一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法
2023-08-09 08:55:36
一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，屬於微生物發酵【技術領域】。該方法包括以下步驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發酵培養基中，在溫度34～38℃、pH值6.3～6.8條件下發酵培養48～72小時；所述發酵培養基為：以質量百分比計，乳糖1.5～2.5％、NH4Cl1～2％、MgSO40.5～0.7％，餘量為水。本發明採用枯草芽孢桿菌1.1111(CCTCC NO:M2011286)為發酵菌株，通過優化發酵培養基組成及發酵培養條件，使菌株產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的活性達到最佳，其中纖維素酶酶活達206.72U/ml，甘露聚糖酶酶活達1451.37U/ml，糖化酶酶活達254.72U/ml。本發明採用一菌多酶發酵法，能大幅度提高酶的生產效率，降低生產成本，並且由於各種酶來源於同一菌株，其安全性與復配性能更優。
CCTCC NO.M2011286
2011.08.11
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方 法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，屬於微 生物發酵【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 飼用酶製劑是一類高效、無毒副作用的環保型"綠色"飼料添加劑，廣泛應用於在 動物生產中。酶製劑可大大提高動物的生產性能，緩解飼料資源短缺、人畜爭糧的局面，有 利於保障糧食安全，提供更為安全，優質的動物產品，有利於保障食品安全，減輕環境汙染， 保障畜禽養殖業的可持續發展。
[0003]早期的酶製劑以動植物作為原料直接提取，但動植物生長周期長，原料有限，加之 酶提取工藝複雜等，不適於大規模工業生產。而微生物在酶製劑的生產中有其他生物不可 比擬的優越性：微生物對外界環境有很強的適應性和變異能力，人們可利用基因工程和生 物學技術按照自己的意願對微生物進行改造，生產出目的酶；微生物對營養物質的要求不 高，大部分是農產品廢棄物，價格低廉，易得到，生產成本低；微生物繁殖快，生長周期短，有 利於提商酶製劑的廣量等。
[0004]研究表明，複合酶製劑較單一酶製劑能更好地改善動物的生產性能，達到生物功 能的多樣化。但是，目前所應用的複合酶製劑均由不同的菌株單獨發酵生產後按照一定的 比例混合製成，生產成本過高，複合酶產品質量不穩定，且使用不方便。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方 法。
[0006]為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是：
[0007]-種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步驟：將枯 草芽孢桿菌菌液接種到發酵培養基中，在溫度34?38 °C、pH值6. 3?6. 8條件下發酵培 養48?72小時；所述發酵培養基為：以質量百分比計，乳糖1. 5?2. 5%、NH4C11?2%、 MgS040. 5?0. 7%，餘量為水。
[0008]所述發酵培養的優選條件為：溫度36°C，pH值6. 5,發酵時間60小時。
[0009] 所述發酵培養基優選為：以質量百分比計，乳糖2%、見14(：11.5%、1%5040.6%，餘 量為水。
[0010] 所述枯草芽孢桿菌菌液的製備方法為：將活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養基 中，在溫度37°C下（180r/min振蕩）培養18?24小時；所述種子培養基為：以質量百分比 計，蛋白腖1 %、酵母浸出物〇. 5%、NaClO. 5%，餘量為水，pH值7. 2?7. 6。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌菌液的濃度為5X108?8X108CFU/ml，接種量為3?6%。優 選接種量為4%。
[0012] 所述活化的枯草芽孢桿菌的製備方法為：將凍幹保存的枯草芽孢桿菌接種到普通 瓊脂培養基中，在溫度37°c下培養18?24小時；所述普通瓊脂培養基為：以質量百分比 計，蛋白腖l%、NaC10. 5%、牛肉膏1%、瓊脂粉2%，餘量為水，pH值7. 2?7. 6。
[0013]所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌1. 1111 (Bacillus subtilis)，保藏編號： CCTCCN0:M2011286,保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保 藏地址：中國武漢市武漢大學。
[0014] 所述枯草芽孢桿菌1. 1111 (Bacillus subtilis)能產生木聚糖酶、蛋白酶、植酸 酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶、澱粉酶、纖維素酶等多種酶，並對膽酸鹽、人工 胃液及腸液等表現很強的耐受性。
[0015] 本發明的有益效果：
[0016] 本發明採用枯草芽孢桿菌1. 1111(CCTCCNO:M2011286)為發酵菌株，通過優化發 酵培養基組成（如碳源、氮源和無機鹽）及發酵培養條件（如發酵溫度、pH值、發酵時間和 接種量），使菌株產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的活性達到最佳，其中纖維素酶酶活達 206. 72U/ml，甘露聚糖酶酶活達1451. 37U/ml，糖化酶酶活達254. 72U/ml。
[0017] 本發明採用一菌多酶發酵法生產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶，能大幅度提高 酶的生產效率，降低生產成本，並且由於各種酶來源於同一菌株，其安全性與復配性能更 優。為進一步實現共發酵產纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露聚糖 酶、糖化酶等奠定了基礎，具有重要的研究與開發意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明試驗例中不同碳源對菌株產酶的影響；
[0019] 圖2為試驗例中不同氮源對菌株產酶的影響；
[0020] 圖3為試驗例中不同無機鹽對菌株產酶的影響；
[0021] 圖4為試驗例中葡萄糖的標準曲線；
[0022] 圖5為試驗例中甘露糖的標準曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0024] 實施例1
[0025] 本實施例中枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步 驟：
[0026] (1)將凍幹保存的枯草芽孢桿菌接種到普通瓊脂培養基中，在溫度37°C下培養 21小時；枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌1. 1111 (Bacillus subtilis)，保藏編號：CCTCC N0:M2011286,保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地 址：中國武漢市武漢大學；普通瓊脂培養基為：以質量百分比計，蛋白腖l%、NaC10. 5%、牛 肉膏1%、瓊脂粉2%，餘量為水，pH值7. 4;
[0027] (2)挑取活化的枯草芽孢桿菌單個菌落接種到種子培養基中，在溫度37°C下振蕩 (180r/min)培養21小時，得到枯草芽孢桿菌菌液，菌液濃度為6X108CFU/ml;種子培養基 為：以質量百分比計，蛋白腖1 %、酵母浸出物〇. 5%、NaClO. 5%，餘量為水，pH值7. 4 ;
[0028] (3)將枯草芽孢桿菌菌液接種到發酵培養基中，在溫度36 °C、pH值6. 5條件下發 酵培養60小時（180r/min振蕩）；枯草芽孢桿菌菌液的接種量為4%;發酵培養基為：以質 量百分比計，乳糖2%、NH4C11. 5%、MgS040 . 6%，餘量為水。
[0029] 實施例2
[0030] 本實施例中枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步 驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發酵培養基中，在溫度38 °C、pH值6. 3條件下發酵培養48 小時（180r/min振蕩）；枯草芽孢桿菌菌液的接種量為3%;發酵培養基為：以質量百分比 計，乳糖2. 5%、NH4C12%、MgS040. 7%，餘量為水。枯草芽孢桿菌菌液的製備方法同實施例 1〇
[0031] 實施例3
[0032] 本實施例中枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步 驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發酵培養基中，在溫度34°C、pH值6. 8條件下發酵培養72 小時（180r/min振蕩）；枯草芽孢桿菌菌液的接種量為6%;發酵培養基為：以質量百分比 計，乳糖1. 5 %、NH4C11 %、MgS040. 5 %，餘量為水。枯草芽孢桿菌菌液的製備方法同實施例 1〇
[0033] 試驗例
[0034] 一、菌種
[0035]菌種：枯草芽孢桿菌 1. 1111(Bacillussubtilis)，保藏編號：CCTCC N0:M2011286,保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地 址：中國武漢市武漢大學。
[0036] 二、培養基
[0037] 普通瓊脂培養基：以質量百分比計，蛋白腖1%、NaClO. 5%、牛肉膏1 %、瓊脂粉 2%，餘量為水，pH值7.2?7.6;
[0038] 種子培養基：以質量百分比計，蛋白腖1 %、酵母浸出物0. 5%、NaClO. 5%，餘量為 水，pH值 7. 2 ?7.6 ;
[0039] 基礎發酵培養基：以質量百分比計，蔗糖1 %、蛋白腖1%、NaClO. 5%，餘量為水， pH值 7. 2 ?7. 6。
[0040] 三、枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的培養基組分、用量及發酵條 件優化試驗
[0041] 1、菌種的活化
[0042] 將凍幹保存的枯草芽孢桿菌（CCTCCN0:M2011286)接種到普通瓊脂培養基中，在 溫度37°C下培養18?24小時，觀察結果，保存備用。
[0043] 2、種子液的製備
[0044] 挑取活化的枯草芽孢桿菌單個菌落接種到種子培養基中，在溫度37°C下振蕩 (180r/min)培養18?24小時，觀察結果，保存備用。
[0045] 3、分別將種子液按5%比例接入不同的發酵培養基中，在溫度37°C下振蕩（180r/ min)培養，對發酵培養基組分、用量進行優化，採用單因素試驗和正交試驗。
[0046]4、單因素試驗確定最佳培養基組分
[0047] (1)不同碳源對菌株產酶的影響
[0048] 分別採用2%可溶性澱粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖作為碳源，替代基礎發酵培 養基中1 %蔗糖，培養基其他組分及用量不變。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發酵培養48小時，取5ml枯草芽孢桿菌發酵液，4000r/min離心lOmin，取上清液按體積比1:6 (1:5?1:8均 可）用乙酸-乙酸鈉稀釋後得到粗酶液，分別在540nm下測纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶 的〇〇 54(|值，以確定最佳碳源，試驗結果見圖1。以不加碳源的培養基為空白對照。
[0049]從圖1可知，蔗糖為碳源時，甘露聚糖酶酶活最高；葡萄糖為碳源時，纖維素酶酶 活最高；乳糖為碳源時，甘露聚糖酶酶活最高。綜合各酶酶活，以乳糖為碳源的培養基中 各種酶的吸光值均較高，因此，乳糖是菌株發酵產纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的最優碳 源。
[0050] (2)不同氮源對菌株產酶的影響
[0051] 分別採用1%胰蛋白腖、酵母膏、（NH4)2S04、NH4N03、NH4C1替代基礎發酵培養 基中1%蛋白腖，培養基其他組分及用量不變。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發酵培養48小時， 取5ml枯草芽孢桿菌發酵液，4000r/min離心lOmin，取上清液按體積比1:6用乙酸-乙酸 鈉稀釋後得到粗酶液，分別在540nm下測纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的0D54(I值，以確定 最佳氮源，試驗結果見圖2。以不加氮源的培養基為空白對照。
[0052] 由圖2可知，以NH4C1為氮源時，糖化酶酶活最高；以（NH4)2S04S氮源時，甘露聚 糖酶酶活最高；以NH4N03為氮源時，纖維素酶酶活最高。綜合各酶酶活，以NH4C1為氮源時， 纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶酶活均相對較高。
[0053] (3)不同無機鹽對菌株產酶的影響
[0054] 分別採用0. 5%K2HP04、MgS04、FeS04替代基礎發酵培養基中0. 5%NaCl，培養基其 他組分及用量不變。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發酵培養48小時，取5ml枯草芽孢桿菌發酵 液,4000r/min離心lOmin,取上清液按體積比1:6用乙酸-乙酸鈉稀釋後得到粗酶液，分別 在540nm下測纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的(?54(|值，以確定最佳無機鹽，試驗結果見圖 3。以不加無機鹽的培養基為空白對照。
[0055] 由圖3可知，在以NaCl為無機鹽的培養基中，菌株產的甘露聚糖酶活性最高；在以 FeS04為無機鹽的培養基中，菌株產的纖維素酶活性最高；在以MgS04為無機鹽的培養基中， 菌株產的糖化酶活性最高。綜合各酶酶活，以MgS04為無機鹽時，纖維素酶、甘露聚糖酶及 糖化酶活性均相對較高。
[0056] 5、正交試驗確定最佳培養基配方
[0057] 以單因素試驗結果確定培養基組分，改變各組分的濃度，配製不同的培養基（濃 度設置見下見表1)。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發酵培養48小時，取5ml枯草芽孢桿菌發酵 液,4000r/min離心lOmin,取上清液按體積比1:6用乙酸-乙酸鈉稀釋後得到粗酶液，分別 在540nm下測纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的0D54(I值，以確定最佳培養基配方，極差分析 結果見下表2。
[0058] 表1發酵培養基正交實驗L9 (34)設計
[0059]
【權利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特徵在於：包括以 下步驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發酵培養基中，在溫度34?38 °C、pH值6. 3?6. 8 條件下發酵培養48?72小時；所述發酵培養基為：以質量百分比計，乳糖1. 5?2. 5%、 NH4C11 ?2%、MgS040. 5 ?0? 7%，餘量為水。
2. 根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特徵在於：所述發酵培養的條件為：溫度36°C，pH值6. 5,發酵時間60小時。
3. 根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特徵在於：所述發酵培養基為：以質量百分比計，乳糖2 %、NH4C11. 5 %、MgS040 . 6 %，餘量為 水。
4. 根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特徵在於：所述枯草芽孢桿菌菌液的濃度為5 X 108?8 X 108CFU/ml，接種量為3?6 %。
5. 根據權利要求1-3任一項所述的枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的 方法，其特徵在於：所述枯草芽孢桿菌菌液的製備方法為：將活化的枯草芽孢桿菌接種到 種子培養基中，在溫度37°C下培養18?24小時；所述種子培養基為：以質量百分比計，蛋 白腖1%、酵母浸出物〇? 5%、NaC10. 5%，餘量為水，pH值7. 2?7. 6。
6. 根據權利要求5所述的枯草芽孢桿菌產纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特徵在於：所述活化的枯草芽孢桿菌的製備方法為：將凍幹保存的枯草芽孢桿菌接種到普 通瓊脂培養基中，在溫度37°C下培養18?24小時；所述普通瓊脂培養基為：以質量百分比 計，蛋白腖l%、NaC10. 5%、牛肉膏1%、瓊脂粉2%，餘量為水，pH值7. 2?7. 6。
【文檔編號】C12N9/34GK104328097SQ201410342627
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年7月17日 優先權日:2014年7月17日
【發明者】劉一塵, 張謙, 丁軻, 趙敏, 張春傑, 餘祖華, 程相朝, 汪洋, 李小康, 何雷, 宋敏傑, 白羽, 邢廣源, 王亞洲, 李毅恆, 張玉香 申請人:河南科技大學