一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法
2023-08-09 08:37:16
一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法
【專利摘要】本發明提供一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，包括油相的製備、病毒液的製備、病毒的收穫、病毒的滅活、病毒液的濃縮以及乳化步驟。本發明製備的疫苗為水包油包水型，粘度低，粒度小，易吸收，同時接種後產生抗體速度較快；本發明選用的佐劑在疫苗製備過程中無需要額外添加任何表面活性劑成分，製備的疫苗安全性好，避免了傳統油佐劑難以吸收造成的副作用。
【專利說明】一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及疫苗【技術領域】，具體涉及一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法。
【背景技術】
[0002]雞新城疫，又稱「雞瘟」，在家禽養殖中是一種重要的病毒性傳染病，嚴重影響著養禽業的健康發展。目前我國肉雞養殖出現規模化趨勢，高密度大群飼養是目前發展的趨勢，但針對肉雞生長發育快、飼養周期短等現狀，目前已存在的疫苗都不能很好的應對趨於複雜化的疾病；我國對新城疫的防制主要採用毒力不同的弱毒疫苗進行預防，而弱毒疫苗的缺點是對雛雞仍有一定的致死率，能夠增強對其它病原的易感性。
[0003]肉雞生長周期短，快速的體重增加使肉雞的免疫系統處於高負荷狀態，這要求肉雞用疫苗有更高的質量保證，適時適度的接種疫苗是有效避免疫情的措施。現有技術中，滅活疫苗多為油包水型，其製備工藝比較複雜，並且注射部位吸收較慢、抗原釋放較慢，影響機體抵抗病毒的能力、後期影響禽類肉製品的品質；雖然能產生一定水平的抗體，但是抗體產生的時間較晚，不適於生長周期較短的肉雞。
【發明內容】
[0004]為克服現有技術的技術缺陷，本發明提供一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗。
[0005]為了實現以上技術的技術目的，本發明採用以下技術方案:
[0006]一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，包括以下步驟:
[0007]I)油相的製備:取賽比克公司製造的montanide?iSA206VG型佐劑，使用前進行充分混勻，並置於28-32°C水浴鍋中預熱至水浴鍋溫度，即為油相；
[0008]2)病毒液的製備:將雞新城疫病毒毒種用滅菌生理鹽水作3000-6000倍稀釋，尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚，每胚0.lml，37°C孵育；
[0009]3)病毒的收穫:選接種後48~120小時之間死亡且病痕明顯的雞胚，收穫尿囊液，保存於_20°C ；
[0010]4)病毒的滅活:向病毒液中加入37%(w/w)的福馬林溶液，混勻，調整福馬林終濃度至0.05-0.15%(w/w)，置於37°C轉速為160-200轉/分鐘的搖床中滅活14-18小時；
[0011]5)病毒液的濃縮:將滅活後的雞新城疫病毒液通過GQ管式離心機離心，棄去沉澱，將濾過液用Millipore公司製造的、截留分子量為200-500KD的膜包進行2倍濃縮，濃縮後的病毒液即為疫苗水相；
[0012]6)乳化:將步驟5)製備的疫苗水相置於28_32°C水浴鍋中預熱至水浴鍋溫度，再將其和油相按為1:0.8-1:1.2的比例(w/w)混合，用磁力攪拌裝置進行攪拌，然後採用ATSEngineering Inc公司製造的AH100D型均質機對其進行乳化,共乳化1_3遍，即得到一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗。[0013]上述製備方法中，步驟I)所述水浴鍋溫度優選為31°C ;步驟2)所述稀釋倍數優選為5000倍；驟4)所述病毒液中福馬林終濃度優選為0.1 (w/w);步驟4)所述搖床轉速優選為160轉/分鐘；步驟4)所述的滅火時間優選為16小時；步驟5)所述的膜包的截留分子量優選為300KD ;步驟6)所述的水相與油相混合比例優選為1:1 (w/w);步驟6)所述的乳化次數優選為2次；步驟6)所述的乳化條件為調整所述均質機二級閥壓力為20-30bar、一級閥壓力200-400bar。 [0014]本發明的有益效果在於:本發明製備的疫苗為水包油包水型，粘度低，粒度小，易吸收，同時接種後產生抗體速度較快；本發明選用的佐劑在疫苗製備過程中無需要額外添加任何表面活性劑成分，製備的疫苗安全性好，避免了傳統油佐劑難以吸收造成的副作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是不同劑型的雞新城疫疫苗免疫肉雞後開始產生抗體時間規律
[0016]圖2是不同劑型的雞新城疫疫苗免疫肉雞後產生抗體持續期規律
【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018]1.1油相的製備
[0019]取賽比克公司製造的montanide?i SA206VG型佐劑，使用前進行充分混勻，並置於31°C水浴鍋中預熱至31°C，即為油相。
[0020]1.2病毒液的製備
[0021]將雞新城疫病毒毒種用滅菌生理鹽水作5000倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.lml，37°C孵育；
[0022]1.3病毒的收穫
[0023]選接種後48~120小時之間死亡且病痕明顯的雞胚，收穫尿囊液,保存於_20°C ；
[0024]1.4病毒的滅活
[0025]向病毒液中加入37%(w/w)的福馬林溶液，混勻，調整福馬林終濃度至
0.l%(w/w)，置於37°C轉速為180轉/分鐘的搖床中滅活16小時；
[0026]1.5病毒液的濃縮
[0027]將滅活後的雞新城疫病毒液通過GQ管式離心機離心，棄去沉澱，將濾過液用Millipore公司製造的、截留分子量為300KD的膜包進行2倍濃縮，濃縮後的病毒液即為疫苗水相；
[0028]1.6水包油包水型乳劑的乳化
[0029]將步驟1.5製備的疫苗水相置於31°C水浴鍋中預熱至31°C，再將其和油相按為1:1的比例(w/w)混合,用磁力攪拌裝置進行攪拌,然後採用ATS Engineering Inc公司製造的AH100D型均質機調整二級閥壓力為20bar、一級閥壓力300bar對其進行乳化，共乳化2遍，即得到一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗。
[0030]按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗，發現無菌生長。
[0031]將滅活後的病毒原液以10倍稀釋液和100倍稀釋液分別尿囊腔接種於10日齡SPF雞胚中，37°C孵育120h，發現雞胚未出現死亡或明顯病痕現象，進一步進行血凝試驗發現試驗結果均為陰性。
[0032]1.7肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗免疫肉雞效力試驗
[0033]用上述滅活後的病毒液再分別進行2.5倍和1.1倍濃縮，再用其分別製備出油包水型疫苗、水包油型疫苗，用於同製備出的肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗做效力比較。
[0034]1.7.1三種不同劑型的新城疫油乳劑滅活疫苗分組
[0035]表1:三種不同劑型的新城疫油乳劑滅活疫苗免疫肉雞劑量及分組
[0036]
【權利要求】
1.一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於包括以下步驟: O油相的製備:取疫苗佐劑，使用前進行充分混勻，並置於28-32°C水浴鍋中預熱至水浴鍋溫度，即為油相； 2)病毒液的製備:將雞新城疫病毒毒種用滅菌生理鹽水作3000-6000倍稀釋，尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚，每胚0.lml，37°C孵育； 3)病毒的收穫:選接種後48~120小時之間死亡且病痕明顯的雞胚，收穫尿囊液，保存於-200C ； 4)病毒的滅活:向病毒液中加入37%(w/w)的福馬林溶液，混勻，調整福馬林終濃度至0.05-0.15%(w/w)，置於37°C轉速為160-200轉/分鐘的搖床中滅活14-18小時； 5)病毒液的濃縮:將滅活後的雞新城疫病毒液通過管式離心機離心，棄去沉澱，將濾過液用截留分子量為200-500KD的膜包進行2倍濃縮,濃縮後的病毒液即為疫苗水相； 6)乳化:將步驟5)製備的疫苗水相置於28-32°C水浴鍋中預熱至水浴鍋溫度，再將其和油相按為1: 0.8-1:1.2的比例(w/w)混合，用磁力攪拌裝置進行攪拌，然後採用均質機對其進行乳化，共乳化1-3遍，即得到一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗。
2.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟I)所述水浴鍋溫度為31°C。
3.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟2)所述的稀釋倍數為5000倍。
4.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟4)所述病毒液中福馬林終濃度為0.1 (w/w)。
5.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟4)所述搖床轉速為160轉/分鐘。
6.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟4)所述的滅火時間為16小時。
7.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟5)所述的膜包的截留分子量為300KD。
8.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟6)所述的水相與油相混合比例為1:1 (w/w)。
9.根據權利要求1所述的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟6)所述的乳化次數為2次。
10.根據權利要求1所述 的一種肉雞用新城疫水包油包水型滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟6)所述的乳化條件為:調整所述均質機二級閥壓力為20-30bar、一級閥壓力200_400bar。
【文檔編號】A61P31/14GK103566366SQ201310439027
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】康亞男, 毛雅元, 王壽山, 張莎, 何召慶, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司