活動性結核病的治療性接種的製作方法

2023-07-26 23:11:01 1

專利名稱：：活動性結核病的治療性接種的製作方法活動性結核病的治療性接種本發明涉及衛生保健領域。更特別地，本發明涉及用於患有活動性肺結核病的對象的治療性接種的新方法。
背景技術：
：結核病(TB)是一種由緩慢生長的細菌結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染導致的疾病。TB可以是潛伏的或活動性的,後者是指細菌處於生長中並且引起症狀。所述細菌最常見於肺部，稱作肺TB，其是傳染性的。大約1/3的世界人口感染Mtb，其中5-10%的個體在其一生中將發展為活動性TB。TB導致每年死亡數超過2百萬,90%以上的病例發生在發展中國家。藥物易感性TB的目前治療典型包括由世界衛生組織(WHO)建議的對於抗生素抗性菌株給予抗生素藥物組合(cocktail)，持續6個月至一年或更長時間。儘管在治療的第一個月內大部分活躍複製的細菌被殺滅，但是在剩下的治療期間需要殺滅緩慢生長的持續存在的主要位於細胞內部的Mtb菌，以防止疾病復發。早於WHO建議的6個月中斷治療將導致疾病復發，這是由於剩餘的細菌繁殖所致，而嚴格堅持6個月的治療在最佳情況下可獲得僅超過90%的治癒率。然而，這種長期治療方案有一些缺點。事實上，在許多發展中國家的實際治癒率低於WHO設定的85%的目標治癒率，有時低於50%。低治療成功率是由於不良的患者順從性，導致多藥物和極端藥物抗性TB(MDR-TB/XDR-TB)形式的復發。因此，遵循抗生素的全部劑量是非常重要的，每日由健康專業人員觀察藥物的攝取以保證患者順從性。已知這是直接觀察治療(D0T)，這種治療產生高成本及物流負擔。儘管TB藥物治療自首次引進以來在挽救許多生命方面取得成功，但是MDR和XDR-TB的出現凸顯了使用抗生素對抗細菌中的固有限制。因此，仍急迫需要改良的活動性TB治療方案以控制目前全球性TB的流行。WO2004/062607描述了一種縮短TB治療持續時間的方式，包括使用弱酸或其前體治療TB。對抗TB的另一種獨立的途徑是通過接種。然而，這種方法通常針對於預防TB，通過在未患有活動性TB(優選當接種時甚至未感染Mtb)的人體中誘導免疫應答，因此這種方法中的疫苗是預防性疫苗。卡介苗(BCG)，一種活的減毒牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)菌株，是目前唯一可利用的TB疫苗，在幾十年間已經用於新生兒接種。然而，這種疫苗有其限制，近年來使用一些候選疫苗在產生更有效的TB疫苗中取得進展。已經處於臨床試驗中的一種候選物基於表達Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的腺病毒血清型35(Havengaetal,2006；Radosevicetal,2007；W02006/053871)。已經證實這種疫苗在未感染的人體內是安全的，能誘導針對疫苗Mtb抗原的高T細胞應答，使其成為預防性TB疫苗有希望的候選物。然而，在患有活動性TB的患者中進行目的為治療這些患者的接種則需要治療性TB疫苗。原則上，這種治療性TB疫苗可具有改善活動性TB治療的潛力。治療肺結核的治療性TB疫苗的設想首先由RobertKoch在1890年創立，當時他宣布通過結核菌素治療治癒了結核(見Burke，1993)。結核菌素由Mtb的提取物組成。然而，儘管所述治療在一些患者中治癒該疾病取得成功，但是一些患者呈現出症狀惡化，這種現象被稱作Koch’s現象。Koch’s現象的發生是由於Thl-相關細胞因子全身釋放，導致TB損害壞死所致(Churchyardetal,2009),其可導致毀滅性的臨床症狀,甚至導致死亡。因此，對於任何新的治療性TB疫苗候選物均需要證實的重要安全性考慮是在廣泛給予TB患者疫苗之後不存在Koch’s現象。這僅可在流行區域由精心設計的受控臨床試驗解決。近來，對重新恢復治療性TB接種的興趣再次得到關注，特別是用作TB化療的輔助劑，以期縮短治療。動物研究表明編碼TB抗原如熱休克蛋白65(HSP-65)(Lowrieetal,1999)、Ag85A(Haetal,2005)及Ag85B(Zhuetal,2005)的DNA疫苗在Mtb感染的動物中可降低細菌負荷(Haetal,2005；Zhuetal,2005)，當與化療聯合(Haetal,2005)或在化療完成之後(Lowrieetal,1999)使用時預防疾病復發。當在化療早期細菌負荷較低時給予治療性TB疫苗應能使免疫系統靶向持留菌(persisters),使得可以預防疾病復發。在臨床研究中，如在中國進行的試驗所表明，熱滅活的母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)製備物已經示出在MDR-TB中作為輔助治療是有效的(Fanetal,2007)0這種治療依賴於母牛分枝桿菌免疫調節的非特異性性質。處於臨床開發階段的另一疫苗是RUTI，其是含有Mtb細胞壁的脂質體製備物，目的是用作TB化療的輔助劑(Churchyardetal,2009)。儘管有所進展，但是對於這些疫苗仍需要證實的重要安全性考慮是在廣泛給TB感染的患者施用疫苗之後不存在Koch’s現象，這是僅可在流行區域由精心設計的受控臨床試驗解決的重要方面。實際上，幾年前在這個領域的一家公司的會議上報告了治療性疫苗候選物的研發由於安全性原因而不得不終止。此外，儘管在小鼠中使用編碼hsp60或Ag85抗原的DNA疫苗治療TB的一些報導是成功的，但也有在免疫治療性小鼠模型中出現經典Koch反應的其它報導(Tayloretal，2003)。這突出了通過免疫治療性接種引起Koch’s現象的危險，因此特別需要對每個疫苗候選物進行臨床研究以評定潛在的安全性問題。US2004/0057963涉及抗潛伏TB的治療性疫苗，其通過輸送多肽或編碼其的核酸實現，所述多肽在分枝桿菌感染潛伏期期間被上調或表達。US2004/0057963教導一些抗原(如ESAT6)儘管作為預防性疫苗強效，但是作為治療性疫苗無效，但是相反其它抗原(如Rv2031c)可以是有效的治療性疫苗，但是作為預防性疫苗無效或僅具有可忽略的作用(見該文中實施例2)。因此，技術人員通過US2004/0057963被教導針對治療性TB疫苗和預防性TB疫苗要使用不同抗原。對患有活動性TB患者進行治療性接種的另一複雜因素是患有活動性TB的個體實際上具有對來自Mtb抗原的刺激不應答的T淋巴細胞，這一點通過四聚體結合測定而觀測到(Weicholdetal,2007)。事實上,本發明中描述的臨床試驗證實在這些試驗中患有活動性TB的患者對於至少一些主要Mtb抗原是「免疫抑制的」或者「耐受的」:儘管熟知例如Ag85A和Ag85B是Mtb最強的免疫原性蛋白質，所述對象對這些蛋白質不應答。因此，治療性疫苗候選物應能打破這種Mtb-誘導的對細胞介導免疫的耐受。因此，本發明的目的是提供對患有活動性TB的患者的治療性治療，所述治療在符合嚴格安全性標準的條件下應是有效的，且優選也應能用於與藥物治療聯合應用，並且優選通過縮短藥物治療時間而改善藥物治療。發明概述本發明因此基於新的想法，即在治療和未治療個體中TB臨床存在的原因是Mtb桿菌能誘導對通常是免疫顯性Mtb抗原的耐受性。這種耐受性的誘導使免疫系統不能以抗原特異性方式正常工作，由此不能識別及殺滅化療劑幾乎不可及的細胞內TB生物體。通過在腺病毒載體中呈遞這些抗原，所述腺病毒載體將編碼這些抗原的核酸插入特定靶細胞中，可以破壞耐受性並且可以誘導有效的抗原特異性應答。此外，這些抗原特異性應答是以不誘導與Koch’s現象相關的一般炎症反應的方式誘導的。本發明因此能破壞耐受性並誘導抗原特異性免疫應答，而且不存在導致疾病進展而非抑制的不利非特異性炎症反應。所述耐受例如在治療了活動性TB的人體臨床試驗中證實，令人驚奇地發現其不具有對正常免疫顯性抗原Ag85A和Ag85B的細胞免疫應答，表示在活動性感染期間對這些抗原耐受。進一步示出用含有編碼Ag85A和Ag85B的核酸的重組腺病毒載體免疫令人驚奇地在經證實在TB感染期間缺少對這些免疫顯性抗原免疫應答的這些個體中可破壞這種耐受並誘導高水平的細胞免疫。也令人驚奇地示出以這種方式誘導這種抗原特異性免疫應答在經歷對活動性疾病進行化療的這些個體中不引起Koch’s現象或者肺部或其它形式TB的臨床進展的任何跡象。在這些患者中誘導的細胞免疫性的類型主要是表達Y幹擾素的⑶8T細胞，提示效應記憶細胞能殺死感染細胞內的TB。先前進行的發現新的預防性TB疫苗候選物的一個嘗試是基於腺病毒的TB疫苗，其在宿主細胞內表達TB抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4為融合蛋白，稱作Ad35.TBS或Ad35.TB-S(Havengaetal,2006；Radosevicetal,2007；W02006/053871;所述疫苗在文獻中也被稱作AERAS-402)，這個候選物正在非洲和美國進行廣泛的I期和II期臨床試驗。為了今後進入更大的臨床試驗而不需要為了實際原因而在招募者中進行廣泛的TB檢測，決定首先在Mtb感染的個體中檢測疫苗的安全性。因此，這個疫苗的臨床試驗在南非進行。所述疫苗在經歷TB治療的人群中以及被治癒但先前感染TB的那些人中進行II期試驗測試。這項研究的令人驚奇的結果證實所述疫苗是安全的，這通過在Mtb暴露個體中明顯不存在Koch’s現象而證實。同樣關鍵地，所述疫苗能克服由細菌介導的Mtb抗原的免疫抑制問題，這通過對所述疫苗抗原的免疫學應答測出。這些臨床試驗發現揭示了在治療方案中利用包含編碼Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的核酸的重組腺病毒載體的巨大潛力。所述疫苗也可以用作抗生素的輔助劑，例如縮短TB藥物治療時間，和/或降低縮短的TB藥物治療方案的復發率。因此，本發明第一方面提供了治療患有活動性結核病(TB)的患者的方法，所述方法包括:給所述患者施用重組腺病毒載體，所述載體包含編碼結核分枝桿菌(Mtb)的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。本發明第二方面進一步提供了在感染Mtb的對象體內誘導針對Mtb抗原免疫應答的方法，所述方法包括給所述對象施用給所述患者施用重組腺病毒載體，所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸，以在所述對象體內表達所述抗原及誘導對所述至少一種抗原的免疫應答。第三方面，本發明提供了重組腺病毒載體，其包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸，以治療患有活動性TB的患者。第四方面，本發明提供了重組腺病毒載體，其包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸，以在感染Mtb的對象體內誘導針對Mtb抗原的免疫應答。第五方面，本發明提供了重組腺病毒載體在製備治療患有活動性TB的患者的藥物中的應用，所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。第六方面，本發明提供了重組腺病毒載體在製備在感染Mtb的對象體內誘導針對Mtb抗原免疫應答的藥物中的應用，所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。如下實施方案涉及上述本發明的每一方面，除了根據上下文明確所述實施方案只涉及某些方面的情況。在某些實施方案中，對所述患者或對象進行藥物治療,例如通過給所述患者或對象施用能殺滅Mtb的一或多種抗生素藥物。在進一步的實施方案中，所述患者或對象正在進行藥物治療或適合藥物治療。在某些實施方案中，對所述患者或對象進行與標準藥物治療相比時間減少的藥物治療，例如抗生素藥物的施用方案與在不施用所述腺病毒的條件下給適合的患者或對象施用抗生素藥物的標準方案相比更短。在某些實施方案中，對所述患者進行的時間減少的藥物治療包括給所述患者施用治療性藥物如抗生素藥物的時間在大約I周至5個月之間，例如在2周至4個月之間。在某些實施方案中，給所述患者的標準藥物治療方案包括每日施用異煙肼、利福平、吡嗪醯胺和乙胺丁醇的組合，時間為2個月，隨後每日或每周三次施用利福平和異煙肼及有或無乙胺丁醇，時間為4個月。在某些實施方案中，在開始藥物治療後在給定時間在一組患者中測量的Mtb的細菌負荷與在同一時間點在未施用所述腺病毒條件下測量的負荷相比較低。在某些實施方案中，在減少時間的治療性藥物治療之後在一群患者中測量的活動性TB的復發率與未施用所述腺病毒的正常時間標準藥物治療方案相比相同或更低。在某些實施方案中，編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸編碼作為融合蛋白的這些抗原。在某些實施方案中，所述腺病毒是複製缺陷的人腺病毒血清型35。在某些實施方案中，所述腺病毒是複製缺陷的人腺病毒血清型26。在某些實施方案中，所述腺病毒載體以異源初免-加強(heterologousprime-boost)方案施用。在某些實施方案中，所述異源初免-加強方案包括施用人腺病毒血清型35和人腺病毒血清型26的載體。在某些實施方案中，患者所患TB是肺TB。在某些實施方案中，所述患者或對象感染多藥物抗性Mtb(MDR-TB)或者極端藥物抗性Mtb(XDR-TB)。在某些實施方案中，給所述患者或對象施用超過一次的包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體。在某些實施方案中，所述重組腺病毒載體的施用在所述患者或對象體內誘導針對由所述腺病毒內所述核酸編碼的至少一種抗原的CD8+T細胞應答。在某些實施方案中，所述⑶8+T細胞應答是多功能T細胞應答。在某些實施方案中，所述重組腺病毒載體的施用在所述患者或對象體內誘導針對由所述腺病毒內所述核酸編碼的至少一種抗原的CD4+T細胞應答。在某些實施方案中，感染Mtb的對象具有潛伏性TB。附圖簡述圖1:與安慰劑對照相比，在接受3X1010病毒顆粒(vp)的被接種者中用Ag85A混合肽刺激時，釋放IFNy或IL-2或TNF-α的CD8淋巴細胞百分比隨時間增加。圖2:與安慰劑對照相比，在接受3X1010病毒顆粒(vp)的被接種者中用Ag85B混合肽刺激時，釋放IFNy或IL-2或TNF-α的CD8淋巴細胞百分比隨時間增加。圖3:與安慰劑對照相比，在接受3Χ1010病毒顆粒(vp)的被接種者中用TB10.4混合肽刺激時，釋放IFNY或IL-2或TNF-α的CD8淋巴細胞百分比隨時間增加。圖4:與安慰劑對照相比，在接受3X10l0病毒顆粒(vp)的被接種者中用Ag85B混合肽刺激時，釋放IFNYHTNF-α的多功能CD8淋巴細胞百分比隨時間增加。圖5:證實Ad35.TB-S縮短化療時間作用的動物研究方案，詳細示出接種時機和免疫學研究。圖6:證實通過用Ad35.TB-S及隨後Ad26.TB-S進行異源初免-加強縮短化療時間作用的動物研究方案，詳細示出接種時機和免疫學研究。發明詳述如本領域技術人員已知，TB可以是潛伏性或活動性的，可以根據本領域技術人員已知的常規方法檢測和識別，如X光照相術、細菌或免疫學方法或這些方法的組合(見例如Mitchison,2005)0舉例的是痰液樣品的抗酸桿菌(AFB)塗片、分枝桿菌培養物、結核菌素皮膚測試及幹擾素-Y釋放測定。例如，AFB或分枝桿菌培養物也可用於確定治療作用。潛伏性TB是指Mtb菌存在於對象體內，但是機體的防禦機制使其未變成活動性TB。這意味著這種對象此時不具有任何症狀並且通常疾病不傳播至其它對象。潛伏性TB在某階段可成為活動性TB。活動性TB是指Mtb菌在生長中並導致症狀。感染通常發生在肺，稱之為肺TB。如果肺感染活動性TB，該疾病易於播散至其它對象。TB也可以播散至機體其它部分，稱之為肺外TB。肺外TB可包括播散性結核、淋巴結核、胸膜結核、泌尿生殖器結核、骨和關節結核及中樞神經系統結核。本發明原則上適於改良任何活動性TB的治療。在某些實施方案中，本發明的活動性TB是肺TB。HIV感染增加患TB的可能性，因此在某些實施方案中所述TB患者也可伴隨HIV感染。在其它實施方案中，所述TB患者不伴隨HIV感染。活動性TB的症狀可包括:超過2周的咳嗽，來自肺的稠厚、渾濁及有時血性粘液(稱作痰液)，疲倦及體重減輕，夜間盜汗及發熱，心跳加快，頸部腫脹(當頸部淋巴結受累時)，呼吸淺短及胸痛(罕見)。肺TB通常通過取痰液樣品檢測其中是否存在Mtb菌而進行診斷。有時可進行胸部X光照相以幫助發現肺TB。肺外TB可通過使用對感染的組織進行組織活檢或液體抽吸或者收集排洩物進行AFB塗片、培養及組織學檢測而發現。在本發明優選的實施方案中，本發明的患者是人。在其它實施方案中，所述患者可以是能被Mtb感染及在某些方面具有活動性TB的哺乳動物，例如家畜，或者嚙齒類動物如作為TB模型的小鼠。根據本發明，腺病毒用作治療性疫苗。用於治療性或預防性疫苗的腺病毒為本領域熟知，可以根據本領域技術人員熟知的方法產生。腺病毒載體可以通過使用作為載體DNA來源的腺病毒或嵌合腺病毒的任何種、株、亞型或種、株或亞型的混合物產生(見例如WO96/26281，WO00/03029)。本發明的腺病毒優選是人腺病毒。其可以是任何血清型。經鑑別的特別有用的人腺病毒載體是基於血清型11、26、34、35、48、49和50，如WO00/7007UW002/40665和WO2004/037294所述。已經發現腺病毒24(Ad24)是特別令人感興趣的，因為其示出是罕見血清型(W02004/083418)。在一優選實施方案中，用於本發明的腺病毒因此是選自如下的人腺病毒血清型:Adll、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。這種選擇人腺病毒作為疫苗載體的優勢是人不常被這些野生型腺病毒感染，從而針對這些血清型的中和抗體在人群中一般不太普遍存在。根據本發明特別優選的血清型是Ad35和Ad26。在另一優選實施方案中，腺病毒是猿猴、犬或牛腺病毒，因為這些病毒在被施用重組病毒的(人)宿主中也不遭遇先前存在的免疫性。猿猴腺病毒用於人基因治療或疫苗中的適用性為本領域技術人員熟知。除此之外，發現犬和牛腺病毒在體外感染人細胞，因此也可適合人體使用。特別優選的猿猴腺病毒是分離自黑猩猩的那些。例如包括C68(也稱作Pan9，US6,083,716)和Pan5、6和7(冊03/046124);也見WO03/000851。使用被認為是安全的並且可以懸浮生長至極高體積的細胞，使用不含有任何動物或人衍生成分的培養基，可以產生非常高效價的重組腺病毒。也已知重組腺病毒可引起針對由腺病毒基因組中異源核酸序列編碼的蛋白質的顯著的免疫應答。在腺病毒基因組中，編碼轉基因-在此為Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原-的核酸與表達控制序列可操縱地連接。這可例如通過將編碼所述轉基因的核酸置於啟動子控制下而實施。可以添加其他調節序列。為此一種方便常規的方式是將所述轉基因克隆進表達盒中，其可以許多形式來自市售的一些表達質粒，表達盒通常含有能使得所述核酸表達的序列，如增強子、啟動子、聚腺苷酸化信號等。一些啟動子可用於所述轉基因的表達，這些啟動子可包括病毒啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子等等。在真核細胞中獲得表達的合適啟動子的非限制性實例是CMV啟動子(US5，385，839)，哺乳動物EFl-α啟動子，哺乳動物遍在蛋白C啟動子，或者SV40啟動子。在某些實施方案中，驅動轉基因表達的啟動子是CMV立即早期啟動子，例如包含來自CMV立即早期基因增強子/啟動子的-735至+95位。聚腺苷酸化信號，如牛生長激素PolyA信號(US5，122，458)，可以存在於所述轉基因之後。施用本發明的腺病毒將使得Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原在施用所述腺病毒的患者細胞中表達。這將導致在患者中對於至少一種抗原的免疫應答。因此，本發明提供了這樣的方法和應用，其中編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸在患者中表達。在某些方面，本發明提供了這樣的方法和應用，由此針對Ag85A、Ag85B和TB10.4的至少一種、優選至少兩種、更優選所有三種抗原的免疫應答被誘導。優選地，所述腺病毒載體在病毒複製必要的腺病毒基因組的El區如Ela區和/或Elb區的至少一個必需基因功能是缺陷的。在某些實施方案中，所述載體在El區的至少一個必需基因功能及至少部分非必需的E3區是缺陷的。所述腺病毒載體可以是「多重缺陷的」，是指所述腺病毒載體在腺病毒基因的兩或更多個區域的每一個中的一或多個必需基因功能是缺陷的。例如，前述El缺陷的或者El、E3缺陷的腺病毒載體可進一步在E4區域的至少一個必需基因和/或E2區域(如E2A區域和/或E2B區域)的至少一個必需基因是缺陷的。如本領域技術人員已知，在腺病毒基因組的必需區域缺失的情況中，由這些區域編碼的功能需要反式提供，優選由生產細胞提供，即當腺病毒缺失部分或全部El、E2和/或E4區域時，這些區域必須要存在於生產細胞中，例如整合進基因組中，或者是所謂的輔助腺病毒或輔助質粒形式。在某些實施方案中，本發明的腺病毒缺失至少一部分El區，例如ElA和/或ElB編碼序列，並且進一步包含編碼Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的異源核酸。腺病毒載體的構建為本領域熟知，包括使用標準分子生物學技術，如在例如Sambrooketal.，MolecularCloning,aLaboratoryManual,2ded.，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)、Watsonetal.,RecombinantDNAj2ded.,ScientificAmericanBooks(1992)及Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995)以及本文提及的其它參考文獻中所述的那些技術。腺病毒載體、其構建方法及其增殖方法為本領域熟知，在例如美國專利5，559，099,5,837，511,5,846，782,5,851，806,5,994，106,5,994，128,5,965，541、5，981，225,6,040，174,6,020，191和6，113，913以及ThomasShenk,"AdenoviridaeandtheirReplication",M.S.Horwitz,"Adenoviruses",67和68章,Virology,B.N.Fieldsetal.,eds.,3ded.,RavenPress,Ltd.,NewYork(1996)及本文提及的其它參考文獻中描述。在優選的實施方案中，所述腺病毒是複製缺陷的，例如因為其含有基因組El區中的缺失。如果所述腺病毒是來自除了人腺病毒亞群C之外的亞群(例如Ad35來自亞群B或者Ad26來自亞群D)，優選將該腺病毒的E4-orf6編碼序列用人亞群C的腺病毒如Ad5的E4-orf6置換。這樣使得這種腺病毒在熟知的表達Ad5的El基因的互補細胞系如293細胞、PER.C6細胞等中增殖(見例如Havengaetal,2006；W003/104467，以其全文援引加入本文)。在某些實施方案中，所述腺病毒是人腺病毒血清型35，在其中已經克隆進編碼所述抗原的核酸的El區中有缺失，並且具有Ad5的E4orf6區。在其它實施方案中，所述腺病毒是人腺病毒血清型26，在其中已經克隆進編碼所述抗原的核酸的El區域中有缺失，並且具有Ad5的E4orf6區。如果所述腺病毒是屬於人亞群B，如Ad35、Ad34或Adl1，優選其保留腺病毒中ElB55K開放讀框的3』末端，例如pIX開放讀框直接上遊的166bp或者包含其的片段，如PlX起始密碼子直接上遊的243bp片段，在5』末端由Bsu36I限制位點標記，因為由於pIX基因的啟動子在這個區域內部分存在而增加了腺病毒的穩定性(見例如Havengaetal,2006；W02004/001032，援引加入本文)。本發明中使用的腺病毒包含Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原。這種腺病毒及其產生方式在先前的Havengaetal,2006,Radosevicetal,2007,WO2006/053871中描述，所述文獻均以其全部內容援引加入本文。在某些實施方案中，本發明的腺病毒包含編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原作為融合蛋白的核酸。在某些實施方案中，所述核酸以5』至3』順序編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原作為融合蛋白的全部開放讀框。在其它實施方案中，所述腺病毒包含Ag85A、Ag85B和/或TB10.4抗原的編碼序列的片段，該片段包含這些Mtb蛋白的抗原性部分或表位。在某些實施方案中，所述腺病毒包含編碼由US2009/0123438Al所述SEQIDN0:7的1-676位胺基酸提供的融合蛋白的核酸，所述文獻以其全部內容援引加入本文。在某些實施方案中，編碼所述抗原的核酸序列已經進行密碼子優化以在人中表達。在某些實施方案中，所述腺病毒包含包含US2009/0123438A1所述SEQIDNO:4的13-2043位核苷酸的核酸序列，所述文獻以其全部內容援引加入本文。本發明中使用的腺病毒因此作為TB的預防性疫苗而已知，本發明首次揭示了其在患有活動性TB的患者中用作治療性疫苗。這種應用是不能預料的且是令人驚奇的，因為看起來存在由Mtb產生的宿主細胞免疫性針對Mtb抗原的誘導的耐受性(Weicholdetal,2007)，在下文描述的臨床試驗中針對Ag85A和Ag85B抗原進一步示出，令人驚奇地發現耐受性被本發明的疫苗破壞。不能被預料的另一原因是可用作預防性TB抗原的抗原作為治療性TB抗原不見得是有效的(見例如Andersenetal，US2004/0057963)，強調了對這些疫苗的免疫應答的不可預測性。腺病毒可以在本領域熟知的細胞培養系統中製備、收穫和純化，例如援引加入本文的WO2010/060719描述了獲得及純化大量重組腺病毒如用於本發明中的那些腺病毒的合適方法。產生和純化腺病毒的進一步方法在例如WO98/22588、WO00/32754、WO04/020971、US5，837，520、US6，261，823、WO2005/080556和WO2006/108707中描述，所述文獻援引加入本文。為了施用給人，本發明可採應用藥物組合物，其包含所述腺病毒及藥物可接受的載體或賦形劑。在本文中，術語「藥物可接受的」是指所述載體或賦形劑在所用劑量和濃度下在施用的對象中不導致不希望的或有害的作用。這種藥物可接受的載體和賦形劑為本領域熟知(見Remington’sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPublishingCompany[1990]!PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.FrokjaerandL.Hovgaard,Eds.,Taylor&Francis[2000]；及HandbookofPharmaceuticalExcipients,3rdedition,A.Kibbe,Ed.,PharmaceuticalPress[2000])。純化的腺病毒優選作為無菌溶液配製和施用。無菌溶液是通過滅菌過濾或者本領域已知的其它方法製備的。然後可將所述溶液凍幹或填充進藥物劑量容器中。所述溶液的pH通常在pH3.0-9.5範圍，例如pH5.0-7.5。所述腺病毒或其免疫原性部分典型是在具有合適的藥物可接受的緩衝液的溶液中，所述腺病毒溶液也可以含有鹽。在某些實施方案中，存在去汙劑。在某些實施方案中，所述疫苗可以配製成可注射製備物。這些配製物含有有效量的腺病毒，是無菌液體溶液、液體懸浮液或者凍幹形式，以及任選含有穩定劑或者賦形劑。所述疫苗也可以氣霧化以用於鼻內施用(見例如WO2009/117134)。例如，所述腺病毒可以貯存在這樣的緩衝液中，其也用於腺病毒世界標準(AdenovirusWorldStandard,Hogansonetal,Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002，p.43-48):20mMTrispH8,25mMNaCl,2.5%甘油。適於施用給人的另一可用配製物緩衝液是20mMTris,2mMMgCl2,25mMNaCl,蔗糖10%w/v，聚山梨醇酯-800.02%w/vo顯然，可以使用許多其它緩衝液，適於純化的(腺)病毒製備物貯存和藥物施用的一些配製物實例可例如見於歐洲專利0853660、美國專利6，225，289及國際專利申請TO99/41416、TO99/12568、TO00/29024、TO01/66137、WO03/049763、WO03/078592、WO03/061708所述。在某些實施方案中，所述疫苗進一步包含佐劑。佐劑為本領域已知，用以進一步增加對於應用的抗原性決定簇的免疫應答，包含腺病毒和佐劑的藥物組合物例如在WO2007/110409中揭示，所述文獻援引加入本文。舉例的合適的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁和/或磷酸鋁；油-乳狀液組合物(或者水包油組合物)，包括鯊烯-水乳狀液，如MF59(見例如WO90/14837);皂苷配製物，例如QS21及免疫刺激複合物(ISCOMS)(見例如US5,057,540；W090/03184，WO96/11711，WO2004/004762,WO2005/002620);細菌或微生物衍生物，例如單磷醯脂質A(MPL)，3-0-去醯基化MPL(3dMPL)，含有CpG-基序的寡核苷酸，ADP-核糖基化細菌毒素或其突變體，如大腸桿菌不耐熱腸毒素LT，霍亂毒素CT，百日咳毒素PT，或者破傷風類毒素TT。佐劑的進一步實例在WO2007/110409中給出。在其它實施方案中，本發明使用的疫苗不包含進一步的佐劑。在本發明的方法或應用中，如本領域技術人員已知，在一個施用期間提供給患者的腺病毒的劑量可以變化，通常在IXIO7病毒顆粒(vp)至IXIO12Vp之間，優選在IXIO8Vp至IXIO1Vp之間，例如在3XIO8至5XIO10vp之間，例如在IO9至3XIOicVp之間。本發明疫苗的施用可以使用標準施用途徑進行。非限制性的實施方案包括胃腸外施用，如通過注射，例如進血流中、皮內、肌肉等，或者黏膜施用，如鼻內、口腔等。在一個實施方案中，所述疫苗通過肌肉注射進三角肌中施用。本領域技術人員已知施用本發明疫苗的各種可能性，以誘導對於所述疫苗中至少一種抗原的免疫應答。在本發明中，患有活動性TB的患者通過施用本發明的腺病毒治療，稱之為免疫治療或治療性接種。本文使用的治療是治療性處理，即目的在於改善患者的狀況，優選完全解決TB。本發明的治療包括免疫治療性接種，即目的在於誘導針對Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原中至少一種的免疫原性應答，優選針對其中至少兩種抗原，更優選針對所有三種抗原。在優選的實施方案中，所述治療降低患者中Mtb感染水平。在優選的實施方案中，所述治療使得患者的活動性TB治癒,更優選所述治療最終導致患者中不存在Mtb感染。相反,現有技術通過將疫苗施用給未感染Mtb和/或未患有活動性TB的患者而使用相似疫苗目的在於防止或預防TB。在這種群體中的免疫應答和潛在作用可以是極為不同的，且不能預測在Mtb-感染的患者中免疫治療的作用，尤其是在患有活動性TB的患者中。因此在某些方面中，本發明提供了在感染Mtb的對象體內誘導針對Mtb抗原的免疫應答的方法，所述方法包括給所述對象施用重組腺病毒載體，所述載體包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸，以在所述對象體內表達所述抗原及誘導對於至少一種抗原的免疫應答。本發明的一方面是提供治療患有活動性TB的患者的這種方法。在本發明的某些方面中，所述對象或患者通過給其施用能殺滅或至少顯著抑制Mtb生長的一或多種藥物而進一步治療。因此，本發明還包括免疫治療與藥物治療組合，目的在於防止對象發生活動性TB或者治癒活動性TB患者,優選去除所述對象或患者的任何Mtb感染。在感染Mtb及具有潛伏性或活動性TB的患者組中用本發明的疫苗進行的臨床試驗證實本發明的免疫治療性接種不導致Koch’s現象。Koch’s現象被認為是由於Thl應答增強導致Thl-相關細胞因子釋放觸發含有Mtb的損害壞死而發生的(Churchyardet.al，2009)。由RobertKoch用結核菌素治療的許多TB患者受累於全身性反應，如譫妄、昏迷或絞痛(Burke，1993)。在一些情況中，死亡出現在晚期空洞性肺部疾病患者中(Burke,1993)。活動性TB通常用藥物治療。TB藥物治療的目的是通過滅菌及防止治療後疾病復發而降低Mtb負荷。最大量的藥物用於治療的初始階段，以在細菌群體處於最大時期時防止抗性菌株出現(MitchisonDA，2005)。藥物抗性危險隨著時間隨著所述桿菌負荷的降低而降低。因此，剩餘的TB治療期與治療初始階段相比使用較少的藥物組合(MitchisonDA,2005)。本文所述藥物治療包括給患者施用一或多種抗生素，通常是這些抗生素的組合。這些抗生素能殺滅或至少顯著抑制Mtb生長。本領域技術人員已知及可利用一些這樣的抗生素，其能對於每個患者作出最佳選擇。通常治療方案進行6個月，每日施用抗生素。如果在6個月後測試仍示出活動性TB感染，則將所述治療繼續進行2或3個月。DOT可用於幫助患者遵循所有指導及跟上複雜及長期的治療。推薦使用一種以上的藥物以預防MDR-TB。可用於治療活動性TB的藥物治療中的抗生素包括異煙肼、利福平、吡嗪醯胺和乙胺丁醇。治療中可用的其他抗生素包括對氨基水楊酸，鏈黴素，氨硫脲，氟喹諾酮類，PA824,R207910,利福布汀(rifabutin),利福噴汀(rifapentine),阿米卡星(amikacin),捲曲黴素(capreomycin),環絲氨酸，乙硫異煙肼,左氧氟沙星(levof1xacin),莫西沙星(moxifloxacin)。每種抗生素的施用劑量通常為本領域技術人員熟知，通常為至少與提供殺菌活性的最小有效劑量同樣高(見例如Mitchison，2005)。標準治療是以每日給予四種藥物開始，進行2個月。治療的前兩個月稱作初始階段，每日服用異煙肼、利福平、吡嗪醯胺和乙胺丁醇。在某些方案中，使用鏈黴素代替乙胺丁醇，特別是對於不能服用乙胺丁醇的那些人，但是通常優選乙胺丁醇，以避免HIV傳播。接下來的階段稱作持續階段，所述治療減為利福平和異煙肼，每日或每周三次。在某些情況中，在此階段也加入乙胺丁醇。這個階段在標準方案中進行4個月。在一些情況中，這個階段延長至9個月或如果需要則更長。在此期間使用的藥物數目依賴於敏感性測試結果而定。另一標準方案包括8個月治療方案，其中2個月初時階段使用異煙肼、利福平、吡嗪醯胺和鏈黴素，接下來6個月繼續使用氨硫脲和異煙肼；這個方案有時乙胺丁醇被取代為氨硫脲以及鏈黴素。如果所述治療由於藥物抗性而未起作用，當檢測示出導致TB的細菌仍是活性的時，如果需要，可嘗試不同的藥物組合。如果治療未成功可發生復發，這種復發通常發生在治療後6-12個月內。復發後的治療基於疾病的嚴重性及在第一次治療期間使用的藥物。因此，標準治療對於不同患者可不同，但是仍是本發明的標準治療，本領域技術人員熟知且常規地根據情況決定在個體病例中需要哪種治療。這些技術人員可遵循WHO關於TB標準藥物治療的建議。治療活動性TB的一些方案參見援引加入本文的Mitchison，2005。所述標準藥物治療可因此通過本發明的方法而顯著縮短。在某些實施方案中，本發明的治療性接種可使藥物治療冗餘(redundant)，但通常本發明的藥物治療持續至少一周、至少兩周、至少三周。在某些實施方案中，與標準藥物治療方案相比，藥物的施用可縮短至少一個月，至少兩個月或更多。在某些優選的實施方案中，本發明的標準藥物治療方案包括每日施用異煙肼、利福平、吡嗪醯胺和乙胺丁醇的組合，給予2個月，隨後每日或每周三次施用利福平和異煙肼及有或無乙胺丁醇，給予4個月，所述標準藥物治療可以縮短為總長少於5個月、4個月或更少、3個月或更少、2個月或更少、6周或更少、5周或更少、4周或更少。這可以通過縮短持續階段或初始階段或者這二者的時間而實現。也可以施用與正常相比更少量的藥物，更少的不同藥物的組合，或者更低的頻率。明顯地，這是活動性TB治療中的突破，因為其顯著縮短了患者需要服用治療性藥物的時間，這將導致較低的成本及重要的是降低物流負擔及治療的複雜性。原則上，所述藥物治療與其它疾病的標準抗生素治療更相似。使用本發明的方法，與活動性TB的標準藥物治療相比，需要DOT的時間更有限，在優選的實施方案中，根本不再需要DOT。不受理論的限制，假設本發明的方法破壞患者的耐受性，由此在大多數Mtb細菌已經通過治療性藥物方案殺滅之後，免疫系統能除去剩餘的細菌，與在抗生素治療後免疫系統通常對於其它細菌的作用一樣。當在一群患者中測量時，當在例如用藥物方案治療之後6-24個月測量時，這導致活動性TB的復發率顯著降低。標準方法的復發率在大約0-2%之間。如果標準藥物方案縮短為4個月，在24個月復發比例在8-11.8%之間(治療肺結核中6個月和4個月的化療方案臨床試驗，1981)。在優選的實施方案中，本發明包括施用本發明的治療性疫苗聯合治療性藥物施用，給予時間與標準藥物施用時間相比顯著減少，獲得與沒有治療性接種的相同藥物治療觀測到的復發率相比顯著降低的復發率。優選地，本發明的縮短的藥物治療方案的復發率與6個月的標準藥物治療方案的復發率相同或更低。在進一步的實施方案中，本發明的免疫治療性接種組合藥物治療使得在指定時間與沒有免疫治療性接種的相同藥物治療方案治療後相同負荷相比其細菌負荷降低。復發率可例如作為細菌學復發率進行測量，在特定時間如在開始或結束藥物治療後24個月或5年通過陽性痰培養測量。本發明的治療性疫苗的施用原則上可以在治療性藥物方案之前進行，但是由於降低的細菌負荷而優選在治療性藥物方案期間或之後進行，所述治療性藥物方案在這種情況中是指通常施用抗生素的幾個月的時間。在某些優選的實施方案中，所述疫苗是在開始藥物治療後0-4個月內施用，例如在開始藥物治療後大約I周，或者大約2、3、4、5、6周，或者大約2個月，或者大約3個月，或者大約4個月。在其它實施方案中，所述疫苗在開始藥物治療後4個月以上的時間施用，例如在開始藥物治療後5、6、7、8、9個月以上的時間，甚至可以在藥物治療已經停止後施用，例如在開始藥物治療後I年或更長時間，例如以防止活動性TB復發。在其它實施方案中，所述疫苗也可以在指定時間點給感染後但未診斷具有潛伏期TB的對象施用。在某些實施方案中，疫苗施用一次以上，即使用初免-加強方案施用治療性疫苗。在其中施用疫苗一次以上的情況中，關於上述治療性藥物施用的疫苗施用時間是指疫苗的第一劑。在其中施用疫苗一次以上的某些實施方案中，疫苗的第二劑可以在施用第一劑疫苗之後一周或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後兩周或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後三周或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後一個月或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後六周或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後兩個月或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後三個月或更長時間施用，在施用第一劑疫苗之後四個月或更長時間施用等，直至在施用第一劑疫苗幾年後施用。在某些實施方案中，疫苗的第二劑是在施用第一劑疫苗之後42天施用。在施用一劑以上疫苗的實施方案中，所述疫苗彼此可以是異源的，例如使用不同的腺病毒血清型初免和加強接種(見例如WO04/037294)，例如用人Ad35初免及用人Ad26加強，用人Ad26初免及用人Ad35加強等。這被稱作異源初免加強方案。然後不同腺病毒血清型的載體優選是本發明的每個載體，即包含編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸。也可以使用不同載體進行初免或加強，例如用本發明的腺病毒初免及用例如編碼相同或其它TB抗原的DNA或MVA加強，反之亦然。而且，在Mtb抗原中所述初免和加強疫苗可以不同，例如初免或加強疫苗可省略來自本發明腺病毒的Ag85A、Ag85B或TB10.4抗原的一或多個。在其它實施方案中，所述疫苗可以是彼此同源的，即施用相同的疫苗作為初免和加強免疫。也可以施用疫苗兩次以上，例如3次、4次等，由此第一次初免施用隨後是一次以上的加強施用。此外，本發明的治療性疫苗甚至可以在用BCG或重組形式BCG初免之後使用，所述BCG可用於在患者生命早期進行接種。在其它實施方案中，本發明的疫苗僅施用一次。已經觀測到將本發明的疫苗施用給患有活動性TB的患者產生對由所述疫苗編碼的Mtb抗原的⑶8+T細胞應答。因此在某些方面，提供了本發明的方法和應用，其中重組腺病毒載體的施用在患者中誘導了針對由所述腺病毒載體編碼的至少一種抗原的CD8+T細胞應答，意味著所述患者具有⑶8淋巴細胞釋放細胞因子，例如IL-2、IFN-Y或TNF-α。在某些實施方案中，所述⑶8+T細胞應答在第二次施用重組腺病毒載體後被加強。在某些實施方案中，所述CD8+T細胞應答是多功能的，是指T淋巴細胞產生一種以上的細胞因子。這種多功能T淋巴細胞可增加本發明治療的效力。也已經觀測到施用本發明的疫苗產生針對由所述疫苗編碼的Mtb抗原的CD4+T細胞應答，特別是在用第二劑腺病毒加強後。因此在某些方面中，提供了本發明的方法和應用，其中重組腺病毒的施用在患者中誘導了針對由所述腺病毒載體編碼的至少一種抗原的CD4+T細胞應答，意味著該患者具有CD4淋巴細胞釋放細胞因子，如IL-2、IFN-y或TNF-α。在某些實施方案中，所述⑶4+T細胞應答在第二次施用重組腺病毒載體後被加強。測量抗原特異性細胞免疫應答如CD8+和CD4+T細胞應答的方法為本領域技術人員熟知及是常規的，包括例如ELISP0T，細胞內細胞因子染色(ICS)，及多重細胞因子測定(見例如Havengaetal,2006；Radosevicetal,2007；Lemckertetal,2005;0，Connor,2004)。多藥物抗性TB(MDR-TB)被定義為對利福平和異煙肼具有抗性(WHO定義)。極端藥物抗性TB(XDR-TB)被定義為除了MDR-TB之外對任何氟喹諾酮及三種注射用二線藥物(捲曲黴素，卡那黴素和阿米卡星)中的至少一種具有抗性。治療MDR-TB/XDR-TB的策略根據藥物易感性測試的結果而不同，應含有已確定或幾乎確定臨床效力的至少4種藥物。所述治療包括6-10個月的注射藥物階段，隨後口服藥物治療，治療總持續時間為18-24個月(WHO)。本發明的免疫治療性接種防止治療後TB復發，特別是由(多)藥物抗性形式Mtb所致TB復發。所述接種適於治療活動性TB和/或降低由MDR-TB或XDR-TB所致復發頻率，以及治療潛伏性TB。本發明還提供了這樣的優勢，即可以用包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體、特別是用如本文所述rAd35載體進行TB接種，不用對(活動性)TB的存在進行層化或檢測，因為如在不同的臨床試驗中評估的，在給活動性TB患者或者潛伏性TB患者施用所述疫苗時均無Koch’s現象。因此，本發明還提供了通過給對象施用包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體而在暴露後預防TB的方法。這種對象已經暴露但仍不具有TB的臨床跡象，或者具有未診斷的TB，或者已經具有TB臨床跡象及因此具有活動性TB。在某些實施方案中，所述對象可具有潛伏性TB。施用本發明的疫苗可延緩或防止該疾病的發生或進展。對於潛伏性TB，本發明的免疫治療性接種也可組合藥物治療。舉例的治療潛伏性TB的標準藥物治療方案包括施用異煙肼9個月，或者施用利福平4個月。同樣，這些標準藥物治療方案根據本發明可縮短，例如縮短至少一個月、至少兩個月、至少三個月等。本發明在如下實施例中進一步闡述。所述實施例不以任何方式限制本發明。其只用於說明本發明。實施例實施例1:在人對象中用基於Ad35的TB疫苗(Ad35.TB_S)進行臨床試驗在先前或目前具有結核病的個體中進行了針對人對象的隨機雙盲安慰劑-對照臨床試驗以評估Ad35.TB-S的安全性和免疫原性(Havengaetal,2006；Radosevicetal,2007；W02006/053871)。進行這項試驗是為了保證所述疫苗在先前未認定的或具有活動性結核病的對象中不激發嚴重不利反應，如Koch’s現象。通過確保所述疫苗在臨床證實患有結核病的患者中的安全性，在今後的研究中所述疫苗然後可廣泛施用給更大群體而不需要在對象中進行廣泛TB檢測。所述研究被設計為劑量增加研究，其中疫苗劑量在連續患者組中增加。患者相繼招募，接受最低劑量疫苗的患者首先招募並檢測。相反，接受最聞劑量疫苗的患者在已經確定較低劑量疫苗的安全性譜之後最後招募。對招募者基於開始TB治療的時間進行分層。「治療中」層次中的對象由在研究第O天之前患有活動性TB及目前經歷1-4個月治療的個體組成。「治療後」層次中的對象在研究第O天之前已經開始TB治療至少12個月。對所述對象進行分層，因為不清楚患有活動性TB或者治癒的TB的個體在接種含有TB抗原後是否處於發生Koch’s現象的較高危險。來自「治療中」和「治療後」層次的對象在研究第O天均通過肌肉(IM)接種一次Iml的3x108(1組)和3xl09(2組)病毒顆粒(vp)。3組的對象在研究第O天和研究第42天接種兩劑3XIOltVp。安慰劑對照接種無菌緩衝溶液，其與用於配製疫苗的緩衝液相同(20mMTris,2mMMgCl2,25mMNaCl,鹿糖10%w/v,聚山梨醇酯-800.02%w/v)。在研究結束時，來自「治療中」和「治療後」組的各31名患者接受Ad35.TBS。因此，在這項研究中共62名TB感染的患者接受Ad35.TB-S疫苗，對這些患者跟蹤6個月以上。為了評估疫苗在患者中的`安全性，研究人員進行連續注射部位檢測、肺功能測試、胸片(CT掃描)、血清血液學、化學及監測收集徵求(solicited)和未徵求(unsolicited)的不良事件。在「治療中」與「治療後」層次中在第一劑注射後經常觀測到輕度至中度注射部位反應。但是，在肺功能檢測中未徵求的不利事件和差異的頻率在劑量組之間或各層次之間是不明顯的。重要地，在所有檢測的疫苗劑量，Ad35.TB-S均不引起與Koch’s現象相似的任何免疫病理學，這表明所述疫苗在用於具有肺TB病史的成人中是安全的。所述疫苗的免疫原性通過用含有TB抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的肽集合刺激冷藏保存的在特定時間點收集的周圍血單個核細胞(PBMC)進行評估。隨後進行胞內細胞因子染色(ICS)及流式細胞計量術以鑑別在用上述TB抗原刺激時CD4和CD8淋巴細胞是否產生細胞因子IL-2、IFN-Y或/和TNF-α。「治療中」層次的免疫原性研究結果在圖1_4中示出。圖1-4示出在來自第3組的「治療中」層次的對象的ICS研究結果，給所述對象在研究第O天和42天施用3XIOicVp的疫苗。ICS測量了在用含有抗原85A(圖1)、85B(圖2和4)及TB10.4(圖3)的混合肽刺激時釋放IFNy或TNFα或IL-2的⑶8淋巴細胞的百分比。在第O天與84天之間的特定時間點進行測量(圖1-4)。在所有劑量均發現應答，且呈現出劑量依賴性，及證實加強作用。對於所有測試的三個抗原，接種組與安慰劑組相比檢測到較高百分比的⑶8淋巴細胞細胞因子應答(圖1-4)。使用Ag85B，這些增加的應答特別明顯(圖2)。在較後的時間點，一些接種的對象產生1%以上的Ag85B-特異性⑶8細胞，在一些情況中高到3%(圖2)。分泌一種以上細胞因子的多功能T淋巴細胞在針對TB疾病的天然宿主免疫性中被認為是重要的T細胞亞集。令人感興趣的是用Ad35.TB-S接種導致表達IFNyHTNFα的多功能⑶8Τ淋巴細胞百分比增加(圖4)。描述在用Ag85B刺激時存在表達IFNYJ^TNFa的⑶8細胞的ICS測定結果可見於圖4，其中當與安慰劑對照組相比時，在第O天和第42天接種後Ag85B-特異性多功能⑶8細胞的百分比明顯增加。特別相關的是觀測到來自安慰劑組的源自Mtb感染但未接受Ad35.TB-S接種的個體的CD8淋巴細胞對於抗原85A、85B或TB10.4的刺激應答較低(圖1_4)，指明針對這些Mtb抗原的明確的淋巴細胞耐受性。總之，這些免疫學研究的結果強烈表明所述疫苗在Mtb-感染的個體中是免疫原性的，所述個體通常不能激發針對Mtb抗原的免疫應答。這可通過對比安慰劑組中對象與接種Ad35.TB-S的對象的免疫應答而明顯觀測到(圖1-4)。這個試驗的結果提示所述疫苗具有破壞由Mtb感染誘導的針對宿主誘導的免疫應答的耐受性的固有能力，而不導致表現為Koch’s現象的免疫病理學損害。這是新的重組TB疫苗在具有肺TB病史的個體中進行的首次試驗，示出良好的安全性記錄，具有誘導破壞耐受性的免疫應答的能力。一個獨立的臨床試驗已經證實相同疫苗在潛伏性TB對象中的安全性和免疫原性(數據未示出)，證實所述疫苗也可安全(不誘導Koch’s現象)用於這種對象中，以誘導針對所述疫苗中至少一種、優選多種抗原的免疫原性應答。實施例2:Ad35.TB-S疫苗對小鼠中結核病藥物治療的縮短治療時間作用的觀點研究的證實在此，描述了顯示Ad35.TB-S的縮短TB化療時間的作用的方法。所述方法利用建立的進行TB藥物化療的小鼠模型，對其進行適應以適合用Ad35.TB-S疫苗的實驗。在前2個月用異煙肼、利福平和吡嗪醯胺治療人，隨後在剩餘的4個月用利福平和異煙肼治療導致疾病復發率為l-2%(Neurmberger，2008；Foxet.al,1999)。在小鼠中，相似的治療導致0-10%的復發率(Neurmberger,2008)。在近來的研究中，用這個6個月標準方案治療的BALB/C小鼠呈現出0%復發比例，當治療縮短至4個月時增加至90%(Williamset.al,2009)。在這項研究中，復發被定乂為在治療完成3個月後在將完整肺勾眾鋪板後分離出I個或更大的CFU(Williamset.al,2009)。基於Williamset.al的方法,設計如下實驗以檢測當治療縮短至最多4個月時，包含編碼Mtb的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的核酸的重組腺病毒載體(在此為Ad35.TB-S)降低復發可能性的能力(圖5)。將BALB/C小鼠通過噴霧途徑用Mtb菌株H37Rv感染2周，之後分成5個不同組。第一組作為陽性對照(PC)，其中動物用標準6個月WHO治療方案治療，已知復發率為大約0%。第二組由用4個月WHO治療方案治療的小鼠組成，作為陰性對照組(NC-WHO)，已知當時復發率為大約90%。第三組包含用TB感染但未治療的動物，作為Mtb感染對照(NC-1)。第四組由用4個月WHO方案治療及在所述治療方案的第I和2個月用Ad35空白載體接種的動物組成(NC-V)。NC-V組作為陰性對照以監測任何與接種相關的不利作用。為了檢測Ad35.TB-S接種對防止復發的作用，將一組動物用4個月的WHO方案治療及在治療開始後I和2個月用Ad35.TB-S接種(T-V)。基於先導研究中的免疫原性確定這項研究中疫苗和空白載體對照的1010病毒顆粒的劑量是最佳的。如果用Ad35.TB-S接種在TB化療4個月後導致與單獨的標準化療相比更有效的殺菌活性，接種的動物在治療停止後的復發比例低於未接種的對照(T-V對NC-WHO和NC-V)。在圖5中示出的特定時間點，進行ELISpot測定(RadosevicKet.al,2007；HavengaMet.al.,2006；LemckertAAet.al,2005)以確定對於疫苗抗原的T細胞應答。特別地，將分離自每組動物的脾細胞用在疫苗內編碼的來自結核分枝桿菌的抗原如Ag85A、Ag85B和TB10.4刺激。對於Ag85A，使用已知的⑶4和⑶8肽以鑑定在本研究中刺激的精確T細胞亞集。在用抗原刺激時IFN-Y分泌的數量級用作T細胞應答性的指標。ELISpot研究結果表明當與對照組(NC-WH0和NC-V)相比時，在T-V組中所述疫苗顯著加強針對所有檢測的抗原的免疫應答。對於幾乎所有使用的抗原，在T-V組中由接種誘導的免疫應答明顯高於NC-1組，後者含有更高的全身性細菌負荷。在疫苗T-V組內對Ag85A的⑶8應答也一致地較高。這些有希望的免疫原性結果提示所述疫苗當在小鼠中用作TB化療的輔助手段時能克服慢性TB感染所致的T細胞無應答性。為了支持得自免疫原性ELISpot研究的數據及鑑別保護作用的潛在聯繫，在進行ELISpot分析的每個時間點進行了多重細胞因子分析。對得自所有組中動物的肺樣品進行組織病理學分析以檢測可能與用Ad35.TB-S接種相關的肺病理學。對於所有實驗而言，來自初次用於實驗的小鼠的樣品作為基線對照。在迄今為止的所有案例中，與對照組相比在接種的T-V組中均沒有觀測到免疫病理學。這些結果證實當所述疫苗在嚴密控制的小鼠感染模型中在TB感染中使用時，其具有與在人體試驗中相同的極佳的安全性譜。預期這個實驗證實在化療方案中加入疫苗導致當與僅用標準化療方案相比時復發率降低，這是由於治療期間由所述疫苗激發的增強的免疫應答所致。總之，這些結果表明Ad35.TB-S可以與化療聯合使用以縮短治療持續時間和/或復發率和/或降低細菌負荷。抗生素治療時間長度、使用的抗生素及用腺病毒疫苗的接種時機在這個模型中易於變化。例如，用抗生素治療的時間長度縮短為3個月，2個月，6周，4周，及如果認為有效的更短時間。實施例3:在小鼠TB治療模型中通過Ad35.TB-S與Ad26.TB-S疫苗的異源加強的治療性接種的作用首次異源初免-加強疫苗由牛津的AdrianHill小組在人體內進行試驗(Schneideretal.1998)，試驗設計為研究預防性疫苗針對瘧疾的免疫原性。然後觀測到用攜帶相同抗原的不同載體的初免和加強導致由於記憶T細胞增殖所致的明顯增強的免疫應答。為了檢測用Ad35初免及用Ad26加強在縮短TB治療時間時是否明顯導致免疫原性增強以及復發比例下降，在實施例2所示研究中加入兩個額外臂(arm)(圖6)。在一個臂中，在4個月治療結束時另外給予含有與Ad35.TB-S相同抗原的Ad26.TB-S接種。如果Ad26.TB-S加強免疫在此感染階段增強免疫應答並靶向緩慢生長的細胞內持留菌，則在此臂中在該研究結束時動物復發比例應該甚至低於在治療I和2個月接受兩次Ad35.TB-S接種的實驗組。為了對照單獨的Ad26載體的作用，加入另一個臂。這個Ad26對照組預期復發比例與接受兩次單獨的Ad35.TB-S接種的組(T-V)相同。為了確定Ad26.TB-S加強是否導致免疫原性增強，在免疫之前及在接種之後2周進行ELISpot測定，如圖6所示。ELISpot研究結果高度支持Ad26.TB-S接種導致顯著加強T細胞應答，超過在治療期間用初始Ad35.TB-S接種可見的最高應答。相反，對照載體不激發任何加強效應，證實所述免疫應答靶向所述載體內包含的抗原。如實施例2所述，在每個時間點取組織病理學樣品以保證沒有由於用Ad26.TB-S加強所致的免疫病理學發生。參考文獻BurkeDS.0fpostulatesandpeccadiI1es:RobertKochandvaccine(tuberculin)therapyfortuberculosis.Vaccine.1993;11(8):795-804.CardonaPJ.RUT1:anewchancetoshortenthetreatmentoflatenttuberculosisinfection.Tuberculosis(Edinb).2006May-Jul;86(3-4):273-89.Clinicaltrialof6-monthand4-monthregimensofchemotherapyinthetreatmentofpulmonarytuberculosis:theresultsupto30months.Tubercle.1981；62(2):95-102.ChurchyardGJ，KaplanG，FallowsD，WallisRSjOnyebujohP，RookGA.Advancesinimmunotherapyfortuberculosistreatment.ClinChestMed.2009Dec;30(4):769-82.FanM，ChenXjWangK，etal.AdjuvanteffectofMycobacteriumvaccaevaccineonrecurrenttreatedpulmonarytuberculosis:ameta-analysis.ChineseJournalofEvidence-BasedMedicine.2007；7(6):449-55FoxWjEllardGA，MitchisonDA.StudiesonthetreatmentoftuberculosisundertakenbytheBritishMedicalResearchCounciltuberculosisunits，1946—1986，withrelevantsubsequentpublications.1ntJTubercLungDis.19990ct;3(10Suppl2):S231_79.HaSJ，JeonBY,YounJIjKimSC，etal.ProtectiveeffectofDNAvaccineduringchemotherapyonreactivationandreinfectionofMycobacteriumtuberculosis.GeneTher.2005Apr;12(7):634-8.HavengaMjRVogels，DZuijdgeestjKRadosevicjetal.2006.Novelreplication-1ncompetentadenoviralB-groupvectors:highvectorstabilityandyieldinPER.C6cells.J.Gen.Virol.87:2135-2143.LemckertAA，SumidaSM，HoltermanLjVogelsR，etal.1mmunogenicityofheterologousprime-boostregimensinvolvingrecombinantadenovirusserotype11(Adll)andAd35vaccinevectorsinthepresenceofanti_Ad5immunity.JVirol.2005Aug;79(15):9694-701LowrieDB，TasconRE,BonatoVLjLimaVMjetal.TherapyoftuberculosisinmicebyDNAvaccination.Nature.1999Jul15;400(6741):269-71.MitchisonDA.2005.Thediagnosisandtherapyoftuberculosisduringthepast100years.AmJRespirCritCareMed171:699-706.NuermbergerE.Usinganimalmodelstodevelopnewtreatmentsfortuberculosis.SeminRespirCritCareMed.2008Oct;29(5):542-51OiConnorKAjHolguinA,HansenMK，MaierSFjWatkinsLR..Amethodformeasuringcytokinesfromsmallsamples.Brain,BehaviourandImmunity.2004,18(3);274_280RadosevicKjCWWielandjARodriguez,GJWeverlingjetal.2007.Protectiveimmuneresponsestoarecombinantadenovirustype35Tuberculosisvaccineintwomousestrains:CD4andCD8T—cellepitopemappingandroleofgammainterferon.1nfectImmunity75:4105-4115.Schneider,J.etal.Enh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