結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒及其製備方法

2023-07-26 15:19:21

專利名稱：結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備及其應用，它屬於醫學分子生物學診斷技術領域，具體是關於結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備及其在結核病診斷中的應用。
背景技術：
在全世界結核病依然是危害人類健康的主要傳染病之一，1985年以來愛滋病的流行、結核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國等歐美發達國家結核病發病率呈回升趨勢，尤其是結核菌耐藥問題和非結核分枝桿菌病的發病率逐年上升使結核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新增結核病人800～1000萬，每年死亡人數約300萬。1993年世界衛生組織(WHO)史無前例地宣布「全球結核病緊急狀態」，1998年又重申遏制結核病的行動刻不容緩。
我國的結核病疫情和耐藥情況都相當嚴重，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二，僅次於印度。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查初步結果表明，我國有5.5億人感染了結核菌；現有肺結核病人451萬，其中傳染性肺結核病人196萬；每年死亡人數約13萬，結核病死亡在我國各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位；耐藥結核病人多，總耐藥率為27.8％，耐多藥率為10.7％，初始耐藥率為18.6％，獲得性耐藥率為46.5％，WHO最近公布的世界38個國家和地區的結核病耐藥監測資料中，中國被列為「特別引起警示的國家和地區」之一。面對這種嚴峻的形勢，結核病的預防和治療已引起國內外學者的高度重視。
目前已闡明了部分結核分枝桿菌耐藥的分子機制，認為結核分枝桿菌耐利福平(RFP)是由於其作用靶分子RNA聚合酶的β亞單位的編碼基因(rpoB)突變所致；耐異煙肼(INH)與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因(katG)或烯醯基還原酶編碼基因(inhA)操縱子或烷基過氧化氫酶編碼基因(ahpC)操縱子或β-醯基酮醯基載體蛋白合成酶編碼基因(kas A)改變有關；耐乙胺丁醇(EMB)與阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因embABC操縱子突變有關；耐鏈黴素(SM)是由於其核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和16SrRNA編碼基因(rrs)突變所致。因此，應用各種基因突變檢測技術分析這些耐藥基因突變位點，即可檢出耐藥的結核分枝桿菌。
在建立的分子藥敏試驗方法中，PCR-SSCP技術雖簡便，但只能判斷基因有無突變，不能檢測出突變的部位和性質，某些耐藥基因位點呈天然多態性或某些基因突變與耐藥無關，因此PCR-SSCP檢測可能出現假陽性；PCR-RFLP技術是通過PCR擴增含有特定酶切位點的DNA片段，該片段經限制性內切酶消化後電泳可顯示兩條較小的片段；若基因發生突變，酶切位點消失，該片段經酶消化後電泳仍顯示一條PCR擴增片段，其優點是具有較高的特異性，但只能用於分析已知序列特定位點的基因點突變；PCR-直接序列法是指耐藥基因PCR擴增產物純化後，直接用於DNA序列分析，該方法不僅能夠檢測出基因突變，而且能夠確定突變的部位與性質，可發現新的突變位點，是檢測基因突變的決定性方法，但技術要求高，需專門的技術人員，所需的測序儀器昂貴，成本高，難以在臨床實驗室常規開展；PCR-基因晶片分析法是應用基因晶片技術同時分析結核分枝桿菌多個耐藥基因，該方法簡便、快速，可大規模地開展工作，但該技術要求高，所需的點樣系統和螢光分析系統昂貴，而難以推廣應用；單鏈探針反向雜交試驗(reversehybridization-based line probe assay，簡稱LiPA)的原理是應用生物素修飾的特異引物擴增DNA，使PCR產物帶有生物素標記物，將PCR產物變性後與固定在一張膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶免疫顯色法顯示結果。比利時Innogenetics公司根據該原理推出了INNO-LiPA Rif.結核分枝桿菌檢測試劑盒及配套的自動檢測儀(Auto-LiPA)，它含有5個針對野生型rpoB基因序列的探針和4個針對特定位點突變的探針，只用於檢測結核分枝桿菌耐RFP基因型，其簡便、快速，易於推廣，但檢測的基因突變的種類有限。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種用於檢測臨床標本或臨床分離株中結核分枝桿菌五種抗結核藥物耐藥基因突變的結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒；本發明的另一目的是提供上述試劑盒的製備方法。
本發明的目的是通過以下技術方案達到的一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，含有結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和結核分枝桿菌耐藥基因PCR擴增試劑，其特徵在於所述結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片是在硝酸纖維膜上固定2個針對分枝桿菌屬和結核分枝桿菌複合群16S核糖體核糖核酸(簡稱rRNA)而設計的寡聚核苷酸探針，以及一系列針對結核分枝桿菌耐藥基因rpoB、katG、embB、rpsL和rrs而設計的寡聚核苷酸探針，在3』末端加有80-110個脫氧核糖核酸(簡稱dT)；所述的結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑包括5-10倍PCR緩衝液(包括50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明膠)，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度各為2.5-12.5μmol/L的5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑各組分的終濃度如下1倍PCR緩衝液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的終濃度各為0.2mmol/L，5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物的終濃度各為0.2-1.0umol/L，TaqDNA聚合酶2-5U/100μl。
一種優選技術方案，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為15-18個鹼基。
一種優選技術方案，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針序列如下表所示。


一種優選技術方案，其特徵在於所述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物序列如下

一種優選技術方案，其特徵在於所述的結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增是將5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB和katG基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合在一起擴增，而將5』端帶生物素標記的結核分枝桿菌embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合在一起擴增。
一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟1.結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片的製備方法如下(1)根據現有技術合成上述寡核苷酸探針；(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩衝液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為2-6pmol/μl；(3)將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預處理10-30min，晾乾或42℃以下烘乾；(4)取0.6-1μl寡核苷酸探針點於預處理後的硝酸纖維膜上，60-80℃烘烤1-2小時或紫外燈下照射10-20分鐘，用水簡單漂洗，晾乾備用；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成上述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物，用1mMTris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋合成的5』端帶生物素標記的上遊引物和不帶標記的下遊引物，使其濃度為2.5-12.5μmol/L；(2)取5-10倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為2.5-12.5μmol/L的5』端帶生物素標記的上遊引物和不帶標記的下遊引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；3.結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的裝配將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑裝入一容器。
一種優選技術方案，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為15-18個鹼基。
一種優選技術方案，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針序列如下表所示。


一種優選技術方案，其特徵在於所述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物序列如下

本發明的結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒及其製備方法，根據不同分枝桿菌屬和結核分枝桿菌複合群16S核糖體核糖核酸(簡稱rRNA)而設計、合成相應的寡核苷酸探針，通過點樣法將寡核苷酸探針按一定的順序點在經預處理的硝酸纖維膜上，製成耐藥基因檢測鑑定膜片，與帶生物素標記的PCR擴增產物雜交，根據探針雜交的藍紫色信號強弱用肉眼判讀結果，可用於檢測臨床標本或臨床分離株中結核分枝桿菌五種抗結核藥物耐藥基因。
下面通過附圖和具體實施方式
對本發明做進一步說明，但並不意味著對本發明保護範圍的限制。


圖1-1為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 531位密碼子突變型；圖1-2為採用直接測序鑑定法測定的katG 315位密碼子野生型；圖1-3為採用直接測序鑑定法測定的embB306位密碼子野生型；圖1-4為採用直接測序鑑定法測定的rpsL43位密碼子野生型；圖1-5為採用直接測序鑑定法測定的rrs 513位突變型；圖2為應用本發明耐藥基因檢測膜片測定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.2084的結果；圖3-1為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 526位密碼子突變型；圖3-2為採用直接測序鑑定法測定的katG 315位密碼子野生型；圖3-3為採用直接測序鑑定法測定的embB306位密碼子突變型；圖3-4為採用直接測序鑑定法測定rpsL43位密碼子突變型；圖3-5為採用直接測序鑑定法測定rrs 513位鹼基野生型；圖4為應用本發明耐藥基因檢測膜片測定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.99-41的結果；圖5-1為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 511位密碼子野生型；圖5-2為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 513位密碼子野生型；圖5-3為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 516位密碼子野生型；圖5-4為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 526位密碼子野生型；圖5-5為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 531位密碼子野生型；圖5-6為採用直接測序鑑定法測定的rpoB 533位密碼子野生型；圖5-7為採用直接測序鑑定法測定的katG 315位密碼子突變型；圖5-8為採用直接測序鑑定法測定的embB306位密碼子突變型；圖5-9為採用直接測序鑑定法測定的rpsL43位密碼子野生型；圖5-10為採用直接測序鑑定法測定的rrs 513位突變型；圖6為應用本發明耐藥基因檢測膜片測定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.816的結果。
具體實施例方式
對比例1採用PCR-直接測序鑑定法鑑定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.2084。
1.樣品處理及DNA提取將來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.2084滅活後，提取DNA；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成下述結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物及下遊引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋，使其濃度為3.75μmol/L；(2)取10倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及5U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為3.75μmol/L的結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和下遊引物分別裝入一無菌的塑料管中備用。
3.結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑的保存將結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑保存於-20℃冰箱中，不要保存在無霜型冰箱的冷凍室，若保存得當，可保持活性一年。
4.PCR擴增①反應體系總體積各100μl。
②在5個0.5ml塑料離心管中分別加入下列試劑試劑I加樣順序 體積(μl)水 157.010×PCR緩衝液 210.03.75μmol/L rpoB上遊引物38.03.75μmol/L rpoB下遊引物48.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 58.0和dTTPDNA樣品 68.0總計 99.0試劑II 加樣順序 體積(μl)水 157.010×PCR緩衝液 210.03.75μmol/L katG上遊引物38.03.75μmol/L katG下遊引物48.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 58.0和dTTPDNA樣品 68.0總計 99.0
試劑III 加樣順序 體積(μl)水 1 57.010×PCR緩衝液 2 10.03.75μmol/L embB上遊引物3 8.03.75μmol/L embB下遊引物4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 99.0試劑IV 加樣順序體積(μl)水 1 57.010×PCR緩衝液 2 10.03.75μmol/L rpsL上遊引物3 8.03.75μmol/L rpsL下遊引物4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 99.0試劑V 加樣順序 體積(μl)水 1 57.010×PCR緩衝液 2 10.03.75μmol/L rrs上遊引物 3 8.03.75μmol/L rrs下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 99.0③混勻後，分別於95℃變性8min。
④稍冷卻後，分別加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混勻，分別加液體石蠟40μl，以防擴增過程中水份蒸發，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產的PCR擴增儀中，於94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環35次。最後72℃延伸5分鐘。
⑥分別取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，結果分別可見一條240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接測序鑑定法分別將剩餘的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR擴增產物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下遊引物一起送上海生工生物技術有限公司進行DNA測序。
6.測序結果如圖1-1至圖1-5所示，用生物分析軟體GENEDOC分析顯示結核分枝桿菌臨床分離株No.2084的rpoB基因531位密碼子(TTG)與結核分枝桿菌標準株rpoB基因531位密碼子(TCG)不同，說明該分離株rpoB531位密碼子發生點突變；rrs基因513位鹼基(C)與結核分枝桿菌標準株rrs基因513位鹼基(A)不同，說明該分離株rrs基因513位密碼子發生點突變；katG、embB和rpsL基因序列與結核分枝桿菌標準株的完全相同，說明該分離株katG、embB和rpsL基因未發生突變，為野生型。
實施例1一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟1.結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片的製備方法如下(1)根據現有技術合成下述寡核苷酸探針


所有的寡聚核苷酸探針在3』末端加有100個dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩衝液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為6pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配製氯化鈉175.3g，檸檬酸鈉88.2g，溶於800ml蒸餾水中，用10M氫氧化鈉調pH至7.0，然後定容至1000ml，高壓滅菌。取20×SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍成2×SSC溶液，將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預處理10min，置37℃溫箱烘乾；(4)取0.8μl寡核苷酸探針點於預處理後的硝酸纖維膜上，在紫外燈下照射10分鐘，用水簡單漂洗，晾乾備用；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成下述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋，使其濃度各為3.75μmol/L；(2)取10倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為3.75μmol/L的5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合(簡稱混合引物I)裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為3.75μmol/L的5』端帶生物素標記的結核分枝桿菌embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合(簡稱混合引物II)裝入一無菌的塑料管中備用。
3.結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的裝配及保存將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片密封后和結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑裝入一紙盒容器，保存於-20℃冰箱中，不要保存在無霜型冰箱的冷凍室，若保存得當，可保持活性一年。
結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的應用(1)樣品處理及DNA提取將來自於解放軍309醫院的分枝桿菌臨床分離株No.2084滅活後，提取DNA；(2)PCR擴增①反應體系總體積各100μl。
②在2個0.5ml塑料離心管中分別加入下列試劑試劑I 加樣順序 體積(μl)水 1 65.010×PCR緩衝液2 10.03.75μmol/L混合引物I 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0和dTTPDNA樣品 5 8.0總計 99.0試劑II加樣順序 體積(μl)水 1 65.010×PCR緩衝液2 10.03.75μmol/L混合引物II3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0和dTTPDNA樣品 5 8.0總計 99.0③混勻後，分別於95℃變性8min。
④稍冷卻後，分別加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混勻，分別加液體石蠟40μl，以防擴增過程中水份蒸發，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產的PCR擴增儀中，於94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環35次。最後72℃延伸5分鐘。
分別取5μl試劑I和試劑II的PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，結果分別可見二條240bp和273-280bp以及二條258bp、215-200bp的片段。
(3)預雜交液配製6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS)溶液。
50×Denharts溶液10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液 5ml10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml加水定容至 100ml(4)預雜交將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和4ml預雜交液裝入雜交袋中，於37℃水浴孵育30min；(5)雜交將試劑I和試劑II的PCR擴增產物40μl分別置98℃變性10min，置冰浴中冷卻5min後，加入雜交袋中，於37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS於室溫洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS於室溫洗膜10min；
(7)加酶將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片轉入新的雜交袋中，與1∶1000的鏈親和素-鹼性磷酸酶(SA-AP)於37℃水浴反應30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))於室溫洗膜10min，用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))於室溫洗膜10min；(9)顯色將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片轉入新的雜交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(簡稱BCIP)和硝基藍四氮唑(簡稱NBT)底物中閉光顯色10min。結果見圖2。
(10)結果判定如圖2所示，根據探針雜交的藍紫色信號強弱，可見M探針和a探針雜交陽性，其餘探針雜交陰性，從而可判定該細菌屬於分枝桿菌屬，並可鑑定為結核分枝桿菌複合群；結核分枝桿菌rpoB 531位突變型探針No.1b的雜交信號遠遠強於野生型探針No.1，說明rpoB 531位密碼子由TCG突變為TTG；而katG 315位野生型探針K1的雜交信號遠遠強於突變型探針K1b和K1c，說明katG 315位密碼子未發生突變；embB306位野生型探針E1的雜交信號遠遠強於突變型探針E1b、E1c、E1d和E1e，說明embB306位密碼子未發生突變；rpsL43位野生型探針S1的雜交信號遠遠強於突變型探針S1b，說明rpsL43位密碼子未發生突變；rrs 513位鹼基突變型探針rrs1b遠遠強於野生型探針rrs1和突變型探針rrs1c的雜交信號，說明rrs 513位鹼基A突變為C。
對比例2採用PCR-直接測序鑑定法鑑定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.99-41。
1.樣品處理及DNA提取將來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.99-41滅活後，提取DNA；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成下述結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物及下遊引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋，使其濃度各為2.5μmol/L；(2)取5倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L 的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μlTaq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為2.5μmol/L的結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和下遊引物分別裝入一無菌的塑料管中備用。
3.結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑的保存將結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑保存於-20℃冰箱中，不要保存在無霜型冰箱的冷凍室，若保存得當，可保持活性一年。
4.PCR擴增①反應體系總體積各100μl。
②在5個0.5ml塑料離心管中分別加入下列試劑試劑I 加樣順序 體積(μl)水 1 43.05×PCR緩衝液 2 20.02.5μmol/L rpoB上遊引物 3 8.02.5μmol/L rpoB下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 95.0試劑II加樣順序 體積(μl)水 1 43.05×PCR緩衝液 2 20.02.5μmol/L katG上遊引物 3 8.02.5μmol/L katG下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 95.0試劑III 加樣順序 體積(μl)水 1 43.015×PCR緩衝液2 20.02.5μmol/L embB上遊引物 3 8.02.5μmol/L embB下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 95.0試劑IV加樣順序 體積(μl)水 1 43.05×PCR緩衝液 2 20.02.5μmol/L rpsL上遊引物 3 8.02.5μmol/L rpsL下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計 95.0
試劑V加樣順序 體積(μl)水 1 43.05×PCR緩衝液 2 20.02.5μmol/L rrs上遊引物 3 8.02.5μmol/L rrs下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計95.0③混勻後，分別於95℃變性8min。
④稍冷卻後，分別加Taq DNA聚合酶5μl(含5U)，混勻，分別加液體石蠟40μl，以防擴增過程中水份蒸發，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產的PCR擴增儀中，於94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環35次。最後72℃延伸5分鐘。
⑥分別取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，結果分別可見一條240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接測序鑑定法分別將剩餘的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR擴增產物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下遊引物一起送上海生工生物技術有限公司進行DNA測序。
6.測序結果如圖2-1至圖2-5所示，用生物分析軟體GENEDOC分析顯示結核分枝桿菌臨床分離株No.99-41的rpoB基因526位密碼子(GAC)與結核分枝桿菌標準株rpoB基因526位密碼子(CAC)不同，說明該分離株rpoB526位密碼子發生點突變；embB基因306位密碼子(GTG)與結核分枝桿菌標準株embB基因306位密碼子(ATG)不同，說明該分離株embB306位密碼子發生點突變；rpsL基因43位密碼子(AGG)與結核分枝桿菌標準株rpsL基因43位密碼子(AAG)不同，說明該分離株rpsL43位密碼子發生點突變；katG和rrs基因序列與結核分枝桿菌標準株的完全相同，說明該分離株katG和rrs基因未發生突變，為野生型。
實施例2一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟1.結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片的製備方法如下(1)根據現有技術合成下述寡核苷酸探針


所有的寡聚核苷酸探針在3』末端加有90個dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩衝液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為4pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配製氯化鈉175.3g，檸檬酸鈉88.2g，溶於800ml蒸餾水中，用10M氫氧化鈉調pH至7.0，然後定容至1000ml，高壓滅菌。取20×SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍成2×SSC溶液，將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預處理10min，置37℃溫箱烘乾；(4)取0.6μl寡核苷酸探針點於預處理後的硝酸纖維膜上，60℃烘烤1小時，用水簡單漂洗，晾乾備用；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成下述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物
本發明產品成品後，要達到以下標準(A)外觀

(B)性能

2.5μmol/L混合引物II 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0和dTTPDNA樣品 5 8.0總計95.0③混勻後，分別於95℃變性8min。
④稍冷卻後，分別加Taq DNA聚合酶5μl(含5U)，混勻，分別加液體石蠟40μl，以防擴增過程中水份蒸發，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產的PCR擴增儀中，於94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環35次。最後72℃延伸5分鐘。
分別取5μl試劑I和試劑II的PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，結果分別可見二條240bp和273-280bp以及二條258bp、215-200bp的片段。
(3)預雜交液配製6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液5ml10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml加水定容至 100ml(4)預雜交將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和4ml預雜交液裝入雜交袋中，於37℃水浴孵育30min；(5)雜交將試劑I和試劑II的PCR擴增產物40μl分別置98℃變性10min，置冰浴中冷卻5min後，加入雜交袋中，於37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS於室溫洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS於室溫洗膜10min；(7)加酶將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片轉入新的雜交袋中，與1∶1000的鏈親和素-鹼性磷酸酶(SA-AP)於37℃水浴反應30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))於室溫洗膜10min，用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))於室溫洗膜10min；(9)顯色將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片轉入新的雜交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(簡稱BCIP)和硝基藍四氮唑(簡稱NBT)底物中閉光顯色10min。結果見圖4。
(10)如圖4所示，為應用本發明耐藥基因檢測膜片測定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.99-41的結果。根據探針雜交的藍紫色信號強弱，可見M探針和a探針雜交陽性，其餘探針雜交陰性，從而可判定該細菌屬於分枝桿菌屬，並可鑑定為結核分枝桿菌複合群；結核分枝桿菌rpoB 526位突變型探針No.2c的雜交信號遠遠強於野生型探針No.2，說明rpoB 526位密碼子由CAC突變為GAC；而katG 315位野生型探針K1的雜交信號遠遠強於突變型探針K1b和K1c，說明katG 315位密碼子未發生突變；embB306位突變型探針E1b的雜交信號遠遠強於野生型探針E1，說明embB306位密碼子由ATG突變為GTG；rpsL43位突變型探針S1b的雜交信號遠遠強於野生型探針S1，說明rpsL43位密碼子由AAG突變為AGG；rrs 513位鹼基野生型探針rrs1的雜交信號遠遠強於突變型探針rrs1b和rrs1c，說明rrs 513位鹼基未發生突變。
對比例3採用PCR-直接測序鑑定法鑑定來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.816。
1.樣品處理及DNA提取將來自於解放軍309醫院的結核分枝桿菌臨床分離株No.816滅活後，提取DNA；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成下述結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物及下遊引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋，使其濃度為12.5μmol/L；(2)取10倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為12.5μmol/L的結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和下遊引物分別裝入一無菌的塑料管中備用。
3.結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑的保存將結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑保存於-20℃冰箱中，不要保存在無霜型冰箱的冷凍室，若保存得當，可保持活性一年。
4.PCR擴增①反應體系總體積各100μl。
②在5個0.5ml塑料離心管中分別加入下列試劑試劑I 加樣順序體積(μl)水 1 57.510×PCR緩衝液2 10.012.5μmol/L rpoB上遊引物 3 8.012.5μmol/L rpoB下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計99.5試劑II 加樣順序 體積(μl)水 1 57.510×PCR緩衝液2 10.0
12.5μmol/L katG上遊引物 3 8.012.5μmol/L katG下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計99.5試劑III加樣順序 體積(μl)水1 57.510×PCR緩衝液 2 10.012.5μmol/L embB上遊引物 3 8.012.5μmol/L embB下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計99.5試劑IV加樣順序體積(μl)水1 57.510×PCR緩衝液 2 10.012.5μmol/L rpsL上遊引物 3 8.012.5μmol/L rpsL下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計99.5試劑V 加樣順序 體積(μl)水1 57.510×PCR緩衝液 2 10.012.5μmol/L rrs上遊引物 3 8.012.5μmol/L rrs下遊引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA樣品 6 8.0總計99.5③混勻後，分別於95℃變性8min。
④稍冷卻後，分別加Taq DNA聚合酶0.5μl(含5U)，混勻，分別加液體石蠟40μl，以防擴增過程中水份蒸發，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產的PCR擴增儀中，於94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環35次。最後72℃延伸5分鐘。
⑥分別取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，結果分別可見一條240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接測序鑑定法分別將剩餘的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR擴增產物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下遊引物一起送上海生工生物技術有限公司進行DNA測序。
6.測序結果如圖5-1至圖5-10所示，用生物分析軟體GENEDOC分析顯示結核分枝桿菌臨床分離株No.816的rpoB基因序列與結核分枝桿菌標準株的完全相同，說明該分離株rpoB基因未發生突變，為野生型；katG 315位密碼子(ACC)與結核分枝桿菌標準株315位密碼子(AGC)不同，說明該分離株katG 315位密碼子發生點突變；embB基因306位密碼子(ATA)與結核分枝桿菌標準株embB基因306位密碼子(ATG)不同，說明該分離株embB306位密碼子發生點突變；rrs基因513位鹼基(T)與結核分枝桿菌標準株rrs基因513位鹼基(A)不同，說明該分離株rrs基因513位密碼子發生點突變；rpsL序列與結核分枝桿菌標準株的完全相同，說明該分離株rpsL基因未發生突變，為野生型。
實施例3一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟1.結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片的製備方法如下(1)根據現有技術合成下述寡核苷酸探針


所有的寡聚核苷酸探針在3』末端加有80個dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩衝液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為2pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配製氯化鈉175.3g，檸檬酸鈉88.2g，溶於800ml蒸餾水中，用10M氫氧化鈉調pH至7.0，然後定容至1000ml，高壓滅菌。取20×SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍成2×SSC溶液，將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預處理10min，置37℃溫箱烘乾；(4)取1μl寡核苷酸探針點於預處理後的硝酸纖維膜上，在紫外燈下照射20分鐘，用水簡單漂洗，晾乾備用；2.結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成下述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物

用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋，使其濃度為12.5μmol/L；(2)取10倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為12.5μmol/L的5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合(簡稱混合引物I)裝入一無菌的塑料管中備用；濃度各為12.5μmol/L的5』端帶生物素標記的結核分枝桿菌embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合(簡稱混合引物II)裝入一無菌的塑料管中備用。
3.結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的裝配及保存將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片密封后和結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑裝入一容器，保存於-20℃冰箱中，不要保存在無霜型冰箱的冷凍室，若保存得當，可保持活性一年。
結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的應用(1)樣品處理及DNA提取將來自於解放軍309醫院的分枝桿菌臨床分離株No.816滅活後，提取DNA；(2)PCR擴增①反應體系總體積各100μl。
②在2個0.5ml塑料離心管中分別加入下列試劑試劑I 加樣順序 體積(μl)水 1 65.510×PCR緩衝液 2 10.012.5μmol/L混合引物I 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP4 8.0和dTTPDNA樣品5 8.0總計 99.5試劑II 加樣順序體積(μl)水 1 65.510×PCR緩衝液 2 10.012.5μmol/L混合引物II 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP4 8.0和dTTPDNA樣品5 8.0總計 99.5③混勻後，分別於95℃變性8min。
④稍冷卻後，分別加Taq DNA聚合酶0.5μl(含5U)，混勻，分別加液體石蠟40μl，以防擴增過程中水份蒸發，離心5秒使之分層良好。
⑤置珀金埃爾默公司生產的PCR擴增儀中，於94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環35次。最後72℃延伸5分鐘。
分別取5μl試劑I和試劑II的PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，結果分別可見二條240bp和273-280bp以及二條258bp、215-200bp的片段。
(3)預雜交液配製6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液 5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA1ml加水定容至100ml(4)預雜交將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和4ml預雜交液裝入雜交袋中，於37℃水浴孵育30min；(5)雜交將試劑I和試劑II的PCR擴增產物40μl分別置98℃變性10min，置冰浴中冷卻5min後，加入雜交袋中，於37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS於室溫洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS於室溫洗膜10min；(7)加酶將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片轉入新的雜交袋中，與1∶1000的鏈親和素-鹼性磷酸酶(SA-AP)於37℃水浴反應30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))於室溫洗膜10min，用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))於室溫洗膜10min；(9)顯色將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片轉入新的雜交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(簡稱BCIP)和硝基藍四氮唑(簡稱NBT)底物中閉光顯色10min。結果見圖6。
(10)結果判定如圖6所示，根據探針雜交的藍紫色信號強弱，可見M探針和a探針雜交陽性，其餘探針雜交陰性，從而可判定該細菌屬於分枝桿菌屬，並可鑑定為結核分枝桿菌複合群；結核分枝桿菌rpoB 531、526、516、533、513、511位野生型探針No.1、2、3、4、5、6的雜交信號遠遠強於突變型探針No.1b、No.1c No.1d、No.2b、No.2c、No.2d、No.2e、No.3b、No.4b、No.5b、No.6b，說明rpoB基因未發生突變；katG 315位突變型探針K1b的雜交信號遠遠強於野生型探針K1和突變型探針K1c，說明katG 315位密碼子由AGC突變為ACC；embB306位突變型探針E1d的雜交信號遠遠強於野生型探針E1，說明embB306位密碼子由ATG突變為ATA；rrs 513位鹼基突變型探針rrs1c遠遠強於野生型探針rrs1和突變型探針rrs1b的雜交信號，說明rrs 513位鹼基A突變為T；rpsL43位密碼子野生型探針S1的雜交信號遠遠強於突變型探針S1b，說明rpsL43位密碼子未發生突變。
權利要求
1.一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，含有結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和結核分枝桿菌耐藥基因PCR擴增試劑，其特徵在於所述結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片是在硝酸纖維膜上固定2個針對分枝桿菌屬和結核分枝桿菌複合群16S核糖體核糖核酸而設計的寡聚核苷酸探針，以及一系列針對結核分枝桿菌耐藥基因rpoB、katG、embB、rpsL和rrs而設計的寡聚核苷酸探針，在3』末端加有80-110個脫氧核糖核酸；所述的結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑包括5-10倍PCR緩衝液，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度各為2.5-12.5μmol/L的5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑各組分的終濃度如下1倍PCR緩衝液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的終濃度各為0.2mmol/L，5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物的終濃度各為0.2-1.0umol/L，TaqDNA聚合酶2-5U/100μl。
2.根據權利要求1所述的耐藥基因檢測試劑盒，其特徵在於所述PCR緩衝液包括50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明膠。
3.根據權利要求1所述的耐藥基因檢測試劑盒，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為15-18個鹼基。
4.根據權利要求1所述的耐藥基因檢測試劑盒，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針序列如下表所示。
5.根據權利要求1所述的耐藥基因檢測試劑盒，其特徵在於所述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物序如下表所示。
6.根據權利要求1所述的耐藥基因檢測試劑盒，其特徵在於所述的結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增是將5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB和katG基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合在一起擴增，而將5』端帶生物素標記的結核分枝桿菌embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物混合在一起擴增。
7.一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟[1].結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片的製備方法如下(1)根據現有技術合成上述寡核苷酸探針；(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA緩衝液稀釋合成的寡核苷酸探針，使其濃度為2-6pmol/μl；(3)將硝酸纖維膜浸入2×SSC溶液中預處理10-30min，晾乾或42℃以下烘乾；(4)取0.6-1μl寡核苷酸探針點於預處理後的硝酸纖維膜上，60-80℃烘烤1-2小時或紫外燈下照射10-20分鐘，用水簡單漂洗，晾乾備用；[2].結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑的配製方法如下(1)根據現有技術合成上述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物，用1mMTris.HCl-0.1mM EDTA緩衝液稀釋合成的5』端帶生物素標記的上遊引物和不帶標記的下遊引物，使其濃度為2.5-12.5μmol/L；(2)取5-10倍PCR緩衝液、濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、濃度各為2.5-12.5μmol/L的5』端帶生物素標記的上遊引物和不帶標記的下遊引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各裝入一無菌的塑料管中備用；[3].結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒的裝配將結核分枝桿菌耐藥基因檢測膜片和結核分枝桿菌耐藥基因多重PCR擴增試劑裝入一容器。
8.根據權利要求7所述的耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針的特異性核苷酸序列為15-18個鹼基。
9.根據權利要求7所述的耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述寡聚核苷酸探針序列如下表所示。
10.根據權利要求7所述的耐藥基因檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述5』端帶生物素標記的分枝桿菌16S rRNA、結核分枝桿菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上遊引物和不帶標記的下遊引物序列如下表如示。
全文摘要
本發明涉及一種結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒及其製備方法，根據不同分枝桿菌屬和結核分枝桿菌複合群16S核糖體核糖核酸(簡稱rRNA)而設計、合成相應的寡核苷酸探針，通過點樣法將寡核苷酸探針按一定的順序點在經預處理的硝酸纖維膜上，製成耐藥基因檢測鑑定膜片，與帶生物素標記的PCR擴增產物雜交。利用本發明，根據探針雜交的藍紫色信號強弱用肉眼判讀結果，可用於檢測臨床標本或臨床分離株中結核分枝桿菌五種抗結核藥物耐藥基因。
文檔編號C12Q1/18GK1635159SQ20041008382
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月19日 優先權日2004年10月19日
發明者吳國瓊, 梁建琴, 張俊仙, 李洪敏 申請人:中國人民解放軍第三0九醫院