永生化幹細胞以及以其生成物為有效成分的藥物組合物和藥物製劑的製作方法

2023-07-26 16:33:41 2

永生化幹細胞以及以其生成物為有效成分的藥物組合物和藥物製劑的製作方法
【專利摘要】本發明的目的在於提供可產生具有由種種原因所致的各種組織的再生能力的生長因子的永生化幹細胞及其產生方法。此外，其目的在於提供損傷組織復原用藥物組合物和藥物製劑、以及上述培養上清的經皮吸收方法。本發明提供一種永生化幹細胞，其是如下選擇的：將選自由哺乳類的間葉細胞、初生胚和體細胞組成的組中的幹細胞分離出來；對上述幹細胞進行初期培養，得到原代培養細胞，向該原代培養細胞中導入4種基因，製作基因導入細胞；從上述基因導入細胞中以STRO-1的表達為指標來選擇該永生化幹細胞。本發明還提供損傷組織復原用藥物組合物和藥物製劑，其含有該永生化幹細胞的培養上清作為有效成分。
【專利說明】永生化幹細胞以及以其生成物為有效成分的藥物組合物和 藥物製劑

【技術領域】
[0001] 本發明涉及牙髓來源的永生化幹細胞以及以其生成物為有效成分的藥物組合物 和藥物製劑。更詳細地說，本發明涉及對於由自然脫落的或拔除的人乳牙或恆牙的牙髓得 到的幹細胞進行修飾所得到的永生化幹細胞、以該細胞所產生的各種生物因子為有效成分 的藥物組合物以及藥物製劑。

【背景技術】
[0002] 對於使由於多種原因而受到損傷的生物體的功能復原的方法來說，大致可分為移 植醫療和再生治療。移植醫療是指接受由供體提供的臟器，通過移植該臟器而使生物體的 功能復原。
[0003] 與此相對，再生治療是指下述治療：對包括本人在內的幾個人的細胞或組織進行 培養，對其進行加工，從而來替換具有障礙的臟器，由此來對缺失的組織或臟器進行修復或 使其再生，該再生治療中會使用幹細胞等。
[0004] 目前，在再生治療中所應用的或者能夠應用的幹細胞為人體性幹細胞、人胚性幹 細胞（ES細胞）以及人工多能性幹（iPS)細胞這3種。
[0005] 此處，人體性幹細胞已經在研究中進行使用，其存在於成人的組織中，具有僅分化 成特定的組織、器官或臟器的特性。需要說明的是，在骨髓或脂肪組織中存在的"間葉幹細 胞"可特別地分化成骨、軟骨、血管等多種組織。在使用這樣的體性幹細胞的情況下，若利用 自體細胞，則不會發生免疫排斥，並且植入也較好。另外，並沒有關於這些幹細胞的長期培 養會導致腫瘤化的報告。
[0006] 另一方面，已知能夠進行分化的細胞受到一定程度的限制；在由人體組織進行採 集時會伴有侵襲；進行分化的組織的種類受到限制；並且培養可傳代數被限制在四十幾 次、以天數計為1〇〇?200天。
[0007] 人胚性幹細胞（ES細胞）為將生殖醫療等中產生的剩餘胚（胚胞）中的"內部細 胞塊"取出、並對其進行培養所得到的幹細胞。由於其形成作為具有多分化潛能性的指標 的畸胎瘤，因而認為其在三胚層的任意層均可分化。還有報告指出其可分化為心肌、神經、 網膜。由於胚性幹（ES)細胞為永生化的細胞株，因而一個細胞株能夠無限地持續培養。並 且，在適當的培養條件下，能夠以細胞的形式大量製造均勻的製品。
[0008] 另一方面，由於其利用受精卵，因而需要有嚴格的對策以使其在提供時不會產生 倫理問題。並且，由於其基本上為異體移植，因而需要處理免疫應答所致的排斥反應。此外 還已知，在細胞培養時，需要使用異種細胞或血清；在移植後的再生組織中混有即使少量的 未分化細胞時，也容易形成畸胎瘤（良性腫瘤）。
[0009] 人的人工多能性幹（iPS)細胞為通過將在ES細胞中特異性表達的基因的一部分 導入到成人細胞（皮膚等）中而確立的細胞。在使用自體來源的iPS細胞時，不會產生免 疫排斥的問題，能夠直接利用ES細胞的分化技術。
[0010] 最後，人工多能性幹（iPS)細胞不像ES細胞那樣利用受精卵，而能夠使用成人組 織來製作與胚性幹細胞大致同樣性質的細胞，在利用自體來源的iPS細胞時，也不會出現 由於免疫反應所帶來的排斥反應的問題。
[0011] 此外還已知，其不僅容易良性腫瘤化、而且還容易惡性腫瘤（胚細胞癌）化；並且 由於從導入了基因的全部細胞中選擇形態上與ES細胞類似的細胞，因而作為iPS細胞被確 立的細胞的比例低。
[0012] 在將幹細胞本身用於再生治療中時，由於具有上述這樣的問題，因而摸索出了 不使用各種幹細胞本身、而使用它們產生的各種生物因子、例如各種生長因子的方法（W0 2011/118795號、下文稱為"現有技術1"）。
[0013] 另外，在現有技術1中，公開了一種損傷部治療用組合物，其含有血管內皮增殖因 子（VEGF)、肝細胞增殖因子（HGF)、胰島素樣生長因子（IGF)、血小板來源生長因子（PDGF)、 轉化生長因子(TGF-P)等生長因子，包括人脫落乳牙牙髓幹細胞等幹細胞的培養上 清。
[0014] 現有技術文獻
[0015] 專利文獻
[0016]專利文獻 I:TO2011/118795 號


【發明內容】

[0017] 發明所要解決的課題
[0018] 現有技術1中提供了具有皮膚光老化所致損傷的恢復、骨再生等效果的上述損傷 部治療用組合物，在這方面為優異的技術。
[0019] 另一方面，由於所使用的牙髓來源的幹細胞不是細胞株，因而必須在需要時製備 該幹細胞、或者使冷凍保存的試樣融化來進行細胞的增殖才能獲得目的培養上清，存在需 要時間來獲得培養上清的問題。
[0020] -般來說，在培養細胞中，在為由正常細胞確立的細胞株的情況下，在經50?60 次傳代後細胞不能分裂，該細胞迎來死亡。當然，培養細胞所產生的生物因子的組成也會隨 著時間的經過而發生變化，因而具有不能使用可無限增殖的細胞株、難以獲得具有恆定組 成的培養上清的問題。
[0021] 另一方面，作為代表性的可無限增殖的細胞，可以舉出癌細胞。對於癌細胞，通常 情況下在生物體的調節下被調節為適當地分裂及增殖的細胞由於該調節產生偏差而變成 無限增殖，從而成為癌細胞。因此，即使其為能夠無限增殖的細胞，該癌變的細胞也會產生 對於生物體有害的生物因子，因而無法進行使用。
[0022] 如上所述，對於可無限增殖但未發生癌變的永生化幹細胞的確立具有強烈的社會 需求。
[0023] 並且，為了將培養上清作為藥物組合物使用，上述永生化幹細胞需要能夠長期持 續產生一定的生物因子。
[0024]解決課題的手段
[0025] 本申請發明是基於上述情況而完成的。
[0026] S卩，本申請發明的第1方式為一種永生化幹細胞，其是如下選擇的：從選自由哺乳 類的間葉幹細胞、初生胚和除間葉細胞外的體細胞組成的組的細胞組中分離幹細胞；對上 述幹細胞進行初期培養，得到初期培養細胞；向初期培養細胞中導入4種基因，製作基因導 入細胞；從上述基因導入細胞中以STRO-I的表達為指標來選擇該永生化幹細胞。此處，上 述間葉幹細胞選自由牙髓幹細胞、骨髓幹細胞、臍帶細胞以及脂肪幹細胞組成的組。並且優 選上述牙髓幹細胞為由選自由脫落的乳牙、脫落的恆牙、拔除的乳牙以及拔除的恆牙組成 的組中的任意牙齒的牙髓得到的細胞。
[0027] 上述初生胚優選為胚盤期的胚。並且優選上述哺乳類選自由人、豬、馬以及猴組成 的組。上述骨髓幹細胞優選為具有可分化成可生成骨的成骨細胞、軟骨細胞、脂肪幹細胞等 間葉系與非間葉系這兩者的能力的細胞。此外，上述臍帶細胞是指維繫胎兒和胎盤的臍帶 血中所含有的造血幹細胞和間葉細胞，優選臍帶細胞大量含有這些細胞。上述骨髓幹細胞 優選為具有可分化成可生成骨的成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等間葉系與非間葉系這兩 者的能力的細胞。並且，上述臍帶細胞優選為由華通膠（Warton's jelly)得到的細胞。上 述脂肪幹細胞優選為能夠分化為所有幹細胞的未分化細胞。
[0028]此外，上述 4 種基因優選為選自由 hTERT、bmi-l、E6、E7、0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 以及pl6INK4a組成的組中的4種。此處，在導入到間葉細胞中的情況下，優選為hTERT、 bmi-1、E6和E7。另外，在導入到體細胞中的情況下，優選為選自由0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc以及pl6INK4a組成的組中的4種。
[0029] 並且，上述永生化幹細胞優選具有端粒修復能力，具有至少能夠分裂200次以上 的分裂能力。並優選在個體倍增次數為20次的時刻，細胞個體數的至少40%以上為STR0-1 表達細胞，且具有與原代培養細胞等同的新生骨量生成能力。
[0030] 進而，上述永生化幹細胞優選至少向培養上清中分泌IGF-1、VEGF、TGF-P 1和 HGF。
[0031] 本發明的第2方式為含有具有上述特性的永生化幹細胞的培養上清的藥物組合 物。
[0032] 此外，本發明的第3方式為含有上述藥物組合物的損傷組織復原用藥物製劑。此 處，上述損傷組織復原用藥物製劑的劑型為選自由粉末、液劑、凝膠劑、噴霧劑和經皮吸收 系統組成的組中的任意劑型。並且，上述損傷組織優選為選自由形成了潰瘍或褥瘡的組織、 由於細胞的變性而發生了損傷的腦組織、由於外科操作而發生了缺損的腦組織、由於外傷 性腦疾病而發生了損傷的腦組織、由於炎症性腦疾病而發生了損傷的腦組織、損傷的骨組 織、損傷的牙周組織、由於中樞神經系疾病而發生了損傷的組織、以及由於難治性皮炎而發 生了損傷的組織組成的組中的組織。
[0033] 此處，上述細胞的變性優選由選自由阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、痴呆症、統合 失調症、抑鬱症、缺氧性腦症、肌萎縮性側索硬化症（ALS)、腦梗塞、小腦變性症、糖尿病以及 肝炎組成的組中的疾病產生。並且，上述外傷性腦疾病優選由交通事故或墜落事故產生。 此外，上述炎症性腦疾病優選為選自由腦炎腦症、癲癇、克雅氏病以及小兒麻痺症組成的組 中的疾病。進而，上述中樞神經系疾病優選為選自由脊髓損傷和脊髓症組成的組中的疾病。 上述難治性皮炎優選為特應性皮炎。
[0034] 進而，設上述任意的永生化幹細胞所產生的培養上清為100%時，優選上述損傷組 織復原用藥物製劑中的培養上清的含量為50?500% (w/v)。
[0035] 本發明的第4方式為一種永生化幹細胞的產生方法，其具備下述工序：分離工序， 從選自由哺乳類的間葉細胞、初生胚和除間葉細胞外的體細胞組成的組的細胞組中分離幹 細胞；培養工序，對上述幹細胞進行初期培養，得到初期培養細胞；基因導入工序，向上述 初期培養細胞中導入4種基因，製作基因導入細胞；以及選擇工序，以個體倍增次數為20次 的時刻的STR0-1的表達量和骨再生能力為指標，從上述基因導入細胞中選擇細胞。
[0036] 此處，優選上述間葉細胞選自由牙髓細胞、骨髓細胞、臍帶細胞以及脂肪細胞組成 的組。上述牙髓細胞，上述初生胚、上述骨髓幹細胞以及上述臍帶細胞如上所述。上述哺乳 類如上所述。
[0037]進一步地，上述 4 種基因優選為選自由 hTERT、bmi-1、E6、E7、0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc以及pl6INK4a組成的組中的4種。此處，在導入到間葉細胞中的情況下，優選為 hTERT、bmi-1、E6和E7。並且，在導入到體細胞中的情況下，優選為選自由0ct3/4、Sox2、 Klf4、c-Myc以及pl6INK4a組成的組中的4種。
[0038] 上述hTERT為人端粒酶逆轉錄酶的基因，bmi-1為與幹細胞的自體複製、分化調節 有關的多梳家族基因。E6和E7為在對用於人乳頭瘤病毒的自體複製的初期基因進行編碼 的開放閱讀框中存在的基因。
[0039] 本發明的第5方式為一種經皮吸收方法，其特徵在於，其具備下述工序：劑型製備 工序，利用片狀保溼性部件吸收上述藥物製劑來製成片形製劑；損傷部位覆蓋工序，利用上 述片形製劑來覆蓋損傷的部位；以及電極接觸工序，使帶正電的電極與所期望的部位接觸。
[0040] 本發明的永生化幹細胞即使在40次分裂後，仍含有細胞個體數的至少40%以上 的STR0-1表達細胞。此外，由於具有端粒修復能力，因而能夠進行至少200次以上的分裂。 並且，上述各種生物因子能夠長期分泌到培養上清中。
[0041] 發明的效果
[0042] 利用本申請發明，從而能夠長期提供可長期持續產生一定的生物因子的永生化幹 細胞。
[0043] 此外，利用本申請發明的另一方式，能夠提供可用於廣泛的損傷組織的修復的藥 物組合物和藥物製劑。
[0044] 進而，能夠提供一種新穎的經皮吸收方法，該方法能夠提高有效成分從損傷部位 吸收的吸收效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045] 圖1為表示從上述牙髓細胞中選擇的永生化幹細胞與不是永生化幹細胞的細胞 的個體倍增次數（population doubling time、下文中稱為"PD"）與培養期間的關係的曲 線圖。圖1中，SHED-T表示永生化幹細胞、SHED-C表示不是永生化幹細胞的細胞。
[0046] 圖2為表示SHED-C和SHED-T中的STR0-1的表達結果的曲線圖（圖2 (A)?（D))。 圖中，PD20表示個體倍增次數=20次、PD30表示個體倍增次數=30次、並且HMO表示個 體倍增次數=40次。
[0047] 圖3為表示皮膚潰瘍治療時的恢復狀況的照片。（A)表示治療前的皮膚狀態、(B) 表示治療後的皮膚狀態。
[0048] 圖4為示出個體倍增時間（次數）與新生骨量的關係的曲線圖，圖中，**表示 p〈0. 05、***表示p〈0. 01。新生骨量由下述計算式求出。新生骨量=新生骨面積/視野面 積 X 100
[0049] 圖5為示出在圖4所示的各個體倍增時間時進行SHED-C與SHED-T的移植時的組 織染色像的圖。
[0050] 圖6為示出對褥瘡的潰瘍進行治療時的恢復狀況的照片。（A)表示治療前的皮膚 狀態、（B)表示治療後的皮膚狀態。
[0051] 圖7為通過CT掃描示出在植入手術時使用上述藥物製劑時經過1?6個月後的 重構進展狀況的圖。（A)?（C)為從正面拍攝的圖像，並且（D)?（F)為從水平方向拍攝的 圖像。
[0052] 圖8為示出牙周病患者的牙槽骨狀態的照片。（A)表示治療開始時（術前）的牙 槽骨狀態、（B)表示術後3個月的牙槽骨狀態。
[0053] 圖9為示出對於將P -TCP作為支架時的拔牙窩的骨形成進行觀察的結果的照片。 (A) 表示在拔牙後3個月進行植入的結果、（B)表示在拔牙後6月進行植入的結果。
[0054] 圖10為示出使用@ -TCP(@磷酸三鈣、3Ca0 ? P2O5)作為支架時@ -TCP在骨中的 置換等的圖。（A)為示出摘出物的照片，（B)為示出組織染色的結果的照片。（C)和（D)為 將拍攝圖像部分放大的照片。圖中，NB表示新生骨、且TCP表示P-TCP。此外，BV表示血 管、SF表示摘出物的底部。
[0055] 圖11為示出藉由嗅覺球進行幹細胞來源培養上清的經鼻給藥的情況下的應用部 位的圖。
[0056] 圖12為進行經鼻給藥時的照片。
[0057] 圖13為示出腦卒中患者的血管的閉塞部的MRA圖像。
[0058] 圖14為示出腦卒中患者的腦損傷部位的CT掃描圖像。
[0059] 圖15為示出腦卒中患者的腦損傷部位的血流量的MRI圖像。（A)為剛腦卒中後的 圖像、（B)為治療後的圖像。
[0060] 圖16為示出表示治療期間患者狀態的評分（NIHSS)的變化的曲線圖。
[0061] 圖17為示出患者功能的恢復狀況的照片。（A)為表示手功能的恢復狀況的照片、 (B) 為表示腰腿恢復狀況的照片。
[0062] 圖18為示出在給藥組和非給藥組中進行簡易精神狀態檢査(Mini Mental State : 麗S)和長谷川試驗任意一者的結果的經時變化的圖。圖18(A)表示非給藥組的結果、圖 18(B)表示給藥組的結果。
[0063] 圖19為示出針對難治性皮炎的治療效果的照片。圖19(A)表示治療開始前的狀 態、圖19(B)表示治療終止時的狀態。

【具體實施方式】
[0064] 下面進一步詳細說明本申請發明。
[0065] 為了得到本申請發明的永生化幹細胞，首先從包括哺乳類的間葉細胞、初生胚和 除間葉細胞外的體細胞的細胞組中分離幹細胞。作為上述哺乳類，從與人細胞的遺傳相似 性高以及感染危險性低的方面考慮，優選從由人、豬、馬以及猴組成的組中選擇。
[0066] 在本說明書中，"間葉細胞"是指具有分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、軟骨細 胞等屬於間葉系的細胞的分化能力的細胞。作為具體的間葉細胞，可以舉出上述動物的牙 髓細胞、骨髓細胞、臍帶細胞和脂肪細胞等。此外，"初生胚"是指為了確立ES細胞所需要 的、比受精卵進一步發育的至胚胞為止的初期階段的胚。"體細胞"是指構成生物體的細胞 中生殖細胞以外的細胞的總稱。
[0067] 進一步地，"牙髓細胞"是指具有再生能力的牙齒的神經所含有的幹細胞的一種。 由於被牙齒之類的硬質材料所保護，因而其具有紫外線或放射線不會穿過、基因也不容易 損傷的特性。"骨髓細胞"是在骨髓穿刺液中得到的細胞的總稱，包括成髓細胞等白血球系 細胞、成紅血細胞系的細胞、骨髓巨核細胞以及漿細胞等。
[0068] 本說明書中的臍帶細胞是指在連接胎兒與胎盤的臍帶中存在的細胞，其也包括臍 帶中所含有的富含造血幹細胞的臍帶血。
[0069] 作為上述導入到幹細胞中的基因，可以舉出hTERT、bmi-1、E6、E7、0ct3/4、Sox2、 Klf4、c-Myc以及pl6INK4a等。hTERT為端粒修復酶的基因，bmi-1是作為構成多梳家族復 合物的蛋白質之一的Bmi-I的基因。此處，Bmi-I對於造血幹細胞的維持是必要的，通過其 活性增強，具有能夠增加造血幹細胞的作用。
[0070] E6和E7為HPV-16或HPV-18的初期基因。此外，0ct3/4是與Sox2合作來活化靶 基因的轉錄的基因。Klf4(Kr Uppel型轉錄因子4)對於與細胞分裂和胚胎有關的基因進行 調節，並作為癌抑制因子與消化器系統癌症相關。
[0071] Sox2屬於SRY相關HMG box基因家族，其為已知與功能的未分化性（多能性）的 維持相關的基因。c-Myc為促癌基因，其為在經c-Myc誘導的腫瘤內促進細胞的生存與死亡 這兩者的基因。pl6INK4a為在控制癌細胞的細胞周期方面發揮出重要作用的基因。
[0072] 下面舉出使用來自人的脫落乳牙的牙髓細胞來製作永生化幹細胞的情況為例來 進行說明。
[0073] 首先，脫落乳牙利用例如氯己定、聚維酮碘溶液等消毒藥消毒，之後分離出齒冠 部，利用牙醫鉸刀回收牙髓組織。
[0074] 將所採集的牙髓組織懸浮在基本培養基、例如含有5%?15%的牛血清（calf serum、下面稱為"CS"）和50單位/mL?150單位/mL抗生物質的達爾伯克改良伊格爾培 養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium,下面稱為"DMEM"）中。接著,使用 lmg/mL ? 5mg/mL的膠原酶和lmg/mL?5mg/mL的分散酶（dispase),在37。。處理0? 5小時?2小時。
[0075] 作為上述基本培養基，除DMEM外，還可使用伊斯科夫改良達爾伯克培養基（MDM) (GIBC0 社製造等）、Ham's F12 培養基（HamF12) (SIGMA 社製造、GIBCO 社製造等）、RPMI1640 培養基等。還可將兩種以上的基本培養基合用。作為混合培養基的一例，可以舉出將IMDM 與HamF12等量混合得到的培養基（例如以商品名IMDM/HamF12(GIBC0社）進行市售）。
[0076] 此外，作為基本培養基中的添加物，可以舉出胎牛血清（fetal bovine serum 或fetal calf serum，下文稱為"FBS"或"FCS"）、人血清、羊血清其它血清、血清替代物 (Knockout serum replacement (KSR)等）、牛血清白蛋白(bovine serum albumin、下文稱 為"BSA"）；青黴素、鏈黴素等抗生物質；各種維生素、各種礦物質。
[0077] 上述的基本培養基也可以在後述的細胞分選用培養以及分選後的細胞培養中使 用。
[0078] 在酶處理後，進行3?10分鐘的離心操作（3, 000?7, 000轉/分），回收牙髓細 胞。根據需要使用細胞過濾網進行細胞的分選。分選出的細胞利用例如3?6mL的上述基 本培養基進行再懸浮，播種到直徑4?8cm的貼壁細胞培養用培養皿中。
[0079] 接下來，添加培養液、例如添加含有10% FCS的DMEM，之後利用5% CO2培養箱在 37°C培養2周左右。除去上述培養液後，利用PBS等將細胞清洗1次?數次。也可不進行 培養液的去除和細胞的清洗，而將形成有菌落的貼壁性的牙髓幹細胞回收。貼壁性的牙髓 幹細胞例如利用〇. 025?0. 1 %的胰蛋白酶和0. 3?ImM的EDTA在37°C處理數分鐘，從培 養皿剝離，接下來進行細胞回收。
[0080] 在酶處理後，進行3?10分鐘的離心操作（3, 000?7, 000轉/分），回收牙髓細 胞。根據需要使用細胞過濾網進行細胞的分選。分選出的細胞利用例如3?6mL的上述基 本培養基進行再懸浮，播種到直徑4?8cm的貼壁細胞培養用培養皿中。
[0081] 接下來，添加培養液、例如添加含有10% FCS的DMEM，之後利用5% CO2培養箱在 37°C培養2周左右。除去上述培養液後，利用PBS等將細胞清洗1次?數次。也可不進行 培養液的去除和細胞的清洗，而將形成有菌落的貼壁性的牙髓幹細胞回收。貼壁性的牙髓 幹細胞例如利用〇. 025?0. 1 %的胰蛋白酶和0. 3?ImM的EDTA在37°C處理數分鐘，從培 養皿剝離，接下來進行細胞回收。
[0082] 接著，對如上所述分選出的貼壁性細胞進行培養。例如，將如上所述得到的牙髓幹 細胞播種在貼壁細胞培養用培養皿中，在5% C02、37°C的條件下利用培養箱進行培養。如 上可以得到人脫落乳牙幹細胞的原代培養細胞（SHED-P)。
[0083] 關於傳代培養，例如在用肉眼觀察達到半融合或融合時，如上述那樣使用胰蛋白 酶和EDTA將細胞從培養容器剝離並進行回收，再次播種到加入有培養液的培養容器中。
[0084] 此處，半融合是指在培養容器中的細胞附著面的約70%有細胞附著的狀態。例如， 進行1?8次傳代培養，使分選出的細胞增殖到必要的細胞數、例如約I X IO7個/mL。在如 上述那樣進行培養後，回收細胞，保存在液氮中。由各種供體回收的細胞也可以以牙髓幹細 胞庫的形態進行保存。
[0085] 接下來，向對上述幹細胞進行初期培養得到的原代培養細胞中導入4種基因，制 作基因導入細胞。導入到其中的基因優選為選自由hTERT、bmi-1、E6、E7、0ct3/4、Sox2、 Klf4、c-Myc以及pl6INK4a組成的組中的4種。通過導入hTERT、bmi-1、E6、E7,能夠得到 個體倍增次數更多的永生化幹細胞。此處，hTERT為人端粒酶逆轉錄酶的基因，bmi-1為與 幹細胞的自體複製、分化調節有關的多梳家族基因。E6和E7為在對用於人乳頭瘤病毒的自 體複製的初期基因進行編碼的開放閱讀框中存在的基因。
[0086] 這樣的基因導入可如下進行。
[0087] 製備用於插入上述目的基因的質粒，將其插入到穿梭載體、例如pShuttle2中，克 隆上述基因。利用該穿梭載體轉化大腸桿菌，選擇卡那黴素抗性轉化體。對所選擇的卡那 黴素抗性轉化體的質粒DNA進行提純，分析限制酶部位，鑑定重組體。
[0088] 接著，使用限制酶、例如PI-Sce I和I-Cue I，將表達盒從上述穿梭載體中切出，將 其與腺病毒載體、例如Adeno-X病毒DNA連接。將所得到的連接產物利用Swa I切斷，使用 其來轉化大腸桿菌。
[0089] 從所得到的轉化體中選擇氨苄青黴素抗性轉化體。對插入有上述基因的重組腺病 毒DNA進行提純，分析限制酶部位，鑑定重組體。
[0090]接下來，利用Pac I消化重組腺病毒，將其轉染至HEK293細胞中。使重組腺病毒 增殖，將其收集，測定病毒的滴度。按照常規方法提純病毒，使其感染靶細胞SHED-P。
[0091]將病毒感染後的細胞組按照常規方法利用FITC染色，使用流式細胞儀檢測 STR0-1陽性細胞。此處，STR0-1被認為是骨髓中具有多分化能力的間葉幹細胞的標記之 一，為細胞永生化的指標。
[0092]通過上述過程可以得到牙髓來源的永生化幹細胞。
[0093]接著，使用上述基本培養基、例如加入有10% FBS的DMEM，在5% C02、37°C的條件 下對所得到的永生化幹細胞進行24?48小時培養，得到培養上清。為了回收培養上清，可 使用例如Komagome型移液管等。所回收的培養上清可直接作為本發明藥物組合物的有效 成分使用，也可以在進行濃縮、溶劑置換、透析、冷凍乾燥、稀釋等處理後作為本發明藥物組 合物的有效成分使用。
[0094] 並且，如後所述，上述得到的永生化幹細胞的培養上清含有各種生長因子，即使不 進行高度提純，也顯示出各種作用。即，能夠用於各種疾病的治療的本發明的藥物組合物能 夠利用簡易的工序進行製造，因而能夠避免與高度提純相伴的各種生長因子生理活性的降 低。
[0095] 需要說明的是，本發明中使用的"永生化幹細胞的培養上清"是指對永生化幹細 胞進行培養得到的含有各種生物因子的培養上清，其是指不含有永生化幹細胞等細胞的溶 液。在製備不含有血清的培養上清的情況下，可以在從初期培養到傳代的全部過程中使用 無血清培養基、或者在回收細胞前的數次傳代時使用無血清培養基。
[0096]利用上述方法選擇-培養的牙髓幹細胞為從生物體採集的組織或細胞，與最初播 種的原代培養細胞具有同樣的性質。通常，原代培養細胞與作為其來源的臟器具有類似的 性質，接近於正常細胞，這一點是很重要的。但是，與細胞株相比，其增殖緩慢，並且在繼續 培養時還可能產生去分化，難以保有且維持其性質。
[0097]但是，在本發明的永生化幹細胞中，在細胞倍增次數為20次或40次的時刻，作為 細胞未分化度的標記的STR0-1的表達率顯著高於並非為永生化幹細胞的牙髓幹細胞，優 選其顯示出約為1. 5?3倍的高比例。這是由於STR0-1表達率的高度為顯示與原代培養 細胞具有同樣性質的指標。
[0098]此外，本發明的永生化幹細胞在培養上清中分泌選自由胰島素樣生長因子 (IGF-I)、血管內皮細胞增殖因子（VEGF)、轉化生長因子(TGF-P)以及作為肝細胞增殖 因子的HGF組成的組中的至少2種以上的生長因子。此處，"生長因子"為促進細胞分裂、致 使細胞形態變化或細胞肥大的多肽的總稱。根據產生生長因子的細胞種類的不同，因子有 所不同，大致分為上皮生長因子（EGF)、成纖維細胞生長因子（FGF)、神經生長因子（NGF)、 腫瘤增殖因子（TGF)等。
[0099]進而，在位於各細胞的細胞膜的受體具有酪氨酸激酶活性、並結合生長因子時，蛋 白質的酪氨酸殘基發生磷酸化，引起細胞的增殖或分化。已知有幾個生長因子在個體發生 中成為中胚層誘導物質的示例。並且已知有幾個調節免疫系統的淋巴因子在個體發生中成 為中胚層誘導物質的示例。這樣的生長因子可利用公知的ELISA法、微陣列法等進行定量。
[0100] 上述IGF-I為與胰島素序列高度類似的多肽，在細胞培養中與胰島素同樣地產生 促有絲分裂等反應。已知還會影響神經細胞的成長。此外，上述VEGF為與血管形成和血管 新生相關的一組糖蛋白，血管形成是在胚胎形成期在無血管的位置形成新的血管，血管新 生是從現有的血管伸出分支來形成血管。上述TGF-P還是針對大量細胞的強力增殖抑制 因子，與細胞的分化-遷移-粘附也密切相關，在個體發生、組織再建、創傷治癒、炎症-免 疫、癌浸潤-轉移等廣泛的領域發揮出重要的作用。進而，HGF不僅在肝細胞中、而且在各 種細胞中具有細胞增殖促進、細胞運動促進、抗凋亡（細胞死亡）、形態發生誘導、血管新生 以及組織-臟器的再生與保護等多種生理活性。
[0101] 將上述各種幹細胞在例如添加了 15% FCS的DMEM中在37°C培養一定期間，從而 可得到含有上述生長因子的培養上清。需要說明的是，在上述幹細胞的培養上清中，除了含 有IGF-I、VEGF、TGF-P以及HG以外，還含有約70種的蛋白。
[0102] 將所得到的培養上清中的15mL加入到Amicon Ultra Centrifugal Filter Units_10K(Millipore社製造）中，以X4, OOOg離心約60分鐘，濃縮至約200 ii 1。接下來， 向該管中投入與培養上清同量的滅菌PBS，再次以X4, OOOg離心約60分鐘，將溶劑置換為 PBS。將所得到的200 ii L的溶液回收到微量試管中，製成濃縮幹細胞培養上清。
[0103] 也可以利用乙醇沉澱法進行濃縮來替換上述使用Amicon的方法。例如，在5mL的 培養上清中加入45mL的100%乙醇並進行混合，在-20°C放置60分鐘。其後，以X 15, OOOg 於4°C離心15分鐘，去除上清。
[0104]接下來，例如可加入IOmL的90 %乙醇進行攪拌，再次以X 15, OOOg於4°C離心5 分鐘。去除上清，可以將所得到的顆粒溶解在例如5001； L的滅菌水中。溶解後，將總量回 收到微量試管中，製成濃縮幹細胞培養上清。
[0105] 如上得到的培養上清還可按照常規方法冷凍乾燥，製成在使用時進行調整的藥物 組合物。
[0106] 該藥物製劑所含有的培養上清中的生長因子的量相對於全部乾燥重量優選為約 50重量％?500重量％。這是由於，在小於50重量％時，發揮不出效果；而即使超過500重 量％，也預料不到效果的改善。
[0107] 作為該藥物組合物的劑型，可以舉出粉末、液劑、凝膠劑、噴霧劑和經皮吸收系統 等。例如，可以加入填充劑、賦形劑、pH調節劑等添加物，裝入到滅菌後的玻璃安瓿、血清管 等小型容器中，製成藥物製劑。在使用時，可溶解在生理鹽水或滅菌注射用水中，經鼻給藥， 此外還可浸潤到紗布中，貼在患部。在用於牙槽骨等骨的再生成的情況下，可以作為支架材 使用膠原蛋白、P -TCP等，並將它們浸漬在上述溶解液中進行包埋。
[0108] 作為可應用本申請發明的藥物製劑的損傷組織，可以舉出形成了潰瘍或褥瘡的組 織、由於血管的閉塞而發生了損傷的腦組織、由於骨、牙周組織和中樞神經系疾病而發生了 損傷的組織等。
[0109] 此處，"潰瘍"是指發生了壞死的組織溶解或剝離後，在臟器的表面形成的組織缺 損部，其形成於上皮、真皮、黏膜等處。未到達真皮處的稱作糜爛。具體地說，在皮膚、鼻口 腔黏膜、角膜等與體表相接的位置或消化道、呼吸道、尿道、血管等管腔臟器的內腔面形成 潰瘍。
[0110] 關於"褥瘡"，是指在臨床上患者長期呈相同姿勢處於無法翻身狀態的情況下，在 軀體與支持面（多為床）接觸的位置，局部循環功能不全，在周邊組織產生壞死的狀態。
[0111] "由於外科操作而發生了缺損"是指由於腦腫瘤摘除等外科手術而發生缺損。
[0112] "血管的閉塞"是指血管由於下述任一理由而閉塞的狀態。例如其是指：由於動脈 硬化而使血管發生狹窄、血液在該處之前無法流動的狀態；在心臟附近的血管動脈硬化部 位，該血管內的栓塞（血液、脂肪等的塊狀物）由血管內壁剝落、阻塞血管，血液在該處無法 向前流動的狀態；炎症、痙攣、或者血液成分或血流發生變化，而使血液的供給中斷。
[0113] "腦"具有記憶、情緒、意志決定等功能。腦、脊髓由被稱為腦脊髓液的液體所包圍。 腦脊髓液（cerebrospinal fluid、CSF)具有保護腦、運輸營養-代謝物的功能。腦脊髓液 可通過脊椎穿刺採集，其性狀根據疾病等而發生變化。
[0114] 此處，"脊髓"是指脊椎動物所具有的神經幹。此外，"中樞神經系統"是指將脊髓 和腦合在一起的組織。中樞神經系統具有作為根據來自末梢的刺激發生反射的反射中樞來 起作用的功能、或具有整合刺激的功能。
[0115] 中樞神經系統的損傷由於脊髓損傷等而產生。此處，"脊髓損傷"是指脊髓由於外 部衝擊、脊髓腫瘤、疝氣等內在原因而發生了損傷的狀態。根據損傷程度的不同，分為脊髓 在中途被完全切斷的完全型、以及脊髓受到損傷或壓迫但脊髓功能得以部分維持的不完全 型。
[0116] 此外，"脊髓症"是由於年齡增加所致的頸椎症（椎間盤的突起-骨刺的形成）的 變化使位於頸椎脊柱管中的脊髓受到壓迫而發病。
[0117] 上述的藥物製劑可以以液劑或凝膠劑的形式應用於創傷部位，也可以片狀製劑的 形式來應用。首先使其被保溼性的部件、例如紗布、醫療用保溼片等吸收，製成片狀製劑。接 著，利用該片狀製劑覆蓋損傷的部位。使帶負電的棒狀電極在覆蓋了損傷部位的片上一邊 慢慢地旋轉一邊進行移動，使與創傷部位離開的所期望的部位與帶正電的電極接觸。
[0118] 如上所述，利用在創傷部位上應用的電極與在其它部位應用的電極之間流經的電 流，可以有效地對上述藥物製劑中的有效成分進行給藥。
[0119] 通過對上述的損傷組織應用本申請發明的藥物製劑，能夠謀求組織的快速恢復。
[0120] 實施例1
[0121](永生化SHED的製作和培養方法）
[0122] (1)提取用試劑、質粒等
[0123] (1-1)試劑等
[0124]使用卡那黴素（Kan)、氨苄青黴素（Amp)、LB液體培養基和LB瓊脂培養基、糖原、瓊 脂糖、滅菌水、乙酸銨、乙酸鈉、十二燒基硫酸鈉和RNase A。製備50mg/mL的卡那黴素（Kan) 和氨苄青黴素（Amp)，以儲存液的形式保存在-20°C。糖原製備成20mg/ml。製備lOmg/ml 的 RNase A，保存在-20°C。製備 IOM(飽和）乙酸銨（NH4OAc)、3M 乙酸鈉（NaOAc ;pH5. 2)。
[0125] (1-2)限制酶等
[0126] 大腸桿菌感受態細胞（Supercharge EZlO電感受態細胞、產品編碼636756)、Swa I (產品編碼1111A、Smi I為等同品）、Xho I (產品編碼1094A)、T4DNA Ligase (產品編碼 2011A)、NucleoBond Xtra Midi (產品編碼 740410. 10/. 50/. 100)、NucleoSpin Plasmid (產 品編碼 740588 10/50/250)均購自 Takara Bio Inc。Pac I 購自 New England Biolabs。
[0127] (1-3)緩衝液等
[0128]製備 IXTE 緩衝液（含有 ImM EDTA 的 IOmM Tris-HCl [pH8. 0])、經 IOOmM Tris-HCl (pH8.0)飽和的苯酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1、下文稱為"PCI混液"）。乙醇以 100%和70%使用。為了提純在小規模重組中使用的PAdeno-X質粒DNA，製備下述緩衝液 1?4〇
[0129] 緩衝液1:含有IOmM EDTA和50mM葡萄糖的25mM Tris-HCl (pH8. 0)(高壓滅菌後 在4°C保存）
[0130] 緩衝液2:含有1% SDS的0. 2M NaOH(在即將使用前進行使用時的製備，密封，室 溫保存）
[0131] 緩衝液3 :5M KOAc (高壓滅菌後在4°C保存）
[0132]緩衝液 4:含有 ImM EDTA、20 ii g/ml RNase 的 IOmM Tris-HCl (pH8. 0)(在即將使 用前添加RNase。在_20°C保存）
[0133] (2)腺病毒提純和0 -gal分析用試劑
[0134] 使用利用人5型腺病毒轉化後的人HEK293細胞（ATCC#CRL1573)。HEK293細胞利 用完全培養基培養。完全培養基的組成為添加有1〇〇單位/ml的青黴素G鈉和100 i! g/ml 的鏈黴素、4mM 的谷氛醜胺和 10% FBS 的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium、基本 培養基）。以10, 〇〇〇單位/ml製備青黴素G鈉溶液、以10, 000 ii g/ml製備硫酸鏈黴素溶 液，以儲存液的形式保存。
[0135] 培養中使用60mm微板、IOOmm微板、6-孔微板、T75和T175燒瓶。
[0136] 胰蛋白酶-EDTA(產品編碼CC-5012)由Takara Bio Inc購入。製備磷酸緩衝生理 鹽水（PBS、不含有Ca2+和Mg2+)和Dulbecco' s磷酸緩衝生理鹽水（DPBS、含有Ca2+和Mg2+)。 另外，使用〇. 33%的中性紅染色液、0. 4%錐蟲藍染色液。
[0137] 在P -gal分析中，將X-Gal (5-溴-4-氯-3-卩引哚基-P -D-批喃半乳糖（25mg/ ml))二甲基甲醯胺（DMF)溶液在_20°C遮光保存。使用 Luminescent 0-gal Detection Kit II (產品編碼 631712、Takara Bio Inc 製造）。
[0138] (3)預備試驗
[0139] (3-1)含有IacZ的重組腺病毒（pAdeno-X-lacZ)的構建
[0140] 將解凍後去除了 DMSO的HEK293細胞再懸浮於IOmL的上述完全培養基中，將全部 量轉移至IOOmrn的培養微板中。在HEK293細胞附著後，去除培養液，將細胞利用滅菌PBS 進行1次清洗，加入Iml的胰蛋白酶-EDTA溶液，進行約2分鐘處理。
[0141] 接著，加入IOml的完全培養基停止胰蛋白酶的反應，進行平穩懸浮。進行活菌計 數，將IO 5個細胞轉移至加入有培養液IOml的IOOmrn的微板中，進行均勻擴散。
[0142]使用 pShuttle2_lacZ(包含在 Adeno-X Expression System 1 中的陽性對照載 體）和包含在試劑盒中的Adeno-X病毒DNA (PI-Sce I和I-Ceu I digested)，按照試劑盒 所付的實驗方案，構建包含IacZ的重組腺病毒。使其感染靶細胞SHED，分析P -半乳糖苷 酶的表達，確認載體的構建。
[0143] (3-2)重組pShuttle2質粒的構建
[0144] 在重組pShuttle2載體（下文中稱為"rpShuttle2載體"）構建前，利用試劑盒中 含有的pShuttle2載體和pShuttle2_lacZ載體對DH5 a大腸桿菌進行轉化。在含有50 ii g/ ml卡那黴素的LB瓊脂微板（下文中稱為"LB/Kan"）上進行轉化體的選擇，將從單一菌落 取得的菌體在新的LB/Kan上劃線，在37°C培養一夜。
[0145] 接下來，將hTERT、bmi-l、E6、E7按以下順序克隆到pShuttle2中。利用適於這些 基因的限制酶切斷pShuttle2載體。
[0146] 接下來，參照上述試劑盒中所附的pShuttle2載體Information Packet(PT3416-5)，確定與插入的DNA匹配的多克隆位點。將限制酶處理後的上述質粒利 用鹼性磷酸酶處理，進行提純。
[0147] 按照常規方法製備靶DNA碎片、進行提純。將上述利用限制酶消化的載體與上述 基因碎片連接，利用連接產物轉化DH5a細胞（感受態細胞）。取上述感受態細胞的一部 分，利用試劑盒中包含的對照載體pShuttle2-la CZ載體進行轉化，作為陽性對照。
[0148] 將含有轉化後的大腸桿菌的混合液接種於LB/Kan瓊脂微板，選擇卡那黴素抗性 (Kanr)轉化體（菌落）。選擇5?10個Kan抗性克隆，接種於少量的液體培養基中，進行 擴增。在確認這些克隆具有rpShuttle2載體後，進行一夜培養。其後，使用市售的二氧化 矽吸附柱，按照常規方法對所構建的質粒DNA進行提純。
[0149] 將該質粒DNA利用限制酶處理，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，鑑定目的重組質粒。通 過測序確認所插入的碎片的方向和插入部位，鑑定陽性克隆。
[0150] 將重組pShuttle2質粒DNA(下文中稱為"rpShuttle2質粒DNA"）直接轉染至革巴 細胞中，進行Western印跡法，對目的蛋白質的表達進行預檢測。
[0151] (3-3)rpShuttle2質粒DNA的PI-SceI/I-CeuI雙消化
[0152] 利用PI-SceI和I-CeuI從如上製作的rpShuttle2質粒DNA中切出所導入的基 因的表達盒。按照試劑盒中所附的實驗方案所記載的體外（in vitro)連接方法,將切出的 表達盒插入到Adeno-X病毒DNA中。製備rpShuttle2質粒DNA的PI-SceI/I-CeuI雙消 化液30yl，將下述表1中記載的試劑裝入到I.5ml的滅菌微量離心管中，進行混合。
[0153] [表1]
[0154]

【權利要求】
1. 一種永生化幹細胞，其是如下選擇的：從選自由哺乳類的間葉細胞、初生胚和除間 葉細胞外的體細胞組成的組的細胞組中分離幹細胞；對所述幹細胞進行初期培養，得到原 代培養細胞；向原代培養細胞中導入4種基因，製作基因導入細胞；從所述基因導入細胞中 以STRO-I的表達為指標來選擇該永生化幹細胞。
2. 如權利要求1所述的永生化幹細胞，其特徵在於，所述間葉幹細胞選自由牙髓幹細 胞、骨髓幹細胞、臍帶幹細胞以及脂肪幹細胞組成的組。
3. 如權利要求1或2所述的永生化幹細胞，其特徵在於，所述牙髓幹細胞為由選自由脫 落的乳牙、脫落的恆牙、拔除的乳牙以及拔除的恆牙組成的組中的任意牙齒得到的幹細胞。
4. 如權利要求1所述的永生化幹細胞，其特徵在於，所述初生胚為胚盤期的胚。
5. 如權利要求1?4的任一項所述的永生化幹細胞，其特徵在於，所述哺乳類選自由 人、豬、馬以及猴組成的組。
6. 如權利要求1?5的任一項所述的永生化幹細胞，其特徵在於，所述4種基因選自由 hTERT、bmi-1、E6、E7、0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 以及 pl6INK4a 組成的組。
7. 如權利要求I?6的任一項所述的永生化幹細胞，其特徵在於，其具有端粒修復能 力，具有至少能夠分裂200次以上的分裂能力。
8. 如權利要求1?7的任一項所述的永生化幹細胞，其特徵在於，在個體倍增次數為 20次的時刻，細胞個體數的至少40%以上為STR0-1表達細胞，且具有與原代培養細胞等同 的新生骨量生成能力。
9. 如權利要求1?8的任一項所述的永生化幹細胞，其特徵在於，所述永生化幹細胞至 少向培養上清中分泌IGF-1、VEGF、TGF-β 1和HGF。
10. -種藥物組合物，其含有權利要求1?9的任一項所述的永生化幹細胞的培養上 清。
11. 一種損傷組織復原用藥物製劑，其含有權利要求10所述的藥物組合物。
12. 如權利要求11所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述損傷組織復原 用藥物製劑的劑型為選自由粉末、液劑、凝膠劑、噴霧劑和經皮吸收系統組成的組中的任意 劑型。
13. 如權利要求11或12所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述損傷組織 為選自由形成了潰瘍或褥瘡的組織、由於細胞的變性而發生了損傷的腦組織、由於外科操 作而發生了缺損的腦組織、由於外傷性腦疾病而發生了損傷的腦組織、由於炎症性腦疾病 而發生了損傷的腦組織、損傷的骨組織、損傷的牙周組織、由於中樞神經系疾病而發生了損 傷的組織、以及由於難治性皮炎而發生了損傷的組織組成的組中的組織。
14. 如權利要求13所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述細胞的變性是 由選自由阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、痴呆症、統合失調症、抑鬱症、缺氧性腦症、肌萎縮 性側索硬化症、腦梗塞、小腦變性症、糖尿病以及肝炎組成的組中的疾病產生的。
15. 如權利要求13所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述外傷性腦疾病 是由交通事故或墜落事故產生的。
16. 如權利要求13所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述炎症性腦疾病 為選自由腦炎腦症、癲癇、克雅氏病以及小兒麻痺症組成的組中的疾病。
17. 如權利要求13所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述中樞神經系疾 病為選自由脊髓損傷和脊髓症組成的組中的疾病。
18. 如權利要求13所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，所述難治性皮炎為 特應性皮炎。
19. 如權利要求11?17的任一項所述的損傷組織復原用藥物製劑，其特徵在於，設權 利要求1?9的任一項所述的永生化幹細胞所產生的培養上清為100%時，所述損傷組織復 原用藥物製劑中的培養上清的含量為50?500% (w/v)。
20. -種永生化幹細胞的產生方法，其具備下述工序： 分離工序，從選自由哺乳類的間葉細胞、初生胚和除間葉細胞外的體細胞組成的組的 細胞組中分離幹細胞； 培養工序，對所述幹細胞進行初期培養，得到初期培養細胞； 基因導入工序，向所述初期培養細胞中導入4種基因，製作基因導入細胞；以及 選擇工序，以個體倍增次數為20次的時刻的STRO-I的表達量和骨再生能力為指標，從 所述基因導入細胞中選擇細胞。
21. 如權利要求19所述的永生化幹細胞的產生方法，其特徵在於，所述間葉細胞選自 由牙髓細胞、骨髓細胞、臍帶細胞以及脂肪細胞組成的組。
22. 如權利要求20所述的永生化幹細胞的產生方法，其特徵在於，所述牙髓細胞為由 選自由脫落的乳牙、脫落的恆牙、拔除的乳牙以及拔除的恆牙組成的組中的任意牙齒得到 的細胞。
23. 如權利要求19所述的永生化幹細胞的產生方法，其特徵在於，所述初生胚為胚盤 期的胚。
24. 如權利要求19?21的任一項所述的永生化幹細胞的產生方法，其特徵在於，所述 哺乳類選自由人、豬、馬以及猴組成的組。
25. 如權利要求19?22的任一項所述的永生化幹細胞的產生方法，其特徵在於，所述 4 種基因為選自由 hTERT、bmi-1、E6、E7、0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 以及 pl6INK4a 組成的 組中的4種。
26. -種經皮吸收方法，其特徵在於，其具備下述工序： 劑型製備工序，利用片狀保溼性部件吸收權利要求11?18的任一項所述的損傷組織 復原用藥物製劑來製成片形製劑； 損傷部位覆蓋工序，利用所述片形製劑來覆蓋損傷的部位；以及 電極接觸工序，使帶正電的電極與所期望的部位接觸。
【文檔編號】A61P25/28GK104321426SQ201380027178
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月28日 優先權日:2012年3月28日
【發明者】上田實 申請人:石匠株式會社