。從圖可見，隨機取樣的斑馬魚均未擴增出目的條帶。由此證明，隨機取樣的斑馬魚均未感染SVCV,因此可用於SVCVDNA疫苗的免疫效果評價實驗。4.2.2DNA疫苗的細胞內表達RT-PCR檢測結果見圖10，可見轉染細胞擴增出了約850bp的片段，證明構建的DNA疫苗能夠在細胞內表達。4.2.3免疫魚體實驗暫養時水溫逐步下調，到接種時降至2rc，維持此溫度直至整個實驗結束。肌肉注射5jxL重組質粒，注射的具體部位是在背部中央、背鰭和側線之間離魚體頭部60%的地方(圖11)。7天後進行攻毒實驗，每日統計魚的死亡數，注射後12h內死亡的魚被認為是注射或脅迫等原因致死。根據實驗數據繪製柱形圖(圖12)。以注射pcDNA3.0組為對照組，根據統計出來的各組的死亡率，依下式計算相對保護率(Relativepercentagesurvival，RPS):相對保護率(RPS"[l-(免疫組死亡率/對照組死亡率)]x100。/。應用SPSS10.0進行f檢驗。計算出來的結果見表8。對實驗組的乂2檢驗表明，各組差別不顯著CP=0.486)。表8每組的相對保護率tableseeoriginaldocumentpage22權利要求1.一種鯉春病毒血症病毒疫苗DNA疫苗，其特徵在於由SVCVG蛋白全長基因和原核表達載體pET32a(+)質粒構成。2.權利要求1所述鯉春病毒血症病毒疫苗DNA疫苗的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)SVCVG蛋白全長基因的克隆；(2)SVCVG基因的原核表達及抗體製備；(3)SVCVG基因DNA疫苗的構建。3.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的SVCVG蛋白全長基因的克隆引物序列為SVC-Gly-Full-F:5'-CCGGGTACCAAAACTAACAGACATCATGT-3'SVC隱Gly-Full-R:5'-GCCTCTAGAACTCTCAAACTAAAGACCGCA-3'。4.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的SVCVG基因的原核表達引物序列為SVC-Gly-Full-F:5'-CGGAATTCCAGCCTGTAATTCAGCCATTT-3'SVC-Gly-Full-R:5'-GCGAAGCTTCAGCCATCTAACTCCCAGTCGTC-3'。5.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的SVCVG基因的原核表達的反應溫度為37°C。6.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的SVCVG基因的原核表達的誘導條件為0.4mMIPTG，5h。7.按照權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)所述的SVCVG基因DNA疫苗的構建引物序列為pSVCV-Sig,F:CGGGTACCAAAACTAACAGACATCATGGCTpSVCV-Sig.-R:CGTCTAGAATTATAGACTAGTTCCCCACCCACTGpSVCV-Trans,F:CAGGTACCATGGCCATATTTGTTCCATCCpSVCV-T腦，R:CGTCTAGACTCAAACTAAAGACCGCATTTCGpSVCV-Null-F:CAGGTACCATGGCCATATTTGTTCCATCCpSVCV-Null-R:CGTCTAGAATTATAGACTAGTTCCCCACCCACTG。全文摘要本發明公開了一種鯉春病毒血症病毒DNA疫苗及其製備方法。鯉春病毒血症病毒疫苗DNA疫苗，由SVCVG蛋白全長基因和原核表達載體pET32a(+)質粒構成。鯉春病毒血症病毒疫苗DNA疫苗的製備方法，包括如下步驟(1)SVCVG蛋白全長基因的克隆；(2)SVCVG基因的原核表達及抗體製備；(3)SVCVG基因DNA疫苗的構建。本發明創造性地將DNA疫苗技術應用於鯉春病毒血症的防治。與其他疫苗相比，DNA疫苗能同時誘導機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答，同時具有高效、安全、便於貯運及易於大量生產等優點。文檔編號A61K48/00GK101168063SQ20071003128公開日2008年4月30日申請日期2007年11月7日優先權日2007年11月7日發明者傑公,孫靜靜,歐陽徵亮,秦啟偉申請人:中山大學