核酸提取方法及核酸提取裝置的製作方法

2023-07-26 13:23:51 2

專利名稱：核酸提取方法及核酸提取裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及這樣一種核酸提取方法，該方法使用裝配有過濾材料 的核酸提取柱來自動地提取樣品溶液中的核酸；本發明還涉及核酸提 取裝置。
背景技術：
關於提取核酸的相關方法，存在這樣一些方法，其中要施加離心 力、使用磁珠、使用過濾器等。例如有這樣一種方法使用固相(例 如二氧化矽、二氧化矽聚合物或矽酸鎂)來吸附核酸，然後通過隨後 的操作(例如洗滌和解吸附)來純化核酸(例如，參見日本專利公報
No. 07/051,065)。

發明內容
然而，儘管上述提取核酸的相關方法在分離性能方面表現良好， 但是，它們在簡便性、快速性和自動化適應性方面還存在不足。還存
在的其它問題是難以進行具有相同性能的吸附介質的工業化大規模
生產；不便於處理；並且難以模製成各種形狀；等等。
本發明是考慮到上述情況而完成的，並且本發明的目的是提供一 種核酸提取方法，其中在核酸分離純化過程中，通過使用核酸吸附性 固體載體來吸附含有核酸的樣品溶液中的核酸，隨後通過洗滌等使核 酸解吸附，從而以如下優點來處理含核酸的樣品溶液高效、簡便、 快速、良好的自動化適應性和良好的重複性；本發明的目的還在於提 供核酸提取裝置。
通過以下內容可以實現本發明的目的。 (1). 一種提取核酸的方法，該方法包括
通過使含核酸的樣品溶液與核酸吸附性固體載體接觸，從而將核
酸吸附到所述的核酸吸附性固體載體上；
在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固體載體上時，通過使洗滌 液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而對所述的核酸吸附性固體 載體進行洗滌；以及
通過將回收液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而使所述核 酸從所述的核酸吸附性固體載體上解吸附；
其中，在所述洗滌液的分注及允許停留的時間以及所述回收液的 分注及允許停留的時間這二者中，至少有一個所述時間被控制為預定 時間。
(2) .上述(l)中所述的方法，
其中將所述洗滌液的允許停留時間控制為50秒到1,000秒。
(3) .上述(l)中所述的方法，
其中將所述洗滌液的允許停留時間控制為100秒到300秒。
(4) .上述(1)到(3)中的任意一項所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時間控制為20秒到300秒。
(5) .上述(1)到(3)中的任意一項所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時間控制為25秒到60秒。
(6) .上述(1)到(5)中的任意一項所述的方法，
其中所述的核酸吸附性固體載體是通過基本不涉及離子鍵的相 互作用來吸附核酸的核酸吸附性固體載體。
(7) . (1)到(6)中的任意一項所述的方法， 其中用於製備含核酸的樣品溶液的方法包括 將含有選自離液鹽、表面活性劑、消泡劑、蛋白酶和核酸穩定劑
中的化合物的預處理溶液與試驗樣品混合，從而得到混合後的溶液； 以及
向所述的混合溶液中加入水溶性有機溶劑。
(8) .上述(7)中所述的方法，
其中所述的核酸穩定劑為巰基化合物。
(9) .上述(7)或(8)中所述的方法， 其中所述的離液鹽為胍鹽。
(10) .上述(7)到(9)中所述的方法，
其中所述的水溶性有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至 少一種。
(11) .上述(1)到(10)中的任意一項所述的方法，
其中所述的核酸吸附性固體載體被容納於核酸提取柱的、具有至 少兩個開口的容器的內部；以及
其中所述方法包括
在將所述的含核酸的樣品溶液分注到所述的核酸提取柱中之後， 通過壓力差使所述的樣品溶液中的所述核酸吸附到所述的核酸吸附 性固體載體上；
在將所述的洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之後，通過壓力差 除去雜質；以及
在將所述的回收液分注到所述的核酸提取柱中之後，通過壓力差 使吸附到所述的核酸吸附性固體載體上的所述核酸從該核酸吸附性 固體載體上分離出來，從而與所述回收液一起回收所述核酸。
(12) . —種用於實施上述(ll)中的所述方法的核酸提取裝置， 其中所述的核酸吸附性固體載體為過濾材料。
(13) .上述(12)中所述的核酸提取裝置，
其中所述的核酸提取裝置通過加壓自動地實施提取操作；以及
其中所述的提取操作包括
在將所述的含核酸的樣品溶液分注到核酸提取柱中之後，樣品溶 液中的核酸被吸附到所述的過濾材料上；
在將洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之後，除去雜質；以及 在將回收液分注到所述的核酸提取柱中之後，使吸附到所述的過
濾材料上的所述核酸從該過濾材料上分離出來；從而與所述回收液一
起回收所述核酸。
(14) .上述(12)或(13)中所述的核酸提取裝置，該裝置包括 壓縮空氣供給機構，其通過加壓嘴將壓縮空氣引入到所述的核酸
提取柱中；以及
分注機構，該機構包括第一分注嘴，用於將洗滌液分注到所述
的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用於將回收液分注到所述的核酸 提取柱中。
(15).上述(12)到(14)中的任意一項所述的核酸提取裝置，該裝 置包括
保持機構，用於保持多個經排布的核酸提取柱和多個經排布的回 收容器，所述回收容器用於接收所述的含核酸的回收液；
壓縮空氣供給機構，用於將壓縮空氣由單個加壓嘴引入到所述的 多個經排布的核酸提取柱中；
分注機構，該機構包括第一分注嘴，用於將洗滌液分注到所述 的多個經排布的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用於將回收液分注 到所述的多個經排布的核酸提取柱中；以及
移動裝置，用於使所述的壓縮空氣供給機構的所述的單個加壓嘴 和所述的保持機構這兩者之一相對於另一者進行相對移動。
根據如此構造，就能夠通過簡單的裝置進行核酸提取操作，其中 核酸提取柱和接收含核酸的回收液的回收容器分別被排布在多個位 置上，並由保持機構保持；壓縮空氣供給機構的單個加壓嘴和分注機 構的分注嘴可相對移動，從而將壓縮空氣引入核酸提取柱中，並且對 洗滌液和回收液進行分注；並且，核酸提取柱中的過濾材料所吸附的 核酸被分離和回收。
(16) .上述(12)到(15)中的任意一項所述的核酸提取裝置， 其中，所述的多個經排布的核酸提取柱被支承在固定側；以及 其中，所述的壓縮空氣供給機構的所述的單個加壓嘴以在所述的
多個經排布的核酸提取柱的排布方向上可移動的方式受到支承。
根據如此構造，當加壓嘴沿核酸提取柱的排布方向進行移動時， 就可以依次向多個核酸提取柱中供入氣體。
(17) .上述(12)到(16)中的任意一項所述的核酸提取裝置，
其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴中的至少一者與所 述的單個加壓嘴被設置成一體化的可移動件。
根據如此構造，當加壓嘴與分注嘴被設置成一體化的可移動件 時，可以簡單地設置壓縮空氣供給機構和分注機構。
(18) .上述(12)到(17)中的任意一項所述的核酸提取裝置，
其中，所述的壓縮空氣供給機構的所述的單個加壓嘴被支承在固
定側；以及
其中，所述的多個經排布的核酸提取柱以在該多個經排布的核酸 提取柱的排布方向上可移動的方式受到支承。
根據如此構造，當固定分注嘴而移動核酸提取柱時，大量核酸提 取柱都能夠依次受到加壓、分注、洗滌、分注和回收這些處理中的每 一步處理，並且當已處理的核酸提取柱和回收容器接著換成未處理的 核酸提取柱和回收容器時，就可以以連續的方式進行大量處理。
(19) .上述(12)到(18)中的任意一項所述的核酸提取裝置， 其中，以相同的排布間距來設置所述的多個核酸提取柱；以及 其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴分別與所述的單個
加壓嘴的排布距離均為所述的多個核酸提取柱的所述的相同的排布 間距的整數倍。
根據如此構造，以相同的排布間距來設置核酸提取柱，並且分注 嘴與加壓嘴之間的排布距離是核酸提取柱的排布間距的整數倍，因 此，在這種情況下，就可以同時對多個不同的核酸提取柱進行分注處 理和加壓處理，從而使處理時間縮短。


圖1示出核酸提取裝置的一個實施方案，並且是示出移去蓋子 後的狀態的斜視圖。
圖2是核酸提取裝置的移動頭的結構輪廓圖。 圖3是核酸提取裝置的結構輪廓框圖。
圖4A是提取柱的斜視圖，而圖4B是沿該提取柱的IVB-IVB截 取的剖面圖。
圖5A到5G是提取操作的步驟圖。
圖6A到6C是示出由移動頭向提取柱供入壓縮空氣的方式的示意圖。
圖7A到7B是示出從移動頭向提取柱分注洗滌液的方式的示意
10
圖。
圖8A到8B是示出從移動頭向提取柱分注回收液的方式的示意圖。
圖9是示出核酸提取裝置的另一個實施方案的結構輪廓圖。 圖IO是示出本發明的核酸提取步驟的工藝流程圖。 圖11是示出核酸收率與洗滌液注入後的允許停留時間之間的關 系的圖。
圖12是示出核酸收率與回收液注入後的允許停留時間之間的關 系的圖。
2表示裝置主體，3表示保持機構，4表示壓縮空氣供給機構，5 表示分注機構，6表示臺架，7表示移動裝置，ll表示提取柱(核酸 提取柱)，lib表示核酸吸附性多孔膜，12表示廢液容器，13表示 回收容器，21表示柱支架，22表示容器保持立架，40表示移動頭(可 移動件)，41表示加壓嘴，43表示氣泵，45表示開關閥，46表示壓 力傳感器，51w和51r分別表示分注嘴，52w和52r分別表示供給泵， 56w和56r分別表示瓶子，70表示控制部分，72表示存儲部分，100 表示核酸提取裝置，S表示樣品溶液，W表示洗滌液，R表示回收液。
本發明的最佳實施方案
下文中，將給出本發明的核酸提取裝置的實施方式的詳細描述， 該提取裝置適用於實施本發明的核酸提取方法。
圖1示出核酸提取裝置的一個實施方案，並且是示出移去蓋子 後的狀態的斜視圖；圖2是核酸提取裝置的移動頭的結構輪廓圖；圖 3是核酸提取裝置的結構輪廓框圖。
通過設置以下部分而構成本發明的核酸提取裝置ioo，所述部分
為保持機構3，其中，多個核酸提取柱(下文簡稱為"提取柱") 以及回收容器13分別被保持並排布在容納部件中，所述的提取柱中 裝有過濾材料，所述的回收容器用於接收含核酸的回收液；壓縮空氣 供給機構4，其中壓縮空氣由單個加壓嘴41引入提取柱11中；分注 機構5，其具有將洗滌液和回收液分別注入到提取柱11中的分注嘴
51;移動裝置7，其可以使保持機構3和壓縮空氣供給機構4的加壓 嘴41相對移動。關於過濾材料，可以使用核酸吸附性固體載體，例 如核酸吸附性多孔物質(本文中為核酸吸附性多孔膜)。
在其中實施本發明的核酸提取方法的核酸提取裝置100中，相
繼實施以下步驟步驟(l)，使含核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多 孔膜，從而用所述的多孔膜吸附核酸；步驟(2)，在核酸被吸附的狀 態下來洗滌所述的核酸吸附性多孔膜；以及步驟(3)，使回收液通過 所述的核酸吸附性多孔膜，從而使核酸從所述的多孔膜上分離。
在說明本實施方案的核酸提取裝置100的機構組成之前，先說 明使用這種核酸提取裝置來提取核酸的步驟。
圖4A是提取柱的斜視圖，圖4B是沿該提取柱的IVB-IVB截取 的剖面圖；而圖5A到5G包括了示出提取操作的各個步驟的圖。
核酸提取裝置100使用圖4A所示的提取柱11來提取樣品溶液 中的核酸。提取柱ll的構成方式為使得核酸吸附性多孔膜llb被 保持在圓柱形主體lla (其頂端是開放的)的底部，圓柱形主體lla 在核酸吸附性多孔膜lib以下的部分被成形為漏鬥狀的形狀，細管口 形狀的出口 lie以預定的長度從底端的中心突出來，並且在圓柱形主 體lla的兩側形成縱向突出體lld。在從提取柱11的頂端開口 lie 分注樣品溶液之後、分注洗滌液之後以及分注回收液之後(這些溶液 將在下文中提到)，均從頂端開口 lle引入壓縮空氣，而各種溶液則 通過核酸吸附性多孔膜llb，向下流動，並由開口 llc排放到廢液容 器12或回收容器13 (各種容器將在下文中提到)中。順便提及，在 圖中所示的情況下，圓柱形主體lla具有這樣的結構圓柱形主體 lla被分為上部和下部，並通過將上部和下部接合而使之連接在一 起。如圖4B所示的沿IVB-IVB截取的剖面圖，頂端開口 lle具有斜 面llf，其中內表面被切削成錐形，並且斜面llf的形成方式為使 得其與加壓嘴41 (將在下文提到)的前端的傾斜的外表面基本吻合。
基本上來說，核酸提取裝置100通過圖5A到5G所示的提取步 驟來進行核酸的提取。首先，在圖5A步驟中，將含核酸(經溶解處 理)的樣品溶液S倒入位於廢液容器12之上的提取柱11中。然後，
在圖5B所示的步驟中，壓縮空氣被引入提取柱11中，以施加壓力 並通過核酸吸附性多孔膜lib,從而使得樣品溶液S通過核酸吸附性 多孔膜llb，而核酸被吸附在該多孔膜上，通過多孔膜的液體成分則 被排放到廢液容器12中。
接著，在圖5C所示的步驟中，洗滌液W被自動地分注到提取 柱11中，在圖5D所示的步驟中，壓縮空氣被引入到提取柱11中， 在核酸仍保留在核酸吸附性多孔膜llb上時，進行洗滌和除去其它雜 質的操作，而通過多孔膜的洗滌液W則被排放到廢液容器12中。圖 5C所示的步驟和圖5D所示的步驟可以重複幾次。
接著，在圖5E所示的步驟中，將提取柱11下部的廢液容器12 換為回收容器13，之後，在圖5F所示的步驟中，將回收液R自動地 分注到提取柱11中，在圖5G所示的步驟中，壓縮空氣被引入到提 取柱11中以便進行加壓，從而使得核酸吸附性多孔膜Ub與核酸之 間的結合力變弱，以釋放被吸附的核酸，而含核酸的回收液R則被 排放到回收容器13中以實現回收。
基本上來說，位於上述提取柱11中的核酸吸附性多孔膜lib是 多孔物質，液體能夠通過其中，並且該多孔物質的表面具有通過化學 鍵作用力的方式來吸附樣品溶液中的核酸的性質。所述的核酸吸附性 多孔膜被構造成這樣的方式在使用洗滌液進行洗滌時，核酸保持吸 附，而在使用回收液進行回收時，核酸的吸附力變弱從而使其被釋放。 詳細情況將在下文中提到。
如圖1到圖3所示，在核酸吸附性裝置100的主體2中，該裝 置設置有以下部分柱支架21，用於保持多個提取柱ll;容器保持 立架22，用於保持廢液容器12和回收容器13;壓縮空氣供給機構4， 通過該機構將壓縮空氣引入提取柱11中；分注機構5，通過該機構 將洗滌液W和回收液R分注提取柱11中；等等。柱支架21和容器 保持立架22構成了保持機構3。以下，將詳細說明機構3到機構5 中的各個機構。
保持機構
保持機構3包括柱支架21和容器保持立架22。容器保持立架 22中具有位於裝置主體2的前側下部的臺架6，用於保持廢液容器 12和回收容器13。隨著容器交換用電動機32(直流電動機)的驅動， 運作部件31 (參見圖3)發生移動，由此來進行臺架6中的容器的交 換移動(向前移動和向後移動)操作，所述運作部件31設置於容器 保持立架22的底部。這種向前和向後移動的結果是將回收容器13 定位於柱支架21的下方或將廢液容器12定位於柱支架21的下方。 根據定位傳感器33a和33b的檢測結果，來控制上述容器交換用電動 機32的運轉。
柱支架21是通過將前、後板件粘合而構成的分體式(two divided)結構，所以柱支架21設有在橫向方向上延伸的保持件21a 和21b。在保持件21a和21b上形成了多個保持孔21c，提取柱U從 上方插入，而在圓柱形主體lla的兩側形成的突出體lld(參見圖4A 和4B)的下端與柱支架21中的連接件(圖中未示出)連接，並由該 連接件保持。該連接件能夠被移動，並且在移動時，其與所述突出體 lld的連接被解除，使所有的提取柱11同時下落並被扔掉。
在臺架6位於圖1所示的下降的位置時，提取柱ll (由柱支架 21所保持)的出口 llc的底端定位於臺架6中所設置的廢液容器12 和回收容器13的上方。當隨著諸如脈衝電動機之類的升降用電動機 47 (參見圖3)的驅動而使容器保持立架22升起和下降、同時通過 光傳感器48a到48c的檢測結果來控制臺架6升起和下降的時候，在 臺架6升起時，提取柱11的出口 llc就會以預定的量插入廢液容器 12或回收容器13中。
臺架6的上表面上設有廢液容器保持孔和回收容器保持孔，這 兩種保持孔在橫向方向上延伸為平行的兩列，並且多個廢液容器12 中的每一個廢液容器和多個回收容器13中的每一個回收容器分別被 位於後側的廢液容器保持孔和位於前側的回收容器保持孔保持成列。 將廢液容器保持孔和回收容器保持孔排布成與柱支架21的保持孔 21c的位置相同並且間距(距離)相同的方式，並且進行這樣的設定， 使得廢液容器12和回收容器13分別位於相應的被保持的提取柱11
的下方。關於廢液容器12和回收容器13，優選使用具有不同尺寸和 形狀等的容器，以免混淆。
壓縮空氣供給機構
如圖1到3所示，壓縮空氣供給機構4設有以下部分作為可
移動件的移動頭40，其與上述保持機構3中的臺架6相反地升起和 下降；單個加壓嘴41，被固定在移動頭40上；氣泵43，可產生壓縮 空氣；安全閥44,該閥用於打開和關閉設定在加壓嘴41這一側的氣 體供應通路；壓力傳感器46，被設定在加壓嘴41這一側；以及加壓 嘴升降裝置，其可以使加壓嘴41升起和下降。關於加壓嘴升降裝置， 通過加壓嘴升/降用電動機81 (例如脈衝電動機)和與之相連的螺柱 -螺母式(bold-nut)機構來完成升起和下降的操作。如此構造的結果 是壓縮空氣被依次供入到提取柱11中。氣泵43、安全閥44和加 壓嘴41各自的操作都是根據控制部分70的控制命令來實施的。
上述移動頭40設有以下部分移動頭移動用電動機26 (參見圖 3)(例如脈衝電動機)，其作為移動裝置被定位於裝置主體2的中 間框架23與上框架24之間；位於驅動側的皮帶輪27，是由移動頭 移動用電動機26驅動而旋轉的；位於空轉側的皮帶輪28，其自由旋 轉並進行張力調節；以及同步皮帶29，其懸掛在驅動側的皮帶輪27 和空轉側的皮帶輪28之間。順便提及，移動頭移動用電動機26是根 據光傳感器25a到25c的檢測結果來控制而被驅動的，並且移動頭移 動用電動機26沿提取柱11的排布方向來移動移動頭40。
以可上、下移動的方式將加壓嘴41安裝在移動頭40中，並使 其可以更多地向下移動，此外，位於加壓嘴41的下部前端的外邊緣 被製成圓錐形。如此構造的結果是當加壓嘴41向下移動、並使加 壓嘴41的前端與提取柱11 (設置在柱支架21中)的頂端開口接觸 時，提取柱的被切削成錐形的斜面llf緊緊地貼附在加壓嘴41的前 端的圓錐形表面上，因此提取柱11的內部被緊緊地密封。在這種緊 密密封的狀態下，就可以將壓縮空氣供入提取柱11中，而不會洩露。
當要排放位於氣泵43和開關閥45之間的通路中的空氣時，將
安全閥44打開通向大氣，並進行排放。空氣環路這樣構建使得開
關閥45選擇性地開啟，並使壓縮空氣從氣泵43通過加壓嘴41而引
入到提取柱II中。如此構造的結果是形成了從氣泵43到提取柱
11的氣流供應通路。 分注機構
分注機構5設有以下部分洗滌液分注嘴51w和回收液分注嘴 51r，並且分注嘴51w和分注嘴51r—起被設置於上述的可移動的移 動頭40中，所述移動頭40能夠在柱支架21上沿橫向方向移動；洗 滌液供給泵52w (參見圖3)，其中洗滌液瓶56w所容納的洗滌液W 被提供並輸送到洗滌液分注嘴51w中；回收液供給泵52r(參見圖3)， 其中回收液瓶56r所容納的回收液R被提供並輸送到回收液分注嘴 51r中；廢液器皿57，被安裝在中間框架23上；等等。
通過移動頭移動用電動機26 (參見圖3)的驅動，使移動頭40 在各個提取柱U處停下，而在復位狀態下，使移動頭40停在廢液器 皿57上；以這樣的方式對驅動加以控制，以便使每個提取柱上方的 空間不受遮攔。當每個提取柱上方的空間不受遮攔時，工作性能會大 大提高。
洗滌液分注嘴51w和回收液分注嘴5Ir的前端向下彎曲，洗滌 液分注嘴51w通過閥55w與洗滌液供給泵52w連接，洗滌液供給泵 52w與洗滌液瓶56w連接，回收液分注嘴51r通過閥55r與回收液供 給泵52r連接，回收液供給泵52r與回收液瓶56r連接。洗滌液瓶56w 和回收液瓶56r分別被設置在裝置主體2的前面，由此使操作性能提 高。洗滌液供給泵52w和回收液供給泵52r都由管式泵構成，並且 它們各自的驅動都是受控的，從而可以由泵用電動機53w和53r (脈 衝電動機)根據傳感器54w和54r的位置檢測結果而分別注入預定 量的洗漆液W和回收液R。這些泵用電動機53w、 53r和閥55w、 55r 都是根據控制部分70的指令來工作的。
當要分注洗滌液W或回收液R時，開啟閥55w或55r，並開動 泵用電動機53w或53r，使得洗漆液供給泵52w的轉動部件或回收液
供給泵52r的轉動部件轉動並工作。如此構造的結果是通過洗滌液
供給泵52w或回收液供給泵52r吸入洗滌液W或回收液R，並經過 閥55w或55r從洗滌液分注嘴51w或回收液分注嘴51r排出洗滌液 W和回收液R。在進行這種排放操作時，將洗漆液分注嘴51w或回 收液分注嘴51r移動到提取柱11的上方。結果，將預定量的洗滌液 W或回收液R分注到提取柱11中。
洗滌液瓶56w和回收液瓶56r各自具有容器主體56wb或56rb 以及蓋56wu或56m;蓋56wu和56m中分別設有細管狀的吸管58w 和58r，所述吸管58w和58r的下端開口分別接近容器瓶主體56wb 和56rb的底部，從而隨著洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的 操作，分別抽吸洗滌液W或回收液R。
上述機構3到5分別是由其各自連接的控制部分70根據控制板 (圖中未示出)的輸入操作來控制的，該控制板設置於裝置主體2 的上部。換言之，驅動和控制是根據存儲部分72 (與控制部分70連 接)中預先存儲的程序來實施的。
以下將詳細說明使用上述核酸提取裝置100進行的提取操作。 首先，將提取柱11設置在位於保持機構3的臺架6中的柱支架21 中，將廢液容器12和回收容器13分別設置在臺架6中，並將臺架6 安裝在裝置主體2的容器保持立架22中，由此做好準備。然後，使 用移液管等將經過溶解處理的樣品溶液S依次注入到每一個提取柱 11中。在注入樣品溶液S的時候，將移動頭40放置於廢液器皿57 的正上方，從而使提取柱上方的空間不受遮攔。順便提及，還可以在 把提取柱11設置到尚未安裝到核酸提取裝置100上的臺架6中之前 或之後，將樣品溶液S預先注入到提取柱11中。
然後，通過對操作控制板進行操作使該裝置工作，其中，如圖 6A所示，移動頭40被轉移到提取柱11正上方的位置。將加壓嘴41 放置在該圖左端的提取柱Cl (示作實例)的正上方，並通過開動壓 縮空氣供給機構4的加壓嘴升/降用電動機81，使移動頭40的加壓 嘴41向下移動(圖6B)。結果，加壓嘴41的前端外表面緊緊地貼 附在提取柱11的斜面llf上。同時，升降用電動機47驅動容器保持
立架22向上移動，使提取柱11的底端出口 lie以預定的量插入到廢 液容器12中，從而防止了排出的溶液因滴濺等洩露到外部而造成的 汙染。
然後，進行壓縮空氣的供入操作。控制部分70發出指令，結果， 在開關閥45處於關閉狀態時驅動氣泵43，再將開關閥45打開。壓 縮空氣立即從氣泵43經加壓嘴41以預定的量供入到第一提取柱11 (Cl)中。
然後，在關閉開關閥45後，通過加壓嘴升/降用電動機81使加 壓嘴41升起，再開動移動頭移動用電動機26，使移動頭40移動與 柱11的排布間距相等的距離。而後，將預定量的壓縮空氣以相同的 方式供入到相鄰的第二提取柱11 (C2)(圖6C)中。
在施加壓力使樣品溶液S通過核酸吸附性多孔膜Ub後，樣品 溶液S中的核酸被吸附和保留在多孔膜lib上，同時，其它液體成 分由底部的出口 llc排放到廢液容器12中。當所有的樣品溶液S都 通過核酸吸附性多孔膜llb之後，壓力降低到液體排放結束時的壓力 以下，因此通過壓力傳感器46來檢測提取柱11己完成提取。所述步 驟重複進行的次數為提取柱11的個數。
接著進行洗滌處理。在上述的壓縮空氣供入操作之後，將移動 頭40升起，並返回到第一提取柱(Cl)的上方。然後將移動頭40 的洗滌液分注嘴51w停在第一提取柱(Cl)的上方，並注入預定量 的洗滌液W，再將移動頭40移動到下一個提取柱(C2)的上方，並 相繼注入洗漆液W。當將洗滌液W分注到所有的提取柱11中的操 作已完成後，將移動頭40返回到第一提取柱(Cl)的上方。
然後，如圖6A到6C所示，使移動頭40的加壓嘴41下降，並 且，在將加壓嘴41的底端部分壓附於提取柱11的頂端開口上以將其 封閉之後，按照上述相同的方式打開開關閥45，使壓縮空氣供入到 提取柱11中。受壓力作用的洗滌液W進行洗滌，並在通過核酸吸附 性多孔膜lib的同時除去除核酸以外的雜質；洗滌液W由底端開口 lie排放到廢液容器12中。當所有提取柱11中的所有洗滌液W都 已通過核酸吸附性多孔膜llb而排出時，將移動頭40返回到起始位
置。順便提及，當洗漆處理被重複進行兩次或多次時，上述操作均被 重複。
接著進行回收處理。首先，在洗滌處理之後，在移動頭40進行 上述的返回操作的同時，通過升降用電動機47使臺架6下降，從而 使提取柱ll底端的出口 llc與廢液容器12分離，在此之後，通過容 器交換用電動機32的驅動使得保持機構3的運作部件31移動，從而 使臺架向後移動。由此，通過把回收容器13定位於提取柱11之下， 而使容器發生交換。
在此之後，使用升降用電動機47將臺架6升高，並保持使提取 柱11的底端插入到回收容器13中的狀態。然後，如圖8A所示，移 動移動頭40，由此使回收液分注嘴51r停在第一提取柱(Cl)的上 方，以便注入預定量的回收液R，隨後將移動頭40移動到下一個提 取柱(C2)，並相繼進行回收液R的注入操作(圖8B)。當將回收 液R分注到所有的提取柱11中的操作已完成後，按照上述相同的方 式將壓縮空氣供入每一個提取柱11中，如圖6A到6C所示。
在按照上述相同的方式供入壓縮空氣後，在壓力的作用下，回 收液R通過核酸吸附性多孔膜llb、釋放出被多孔膜吸附的核酸，然 後核酸與回收液R—起由底端出口 Uc排放到回收容器13中。在所 有提取柱11中的所有回收液R都被排放到回收容器13中之後，將 移動頭40移動到廢液器皿57正上方的最初的空位處，至此完成--系 列操作。
開動升降用電動機47，使完成了提取操作的臺架6下降，將提 取柱11和廢液容器12各自從柱支架21和臺架6中取出並扔掉，而 從臺架6中取出回收容器13，如果需要可將其蓋上並進行隨後的核 酸分析處理。
在本實施方案中，示出了這樣的結構，其中多個提取柱ll被支 承在固定側，而壓縮空氣供給機構4的加壓嘴41則以可沿提取柱11 的排布方向自由移動的方式受到支承。然而，本發明並不限於這一種 實施方案，如圖9的核酸提取裝置的結構輪廓中所示的結構也是合乎 需要的，其中壓縮空氣供給機構4的加壓嘴41被支承在固定側，而
多個提取柱11、廢液容器12和回收容器13分別以可沿各自的排布 方向自由移動的方式受到支承。根據圖9所示的結構，可以按這樣一 種方式連續地進行大量核酸的處理，所述方式為..將各提取柱11、 廢液容器12和回收容器13連續提供給固定加壓嘴41、洗滌液分注 嘴51w和回收液分注嘴51r，並且回收完成核酸提取操作後得到的物 質。
由氣泵43供給提取柱11的空氣可以是任何其它氣體，只要它 不會影響樣品溶液、洗滌液和回收液的性質等即可。
與其中多個提取柱11被一起抽吸的結構相比而言，核酸提取裝 置100可以控制氣體的供入時間和氣體的供入量等，使這些條件針對 每個提取柱11都達到最佳。此外，即使在樣品溶液的液體量和粘度 等不均衡時，也很難受其影響，並且本發明的裝置可以加快核酸提取 處理的節奏，核酸的目標提取物可更為廣泛，並且裝置的適用性可以 得到增強。例如，在向多個提取柱同時供入氣體的結構中，即使向其 中部分提取柱供入壓縮空氣的操作已經完成，在向其它提取柱供入壓 縮空氣的操作沒有完成的情況下，也不可以結束壓縮空氣的供入。因 此，只有在多個提取柱11都結束同一操作後，才可以進入下一步操 作。然而，在根據本實施方案的核酸提取裝置100中，各個提取柱相 繼受到處理，因此不會受其它提取柱的任何影響，從而可以在最短的 時間內進行最佳的處理。
此外，因為僅向一個提取柱11供入氣體，所以與向多個提取柱 11同時供入氣體的情況相比，前者就可以降低氣泵43的供給量。因 此，甚至可以使用小尺寸的氣泵43，其安裝所需的空間小，並且可 實現緊湊的結構。
此外，將提取柱11以均勻的排布間距進行排布，並且分注嘴51r 和51w與加壓嘴41之間的排布距離分別為提取柱11的排布間距的 整數倍，以上事實的結果是可以同時對多個不同的提取柱11進行 分注處理和加壓處理，因此可以使處理時間縮短。順便提及，提取柱 11、廢液容器12和回收容器13除了排布成直線狀以外，還可以排布 成曲線狀(例如圓弧形)。當它們排布成(例如)圓弧形時，可以使
用其支承軸為該圓弧的圓心的臂狀物，將壓縮空氣供給並充入位於圓 弧上的各個位置處的提取柱中。
在本發明的核酸提取方法和核酸提取裝置中，洗滌液的分注及 允許停留的時間以及回收液的分注及允許停留的時間這二者中，至少 一者被控制為預定的時間。
圖io是示出本發明的核酸提取步驟的工藝流程圖。在核酸提取
步驟(將在下文中提到)中，將使用上述的核酸提取裝置100。
如圖IO所示，首先將含梭酸的樣品溶液S注入到提取柱11中
(步驟S101)。將壓縮空氣引入到其中容納有樣品溶液s的提取柱
11中(步驟S102)，並且將洗滌液W注入其中(步驟S103)。在 分注洗滌液W之後，使洗滌液照原樣停留然後再將壓縮空氣引入到 提取柱中，從而使洗滌液W停留預定的時間，其中，核酸被浸泡在 所述的洗滌液中(步驟S104)。在所述的預定時間結束後，洗滌液 W被排放到廢液容器12中(步驟S105)。
優選的是，將洗滌液W的允許停留時間控制為50秒到l,OOO秒， 更優選的是，控制為IOO秒到300秒。
在分注洗滌液W之後，在將壓縮空氣引入到提取柱中之前，使洗 滌液W (核酸被浸泡在所述的洗滌液中)停留預定的時間，由此可以 使回收處理後的核酸提取量增加。
在此之後，分注回收液R (步驟S106)。在分注回收液R之後， 在將壓縮空氣引入到提取柱11中之前，使回收液R停留預定的時間， 其中，核酸被浸泡在所述的回收液中(步驟S107)。在所述的預定 時間結束後，回收液R被排放到回收容器13中(步驟S108)。
優選的是，將回收液R的允許停留時間控制為20秒到300秒， 更優選的是，控制為25秒到60秒。
在分注回收液R之後，在將壓縮空氣引入到提取柱中之前，使回 收液R (核酸被浸泡在所述的回收液中)停留預定的時間，由此可以 使回收處理後的核酸提取量增加。
將洗滌液W的注入及允許停留的時間或回收液R的注入及允許停 留的時間控制為預定的時間，會得到這樣的效果可提取的核酸的量
增加。在洗滌液W的注入及允許停留的時間以及回收液R的注入及允 許停留的時間分別被控制為各自的預定時間的情況下，就可以進一步 增加可提取的核酸的量。
例如，在僅僅使洗滌液W停留預定時間的情況下，就省略使回收
液R停留的步驟(如圖10中步驟S107所示)。另一方面，在僅僅使 回收液R停留預定時間的情況下，就省略使洗滌液W停留的步驟(如 圖10中步驟S104所示)。
參照圖3來說明這樣一種機構，該機構用於將洗滌液的注入及允 許停留的時間以及回收液的注入及允許停留的時間分別控制為預定的 時間。
如圖3所示，控制部分70控制氣泵43、安全閥44和加壓嘴41， 使得在洗滌處理過程中分注洗滌液W之後，不向提取柱11供入壓縮 空氣。然後，使核酸在提取柱11內的洗滌液W中浸泡預定的時間， 通過控制部分70控制氣泵43、安全閥44和加壓嘴41，使壓縮空氣再 次輸入，由此使洗滌液W從提取柱11中排出。順便提及，在回收處 理過程中，在分注回收液R之後，控制部分70控制氣泵43、安全閥 44和加壓嘴41，使得壓縮空氣不被輸送到提取柱11中。核酸在提取 柱內的回收液R中浸泡預定的時間，通過控制部分70控制氣泵43、 安全閥44和加壓嘴41，使壓縮空氣再次輸入，由此使回收液R從提 取柱中排出。在這種實施方案中，控制部分70起到了用於控制允許停 留時間的裝置的作用。
在這種實施方案中，使用了一種機構，該機構通過控制部分70將 洗滌液W的分注及允許停留的時間以及回收液R的分注及允許停留的 時間分別控制為預定的時間，但對這種機構沒有限制。例如，可以安 裝進氣制動器，該制動器與氣泵43、安全閥44和加壓嘴41協作來終 止壓縮空氣的供入，從而在洗滌液W和回收液R被分注後，使它們分 別能在提取柱中停留預定的時間。
下面，將詳細說明上述提取柱11中所安裝的核酸吸附性多孔膜 (核酸吸附性多孔材料)llb。
上述提取柱11所容納的核酸吸附性多孔膜llb基本為核酸能夠通
過的多孔物質。其表面的特徵在於樣品溶液中的核酸可通過化學鍵 作用力的方式被吸附，並且其被構造成這樣的方式在使用洗滌液進 行洗滌時，仍保持吸附狀態，而在使用回收液進行回收時，核酸的吸 附力變弱而被釋放。
上述提取柱11所容納的核酸吸附性多孔膜lib優選為以基本不 涉及離子鍵的相互作用來吸附核酸的多孔膜。這意味著在使用多孔膜 的條件下，沒有發生"離子化"，並且可以推測由於周圍極性改變， 核酸和多孔膜相互吸引。因此，可以以優異的分離性能和優良的洗滌 效率來分離和純化核酸。優選的是，核酸吸附性多孔膜是具有親水性 基團的多孔膜，並且可以推測當周圍極性改變時，核酸的親水性基 團和多孔膜的親水性基團相互吸引。
本文中，術語"具有親水性基團的多孔膜"是指這樣的多孔膜， 其中構成多孔膜的材料其本身具有親水性基團，或者是這樣的多孔 膜，為了在多孔膜中引入親水性基團，通過對多孔膜構成材料進行處 理或塗敷而得到該多孔膜。多孔膜構成材料可以是有機或無機材料。 例如，可以使用這樣的多孔膜，其中多孔膜構成材料本身是具有親水 性基團的有機材料；可以使用這樣的多孔膜，為了將親水性基團引入 其中，通過處理由不含親水性基團的有機材料所製成的多孔膜而得到 該多孔膜；可以使用這樣的多孔膜，其中通過用具有親水性基團的材 料塗敷由不含親水性基團的有機材料所製成的多孔膜，由此引入親水 性基團而得到該多孔膜；可以使用這樣的多孔膜，其中多孔膜構成材 料本身是具有親水性基團的無機材料；可以使用這樣的多孔膜，其中 為了將親水性基團引入其中，通過處理由不含親水性基團的無機材料 所製成的多孔膜而得到該多孔膜；並且可以使用這樣的多孔膜，其中 通過用具有親水性基團的材料塗敷由不含親水性基團的無機材料所 製成的多孔膜，由此引入親水性基團而得到該多孔膜。為了處理方便， 優選使用有機材料(例如有機聚合物)作為構成多孔膜的材料。
親水性基團是指能與水發生相互作用的極性基團(原子)，包 括所有參與吸附核酸的基團(原子)。作為親水性基團，優選那些 與水錶現出約為中等水平的相互作用的親水性基團(參見由共立出
版株式會社出版的《化學大詞典》中所述的關於"親水性基團"中 的"親水性不太強的基團")，其實例包括羥基、羧基、氰基和羥 乙基，優選羥基。
關於能夠在本發明中使用的具有親水性基團的多孔膜，可以舉出 含有醯氨基的有機材料的多孔膜。聚醯胺可優選用作含有醯氨基的有 機材料。聚醯胺的實例為纖維蛋白、聚胺基酸、多肽、聚丙烯醯胺、
尼龍46、尼龍66、尼龍610、尼龍612、尼龍6、尼龍7、尼龍ll和 尼龍12，但是對此沒有限定。還可以使用改性尼龍，例如，N-甲基改 性尼龍、N-垸氧基甲基改性尼龍和N-烷硫基甲基改性尼龍。關於聚醯 胺多孔膜，可以為通過用(例如)美國專利No. 2,783,894、 3,408,315、 4,340,479、 4,340,480、 4,450,126和德國專利No. 3,138,525以及日本專 利申請公開No. 58/037,842中所述的材料及所述的方法製成的那些，但 是對此沒有限制。
關於能夠在本發明中使用的含有羥基的有機材料的多孔膜，其實
例包括由以下物質形成的多孔膜聚羥乙基丙烯酸、聚羥乙基甲基丙 烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和多糖 (例如聚氧化亞乙基和具有不同乙醯值的醋酸纖維素的混合物)，並 且特別優選使用具有多糖結構的有機材料的多孔膜。
關於用於多孔膜的有機材料，還可以使用乙烯基醯化物的聚合 物的皂化產物；以及兩種或多種單體的皂化共聚物，該皂化共聚物優 選含有至少為乙烯基醯化物的單體單元。所述的乙烯基醯化物的聚合 物的皂化產物的皂化率、以及所述的兩種或多種單體的皂化共聚物(該 皂化共聚物含有至少為乙烯基醯化物的單體單元)的皂化率均優選為 1%或更高。還優選的是，上述乙烯基醯化物的醯基選自乙醯基、丙醯 基、丁醯基、戊醯基、庚醯基、辛醯基、癸醯基、十二醯基、十三醯 基、十六醯基和十八醯基中的至少一種。
可優選使用纖維素、半纖維素、葡聚糖、澱粉酶、澱粉精、澱 粉、糖原、支鏈澱粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣澱粉、異地衣澱 粉、昆布糖、角叉菜膠、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明質酸、軟骨 素、甲殼素和殼聚糖作為具有多糖結構的有機材料。但是，對此沒有
限制，並可以使用任何具有多糖結構或其衍生物的有機材料。此外， 可優選使用任何上述多糖的酯衍生物。此外，可優選使用任何上述多 糖的酯衍生物的皂化產物。
優選使用選自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦 酸酯和焦磷酸酯中的一種或多種作為任何上述多糖的酯衍生物的酯。 此外，更優選使用羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸 酯和焦磷酸酯的各自的皂化產物。
優選使用選自垸基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳垸 基羰基酯中的一種或多種作為任何上述多糖的羧酸酯。此外，更優 選使用任何上述多糖的烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和 芳烷基羰基酯的各自的皂化產物。
優選使用選自乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、庚醯基、辛 醯基、癸醯基、十二烷醯基、十三烷醯基、十六烷醯基和十八垸醯基 中的一種或多種作為任何上述多糖的垸基羰基酯的酯基。此外，更優 選使用具有一個或多個選自乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、庚醯 基、辛醯基、癸醯基、十二烷醯基、十三烷醯基、十六垸醯基和十八 烷醯基中的酯基的任何上述多糖的皂化產物。
優選使用一種或多種丙烯醯基和甲基丙烯醯基作為任何上述多 糖的烯基羰基酯的酯基。此外，更優選使用具有一個或多個選自丙烯 醯基和甲基丙烯醯基中的酯基的任何上述多糖的皂化產物。
優選使用一種或多種苯醯基和萘醯基(n叩hthaloyl)作為任何上 述多糖的芳香基羰基酯的酯基。此外，更優選使用具有一個或多個含 苯醯基和萘醯基的酯基的任何上述多糖的皂化產物。
優選使用硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、硝酸瓊脂 糖、硝酸糊精、硝酸澱粉酶、硝酸澱粉精、硝酸糖原、硝酸支鏈澱粉、 硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣澱粉、硝酸異地衣澱粉、 硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、 硝酸透明質酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖作為任何上述 多糖的硝酸酯。
此外，更優選使用硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、
硝酸瓊脂糖、硝酸糊精、硝酸澱粉酶、硝酸澱粉精、硝酸糖原、硝酸 支鏈澱粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣澱粉、硝酸異 地衣澱粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、 硝酸褐藻酸、硝酸透明質酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖 的各自的皂化產物。
優選使用硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、硫酸瓊脂 糖、硫酸糊精、硫酸澱粉酶、硫酸澱粉精、硫酸糖原、硫酸支鏈澱粉、 硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣澱粉、硫酸異地衣澱粉、 硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、 硫酸透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖作為任何上述 多糖的硫酸酯。
此外，更優選使用硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、 硫酸瓊脂糖、硫酸糊精、硫酸澱粉酶、硫酸澱粉精、硫酸糖原、硫酸 支鏈澱粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣澱粉、硫酸異 地衣澱粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、 硫酸褐藻酸、硫酸透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖 的各自的皂化產物。
優選選自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳垸基磺 酸酯中的一種或多種作為任何上述多糖的磺酸酯。此外，更優選使用 任何上述多糖的烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺 酸酯的各自的皂化產物。
優選使用磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、磷酸瓊脂 糖、磷酸糊精、磷酸澱粉酶、磷酸澱粉精、磷酸糖原、磷酸支鏈澱粉、 磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣澱粉、磷酸異地衣澱粉、 磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、 磷酸透明質酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖作為任何上述 多糖的磷酸酯。
此外，更優選使用磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、 磷酸瓊脂糖、磷酸糊精、磷酸澱粉酶、磷酸澱粉精、磷酸糖原、磷酸 支鏈澱粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣澱粉、磷酸異
地衣澱粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、 磷酸褐藻酸、磷酸透明質酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖 的各自的皂化產物。
優選使用膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、膦酸瓊脂 糖、膦酸糊精、膦酸澱粉酶、膦酸澱粉精、膦酸糖原、膦酸支鏈澱粉、 膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣澱粉、膦酸異地衣澱粉、 膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、 膦酸透明質酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖作為任何上述 多糖的膦酸酯。
此外，更優選使用膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、 膦酸瓊脂糖、膦酸糊精、膦酸澱粉酶、膦酸澱粉精、膦酸糖原、膦酸 支鏈澱粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣澱粉、膦酸異 地衣澱粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、 膦酸褐藻酸、膦酸透明質酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖 的各自的皂化產物。
優選使用焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡聚糖、焦 磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸澱粉酶、焦磷酸澱粉精、焦磷酸糖 原、焦磷酸支鏈澱粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸 地衣澱粉、焦磷酸異地衣澱粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜膠、焦 磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質酸、焦磷 酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖作為任何上述多糖的焦磷酸 酯。
此外，更優選使用焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡 聚糖、焦磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸澱粉酶、焦磷酸澱粉精、 焦磷酸糖原、焦磷酸支鏈澱粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、 焦磷酸地衣澱粉、焦磷酸異地衣澱粉、焦磷酸昆布糖、焦磯酸角叉菜 膠、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質酸、 焦磷酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖的各自的皂化產物。
可以使用甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧乙基纖 維素、羧乙基-氨基甲醯乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、
羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、氰乙基纖 維素和氨基甲醯乙基纖維素作為任何上述多糖的醚類衍生物，但是 其醚類衍生物並不限定於此。優選使用羥甲基纖維素或羥乙基纖維 素。
還可以優選使用其中的羥基被以任意程度卣化取代的任何上 述多糖。
以下將說明上文中所述的纖維素酯衍生物。纖維素(為上述纖 維素酯衍生物的原料)的實例為天然纖維素(例如棉籽絨和木漿(闊 葉樹木漿和針葉樹木漿)、大麻、以及乙酸菌培養過程中產生的纖維 素)；以及上述纖維素經酸水解、機械破碎、爆破處理或高溫擠出處 理來調節聚合度而得到的那些纖維素。可以使用由任何原料纖維素制 成的任何纖維素酯衍生物，並且在某些情況下，可將這些纖維素酯衍 生物混合後使用。這種纖維素原料的詳細描述可以在(例如)文獻
"Plastic Materials(17)， Cellulose-Type Resins" (Marusawa禾口 Uda著， 由Nikkan Kogyo Shimbunsha株式會社在1970年出版)中找到。
如上所述，纖維素的分子量範圍很寬。例如，天然纖維素的分 子量為600,000到1,500,000 (聚合度:約3,500到10,000)，純棉絨 的分子量為80,000至ij 500,000 (聚合度約500到3,000)，木漿的 分子量為80,000至lj 1 ，340,000 (聚合度約500至U 2,100)。在本發 明中，分子量在很大程度上影響著纖維素或其衍生物的機械強度，並 且當分子量變小時，機械強度會從一個特定的聚合度開始突然下降， 但是這樣的纖維素仍可用作本發明的核酸吸附性多孔膜的材料，而不 會產生任何問題。
作為上述核酸吸附性多孔膜的實例，可以使用通過纖維素的酯 化反應而製成的纖維素酯衍生物的多孔膜。然而，上述特別優選的纖 維素不能以原樣使用，而是以棉絨或木槳通過純化作用而製成的純棉 絨或純的高級木漿的形式來使用。棉絨是棉籽的棉纖維中纖維長度較 短的短纖維，其含有高含量(例如88重量％到92重量％)的oc-纖維 素，並且其純度很高，幾乎不含雜質。天然棉絨經過除塵、鹼蒸煮、 漂白、酸處理、脫水和乾燥處理後可製成純棉絨。詳細情況在文獻"Plastic Materials(17), Cellulose-Type Resins"(第25頁到第28頁) (Marusawa禾口 Uda著，由Nikkan Kogyo Shimb畫ha株式會社在1970 年出版)中有所描述，其中的表2到表3提到了純棉絨的性質。更優 選的純棉絨是由本發明製成的。
在上述同一本書的第28頁到第32頁，還提到了純木漿，其中 的表2到表4還提到了純木漿的性質，並且由所述方法純化的木漿還 可以優選地作為纖維素酯衍生物的原料。在本發明中，將經純化的棉 花絨與木漿混合使用也是優選的，雖然對它們的混合比沒有特別限 定，但是優選為5/95到95/5，更優選為10/卯到90/10。混合的結果 是溶解性增強，由此可改善纖維素酯衍生物多孔膜的表面性質和動 力特性。
其中，可以對作為槳粕純度指標的a-纖維素的含量加以選擇， 例如，a-纖維素的含量為80重量％到100重量％，在漿粕為木漿的 情況下，a-纖維素的含量通常為約85%到98%。在本發明中，還可 以使用(例如)其中a-纖維素的含量為80%到96% (特別是92%到 96%)這樣的低純度漿粕。在這樣的漿粕中，通常使用木漿。
此外，在本發明的核酸吸附性多孔膜中，雖然葡萄糖是漿粕或 棉花中的中性的構成糖(constituting saccharide)成分中的主要成分， 但是還可含有甘露糖和木糖。雖然對甘露糖/木糖的比例沒有特別限 定，但是甘露糖/木糖的摩爾比為0.35/1到3.0/1，優選為0.35/1到 2.5/1，更優選為0.35/1到2/1。在生產三醋酸纖維素時，甘露糖和木 糖的總量為0.01摩爾％到5摩爾％，優選為0.1摩爾％到4摩爾％。 順便提及，"甘露糖"和"木糖"是漿粕中所含的半纖維素(木聚糖、 葡甘露聚糖等)的主要構成糖。原料漿粕的構成糖成分和所得的纖維 素酯衍生物(三醋酸纖維素)可以通過日本專利申請公開No. 1 1/130,301中所述的方法來進行具體分析。
關於纖維素多孔膜，可優選使用再生纖維素的多孔膜。再生纖 維素的實例為將醋酸纖維素固體的表面或其全部通過皂化處理而形 成纖維素的產物；由纖維素的銅氨溶液製成的產物；由纖維素的粘膠 溶液製成的產物；以及由纖維素的鹼溶液製成的產物。這些纖維素在
晶態等方面與天然纖維素不同。纖維素中存在著晶型i、 ii、 ni和iv, 本發明中可優選使用任何晶型，或者所包含的晶型i、 ii、 iii和iv
可分別為任意比例。關於由醋酸纖維素多孔膜製成的再生纖維素多孔
膜，可以使用由日本專利公報No. 45/4,633、日本專利申請公開No. 56/100,604等中所述的材料和方法而製成的那些，但是對此沒有限 定。關於由纖維素的銅氨溶液製成的再生纖維素多孔膜，可以使用由 (例如)日本專利申請公開No. 58/089,625、 58/089,626、 58/089,627、 58/089,628 、 59/045,333 、 59/045,334 、 59/199,728 、 61/274,707 、 62/001,403、 63/161,927禾H 07/330,945中所述的材料和方法而製成的 那些，但對此沒有限定。還可以以相同的方式由粘膠溶液製成再生纖 維素多孔膜，所述的粘膠溶液由纖維素與鹼和二硫化碳發生反應而生 成(其中，改變了原料成分和凝聚方法)，其產物可用在本發明中。 關於由纖維素的鹼溶液製成的再生纖維素多孔膜，也可以使用由(例 如)日本專利申請公開No. 62/240,328、 62/240,329和01/188,539中 所述的材料和方法製成的再生纖維素多孔膜，但是對此沒有限定。
在本發明的核酸吸附性多孔膜中，上述纖維素酯衍生物的粘均 聚合度優選為200到3，000。上述纖維素酯衍生物的重均分子量與上 述纖維素酯衍生物的數均分子量之比優選為0.8到2。上述纖維素酯 衍生物含有酸解離指數為1.93到4.5的酸或其鹽是優選的。
在上述的纖維素酯衍生物中，乙酸的殘留量或Cm脂肪酸優選 為0.5重量％或更少。所述的纖維素酯衍生物優選含有lppb到 lO,OOOppm的鹼金屬和/或鹼土金屬中的至少一種。所述的纖維素醯 化物優選含有lppb到l,OOOppm的下列物質中的至少一種，所述物質 為鋁、鉍、矽和重金屬(例如鉻、鎂、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、 銀、鎘、錫、銻、金、鉑、汞和鉛)。
關於特別優選的纖維素酯衍生物的多孔膜，可舉出含有多種乙 醯值不同的醋酸纖維素的有機大分子物質的多孔膜。關於具有不同乙 醯值的醋酸纖維素的混合物，可優選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維 素的混合物、三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物、三醋酸纖維素 和二醋酸纖維素的混合物以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合
物。特別優選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。優選的是， 由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素構成的混合物中二者的混合比(重量 比)為99:1到1:99，更優選為卯10到50:50。
關於上述纖維素酯衍生物，還優選使用在日本專利申請公開No. 10/045,803 、 11/269,304 、 08/231,761 、 08/231,761 、 10/060,170 、 09/040,792 、 11/005,851 、 11/269,304 、 09/090,101 、 57/182,737 、 04/277,530、 11/292,989、 12/131,524、 12/137，115等中所提到的纖維 素酯衍生物。對與本發明中的核酸吸附性多孔膜相關的這些材料沒有 特別限定。
關於評價纖維素結構的方法，還可以使用X射線分析法。根據 該方法，有這樣描述纖維素分子排布在與纖維軸向平行的方向上， 其通過氫鍵相互吸弓l，並形成了由5個纖維素分子的纖維二糖單元構 成的晶胞。根據X射線方法，天然纖維素的結晶度為約70%，並且 這樣的纖維素可用於製備本發明中的纖維素酯衍生物。
關於其它可以在本發明中使用的纖維素，人們已經對其進行了 各種分析，並且ASTM Standard Part 15、 TAPPI Standard (Technical Association of the Pulp and Paper Industry) 、 JIS P 8101等中詳細提 到了這些分析方法。待測項目的實例為灰分、氧化鈣和氧化鎂的含量、 oc-纖維素值、P-纖維素值和銅值。
在本文中，皂化處理是指使醋酸纖維素與皂化處理液(例如氫 氧化鈉溶液)接觸。結果，與皂化處理液接觸的醋酸纖維素酯衍生物 的酯基被水解，並且引入羥基，從而形成再生纖維素。由此製備的再 生纖維素與初始纖維素在晶型方面是不同的。為了改變表面皂化率， 通過改變氫氧化鈉的濃度或氫氧化鈉的處理時間來實施皂化處理。通 過NMR、 IR或XPS (例如檢測羰基峰減弱的程度)來確定表面皂化 率。
具有多糖結構的有機材料多孔膜的實例為日本專利申請公開 No. 2003/128,691中所述的醋酸纖維素的表面皂化產物。醋酸纖維素 的表面皂化產物是這樣的產物其中，對具有不同乙醯值的醋酸纖維 素的混合物進行皂化處理，並且優選使用的是三醋酸纖維素和二醋酸
纖維素的混合物的皂化產物、三醋酸纖維素和二醋酸纖維素和單醋酸 纖維素的混合物的皂化產物、以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混
合物的皂化產物。優選的是，由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素構成的 混合物中二者的混合比(重量比)為99:1到1:99。更優選的是，由 三醋酸纖維素和二醋酸纖維素構成的混合物中二者的混合比為 90:10到50:50。在這種情況下，可以通過氧化處理的程度(皂化率) 來控制固相表面上的羥基的量(密度)。為了提高核酸的分離效率， 則羥基的量(密度)越高越好。例如，在醋酸纖維素(例如三醋酸纖 維素)的情況下，皂化率(表面皂化率)優選為約5%或更高，更優 選為10%或更高。為了使具有羥基的有機大分子物質的表面積更大， 優選的是，對醋酸纖維素多孔膜進行皂化處理。在這種情況下，當使 用其表面和背面對稱的多孔膜時，優點是在所述膜的表面和背面上
皂化產物可能沒有差別；而當使用其表面和背面不對稱的多孔膜時， 優點是可以減少多孔膜被堵塞的不利情況；由此優選使用不對稱的 多孔膜。
向含有有機材料(不含羥基)的多孔膜引入羥基的方法是把
在聚合物主鏈或側鏈上具有羥基的接枝聚合物鏈連接到多孔膜上。 用於使接枝聚合物鏈與有機材料多孔膜連接的方法有(例如)
以下兩種使多孔膜和接枝聚合物鏈化學連接的方法；以及用多孔膜 作為起始物使具有雙鍵(能發生聚合反應)的化合物進行聚合，從而 形成接枝聚合物鏈的方法。
首先，在使多孔膜和接枝聚合物鏈化學連接的方法中，使用在 聚合物的末端或側鏈上具有能夠與多孔膜發生反應的官能團這樣的 聚合物，所述聚合物通過該官能團與多孔膜的官能團之間的化學反應 而被接枝。對能與多孔膜發生反應的官能團沒有特別限定，只要其能 與多孔膜的官能團反應即可，並且其實例包括矽烷偶聯基(例如烷氧 基矽烷)、異氰酸基、氨基、羥基、羧基、磺酸基、磷酸基、環氧基、 烯丙基、甲基丙烯醯基和丙烯醯基等。
特別有用的在聚合物末端或側鏈上具有反應性官能團的化合物 的實例包括在其末端具有三烷氧基甲矽烷基的聚合物、在其末端具
有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有環氧基 的聚合物以及在其末端具有異氰酸基的聚合物。對在此使用的聚合物 沒有特別限定，只要其具有參與吸附核酸的親水性基團即可，其示例 性實例包括聚羥乙基丙烯酸、聚羥乙基甲基丙烯酸和它們的鹽、聚乙 烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧化亞 乙基以及類似物。
通過使用多孔膜作為起始點、使具有可聚合雙鍵的化合物進行 聚合而形成接枝聚合物鏈的方法通常被稱為表面接枝聚合法。表面接 枝聚合法是指這樣一種方法其中通過等離子體輻射、光輻射、加熱 或類似的方法，在基材表面上形成活性部位，並且使得與多孔膜接觸 設置的、具有雙鍵的可聚合化合物通過聚合反應而連接到所述的多孔 膜上。
用於形成與基材相連的接枝聚合物鏈的化合物必須具有可聚合 的雙鍵和參與核酸吸附的親水性基團這兩種特徵。作為這種化合物， 具有親水性基團的聚合物、具有親水性基團的低聚物和具有親水性基 團的單體中的任何 一 種都可以使用，只要在其分子內具有雙鍵即可。 特別有用的化合物是具有親水性基團的單體。
作為特別有用的具有親水性基團的單體的示例性實例，可以舉 出以下單體。例如，丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯、單甲基 丙烯酸甘油酯以及類似的含羥基的單體是特別適用的。此外，丙烯酸、 甲基丙烯酸以及類似的含羧基的單體、或者它們的鹼金屬鹽和胺鹽也 是適用的。
作為另一種用於把親水性基團引入到不具有親水性基團的有機 材料多孔膜中的方法，可以用具有親水性基團的材料進行塗敷。對用 於塗敷的材料沒有特別限定，只要其具有參與核酸吸附的親水性基團 即可，但是為了使操作簡單，優選為有機材料聚合物。這類聚合物的 實例包括聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧化亞乙基、 醋酸纖維素以及具有不同乙醯值的醋酸纖維素的混合物等，但是具有 多糖結構的聚合物是合乎需要的。 可供選用的另一種方式是可將醋酸纖維素或具有不同乙醯值 的醋酸纖維素的混合物塗敷到不具有親水性基團的有機材料多孔膜 上，然後對經塗敷的醋酸纖維素或具有不同乙醯值的醋酸纖維素的混 合物進行皂化處理。在這種情況下，皂化率優選為約5%或更髙。皂 化率更優選為10%或更高。
作為具有親水性基團的無機材料的多孔膜，可舉例為含有二氧
化矽化合物的多孔膜。作為含有二氧化矽化合物的多孔膜，可舉例為 玻璃濾膜。還可舉出的是日本專利No. 3,058,3442所述的二氧化矽多 孔薄膜。這種二氧化矽多孔薄膜可按以下方法製備把能夠形成雙分 子層的陽離子兩性物質的展開液鋪在基材上，通過除去液體膜中的溶 劑，而在基材上製成兩性物質的多層雙分子層薄膜，使多層雙分子層 薄膜與含有二氧化矽化合物的溶液接觸，然後取出並移走所述的多層 雙分子層薄膜。
關於向不具有親水性基團的無機材料多孔膜中引入親水性基團
的方法，存在著如下方法 一種方法是使多孔膜和接枝聚合物鏈化學
連接；以及另一種方法是使用多孔膜作為起始點，使用分子內具有雙 鍵的並含有親水性基團的單體進行聚合而形成接枝聚合物鏈。
在通過化學鍵合作用使多孔膜和接枝聚合物鏈連接起來時，可 向無機材料中引入能夠與接枝聚合物鏈的末端官能團發生反應的官 能團，並且使接枝聚合物鏈被化學連接到該官能團上。此外，當接枝 聚合物鏈是使用多孔膜作為起始點、並且使用分子內具有雙鍵的並含 有親水性基團的單體而聚合形成的時候，在含有雙鍵的化合物進行聚 合時作為起始點的官能團被引入到無機材料中。
作為具有親水性基團的接枝聚合物以及分子內具有雙鍵並含有親 水性基團的單體，適合使用的是在上述關於向不具有親水性基團的有 機材料多孔膜中引入親水性基團的方法中所述的具有親水性基團的接 枝聚合物以及分子內具有雙鍵並含有親水性基團的單體。
向不含親水性基團的無機材料的多孔膜中引入親水性基團的另 一種方法是在其上塗敷具有親水性基團的材料。塗敷所用的材料不受
限制，只要其具有參與核酸吸附的羥基即可；但為了易於操作，優選
為有機材料的聚合物。該聚合物的實例包括聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基 丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚 甲基丙烯酸酯及其鹽、聚氧化亞乙基、醋酸纖維素以及乙醯值各不相 同的醋酸纖維素的混合物。
不含親水性基團的無機材料的多孔膜的實例包括由鋁和類似 的金屬、玻璃、水泥、陶和類似的陶瓷製成的多孔膜，或者由新型陶 瓷、矽和活性炭等經逐步加工(stepping)而製成的多孔膜。
對於不含親水性基團的無機材料的多孔膜，將醋酸纖維素或乙醯 值互不相同的醋酸纖維素的混合物塗敷於其上，並且可以將經塗敷的 醋酸纖維素和乙醯值互不相同的醋酸纖維素的混合物皂化。在這種情
況下，表面皂化率優選為5%或更高。表面皂化率更優選為10%或更 咼°
在上述製備核酸吸附性固體載體的步驟中，根據用途的不同， 可以加入各種添加劑(例如，增塑劑、抗靜電劑、防劣化劑、防紫外 線劑、表面活性劑、剝離劑、著色劑、增強劑和交聯劑)。關於添加 劑的加入時間，雖然添加劑可以在漿液製備步驟中的任何時間加入， 但是還可以在漿液製備步驟中的最後製備步驟中增加用於向製劑中 加入添加劑的歩驟。
如果需要，上述核酸吸附性固體載體可以含有增塑劑，並且可 優選使用以下增塑劑例如，日本專利申請公開No. 2002/265,636所 述的磷酸酯和羧酸酯；日本專利申請公開02/006,826所述的多元醇； 日本專利申請公開No. 05/194,788 、 60/250,053 、 04/227,941 、 06/016,869 、 05/271,471、 07/286,068 、 05/005,047 、 11/080,381、 07/020,317、 08/057,879、 10/152,568、 10/120,824禾Q 11/124,445所述 的(二)季戊四醇酯；日本專利申請公開No. 11/246,704所述的甘油酉旨； 日本專利申請公開No. 2000/063,560所述的雙甘油酯；日本專利申請 公幵No. 11/092,574所述的檸檬酸酯；日本專利申請公開No. 11/0卯，946所述的被取代的苯基磷酸酯；和日本專利申請公開No. 56/100,604所述的增塑劑。在這些專利文獻的描述中，不僅存在著很 多針對增塑劑的優選的說明，還存在著很多針對其使用方法或其特性
的優選的說明，並且這些說明也可優選地適用於本發明中的核酸吸附 性固體載體中。
為了防止多孔膜在處理過程中帶電，可以向上述核酸吸附性固 體載體中加入抗靜電劑。關於抗靜電劑，可優選使用離子導電物質和 導電性細顆粒。本文中，離子導電物質是指這樣一種物質，該物質表 現出導電性，並且含有用作攜帶電荷的載體的離子；其實例為離子型 大分子化合物。離子導電物質的實例為日本專利公報No.49/23，826、 49/23,827和47/28,937中所述的陰離子大分子物質；日本專利公報 No. 55/734、日本專利申請公開No. 50/054,672以及日本專利公報No. 59/14,735、 57/18,175、 57/18,176禾口 57/56,059中所述的在其主鏈中具 有解離基團的紫羅烯型聚合物；以及日本專利公報No. 53/13,223、 57/15,376、 53/45,231、 55/145,783、 55/65,950、 55/67,746、 57/1 1,342、 57/19,735和58/56,858、日本專利申請公開No. 61/027,853以及日本 專利公報No. 62/9,346中所述的在其側鏈中具有陽離子解離基團的 陽離子側基型聚合物。在這些物質中，優選的是這樣一種物質其中 導電物質是細顆粒，並且被充分分散並加入到上述的核酸吸附性固體 載體中；關於優選使用的導電物質，優選為包括以下物質含有金屬 氧化物或其複合氧化物的導電細顆粒、日本專利申請公開No. 09/203,810所述的紫羅烯類導電聚合物或具有分子間交聯結構的季 銨類陽離子導電聚合物顆粒。優選的粒徑為5nm到l(^m，而更優選 的粒徑則取決於所用的細顆粒的類型。關於構成導電細顆粒的金屬氧 化物的實例，優選為ZnO、 Ti02、 Sn02、 A1203、 ln203、 Si02、 MgO、 Mo02、 V205等及其複合氧化物，並且特別優選的是ZnO、 Ti02和 Sn02。關於其中含有雜原子的實例，有效的是向ZnO中加入Al 和In等，向Ti02中加入Nb禾口 Ta等，或向Sn02中加入Sb、 Nb和 滷素等。這種雜原子的加入量優選為0.01摩爾％到25摩爾％，並且 特別優選為0.1摩爾％到15摩爾％。優選的是，核酸吸附性固體載體 含有0.01體積％到20體積％的這種具有特定結構的金屬氧化物導電 粉末，其中，所述導電粉末的體積粘度不高於107Qcm，或者，特別 是不高於105Dcm，其原生粒徑為100A到0.2wm，並且其高次結構
的長軸直徑為30nm到6pm。作為可分散的顆粒聚合物交聯型陽離子 導電聚合物的特徵在於因為顆粒中的陽離子部分能夠保持高濃度和 高密度，所以該交聯型陽離子導電聚合物具有優異的導電性，此外， 即使在相對溼度較低的情況下，也不會表現出導電性下降，並且，雖 然所述顆粒被充分分散成分散狀態，但是在成膜情況下，在流動之後 的成膜過程中，顆粒間的粘附力仍然很強，從而使膜具有髙強度和優 異的耐化學性。交聯型陽離子導電聚合物類的可分散的顆粒聚合物， 其粒徑通常為約10nm到1,000nm,並且優選使用的粒徑為20nm到 300nm。本發明使用的可分散的顆粒聚合物通過裸眼觀察，其外觀為 透明或稍微渾濁的溶液，但是在電子顯微鏡下則表現為顆粒分散體。 還可以利用有機電子導電類的有機化合物。其實例為聚噻吩、聚吡咯、 聚苯胺、聚乙炔和聚磷嗪。它們與聚苯乙烯磺酸和高氯酸等形成複合 物而被優選用作酸供體。
可以向上述核酸吸附性固體載體中加入防劣化劑(例如，抗氧化 劑、過氧化物降解劑、自由基抑制劑、金屬失活劑、除酸劑和胺)和 防紫外線劑。關於這種防劣化劑和防紫外線劑，可優選使用在日本專 利申請公開No. 60/235,852、 03/199,201 、 05/190,707、 05/194,789、 05/271,471 、06/107,854、06/118，233、06/148,430、07/011，056、 07/01 1,055 、 07/011,056 、 08/029,619 、 08/239,509 、 07/011,056 、 2000/204,173 、 05/197,073、 05/194,789、 06/107,854、 60/235,852、 12/193,821 、08/029,619、 06/118,233、 06/148,430、 2002/265,636、 05/197,073等。特別優選的防 劣化劑的實例為二丁基羥基甲苯(BHT)。
防劣化劑的加入量優選為所要製備的溶液(漿液)重量的0.01% 到1%，更優選為0.01%到0.08%。當防劣化劑的加入量少於0.01重量 %時，則其效果不明顯。當防劣化劑的加入量髙於1重量％時，可能會 發生這樣一些情況防劣化劑明顯擴散(滲出)到固體載體的表面上。 本發明優選的防劣化劑為在25'C時為液體並且沸點為20(TC的防劣 化劑，或者是熔點為25'C到25(TC的固體防劣化劑。更優選的防劣化 劑為在25'C時為液體並且沸點為25(TC或更高的防劣化劑，或者是 熔點為25t:到20(TC的固體防劣化劑。當防劣化劑為液體時，其通常通過真空蒸餾來進行純化，並且真空度越高，純化效果越好。例如，
真空度優選為100Pa或更低。此外，特別優選的是，使用真空蒸餾裝 置進行純化。當增塑劑為固體時，通常通過重結晶(使用溶劑溶解、 過濾、洗滌和乾燥)來進行純化。
還可以向上述核酸吸附性固體載體中加入表面活性劑。關於表面 活性劑，可優選使用日本專利申請公開No. 2002/265,636、日本專利公 報No. 55/031,418、以及文獻"Tables of Surfactants, etc." (2001年)
(Japan Surfactant Industry Association出版)、以及文獻"Applications of Surfactants" (Takao Kariyone著，1980年9月1日由Saiwai Shobo 出版)等中所述的那些，但是對此沒有限定。對本發明中優選的表面 活性劑的類型和用量沒有特別限定，可以使用任何量，只要能得到目 標表面活性劑即可。
如果需要，核酸吸附性固體載體可以含有剝離劑，從而使得生產 時剝離力變小。關於這種剝離劑，表面活性劑就合乎需要，並且可以 使用磷酸酯類、磺酸酯類、羧酸酯類、非離子型、陽離子型等，但是 沒有特別限定。這些剝離劑在(例如)日本專利申請公開No. 61/243,837 和2000/099,847中被提及。酸解離係數pKa為1.93到4.50 [優選為2.0 到4.4，更優選為2.2到4.3 (例如，2.5到4.0)，特別優選為2.6到4.3
(例如，2.6到4.0)]的酸或其鹽是優選的剝離劑。所述的酸可以是任 何無機酸和有機酸。酸的pKa可以參見"《。g幽腸簡(Handbook of Chemistry) ， Fundamental Part II"(第三次修訂版，由日本化學學會 編著，由丸善株式會社出版)。也可以優選使用日本專利申請公開No. 2002/265,636中所述的剝離劑。在這些文獻的描述中，不僅存在著很 多針對剝離劑的優選的說明，還存在著很多針對其使用方法或其特性 的優選的說明，並且這些說明也可優選地適用於本發明中的核酸吸附 性固體載體中。
可以向上述核酸吸附性固體載體中加入著色劑。關於著色劑， 可以將已知的有機、無機以及有機-無機複合著色劑以所需的濃度單 獨或聯合使用，或者以所需的濃度與分散劑(例如表面活性劑或保護 性聚合物)一起使用，但對此沒有限定，已知的著色劑可為例如色
料、染料、顏料、氧化著色顏料、還原著色顏料、pH指示劑、螢光 顏料、偶合顏料、紫外線吸收顏料、紅外線吸收顏料、近紅外線吸收 顏料、壓敏顏料、光變色顏料、熱變色顏料、電變色顏料、有機著色 顏料、食品顏料、有機非線性光學顏料、化學發光顏料、藥物顏料、 醫療診斷用顏料、化妝品顏料、半導體雷射用顏料、升華轉印顏料、 熔融轉印顏料、熱敏顏料、隱色顏料、電磁吸附性顏料、光導電性顏 料和可帶電的顏料。
為了增強膜的強度，可向上述核酸吸附性固體載體中加入增強 劑。關於增強劑，可優選使用的實例為玻璃纖維、碳纖維、矽纖維、 纖維素纖維、漿粕纖維、鈦酸鉀纖維、碳化矽晶須、氮化矽晶須、氧
化鋅晶須、硼酸鋁晶須、鹼性硫酸鎂、纖維狀的硬矽鈣石、鈦酸鈣晶 須、碳化矽(SiC)晶須和晶須狀的碳酸鈣，但對此沒有限定，只要 其是纖維狀的或者是針狀的晶體，則任何增強劑都可以使用。還可以 加入用於增強抗彎曲性能的合成聚合物，儘管可優選使用日本專利申 請公開No. 54/01 1,081中所述的聚氨酯，但對其沒有限定。
可以向上述的核酸吸附性固體載體中加入交聯劑。關於交聯劑， 可以使用己知的那些，並且優選的是，根據固體載體材料的官能團來 選擇合適的類型。當所述的官能團是羥基時，可優選使用日本專利申 請公開No. 07/256,066、 03/058,431等中所述的交聯劑，但對其沒有 限定。
可以向核酸吸附性固體載體中加入溼潤劑。關於溼潤劑，可優 選使用日本專利申請公開No. 63/256,066 、日本專利公報No. 03/068,431等中所述的溼潤劑，但對其沒有限定。
溶液可從其內部通過、並且其厚度為10 (im到500 pm的核酸 吸附性多孔膜是優選的。更優選的是，核酸吸附性多孔膜的厚度為 50nm到250(im。為了容易洗滌，核酸吸附性多孔膜的厚度優選為 較薄。
溶液可從其內部通過、並且最小孔徑為0.22 (im或更大的核酸 吸附性多孔膜是優選的。更優選的是，核酸吸附性多孔膜的最小孔徑 為0.5 pm或更大。此外，優選使用最大孔徑與最小孔徑之比為2或
更大的多孔膜。結果，可得到足夠的用於吸附核酸的表面積，並且孔 不容易被堵。最大孔徑與最小孔徑之比更優選為5或更大。
溶液可從其內部通過、並且孔隙率為50%到95%的核酸吸附性 多孔膜是優選的。孔隙率更優選為65%到80%。此外，泡點為0.1 kgf/ci^到10 kgf/ct^的核酸吸附性多孔膜是優選的。泡點更優選為 0.2 kgf/cm2至lj 4 kgf/cm2。
溶液可從其內部通過、並且壓力損失為0.1 kPa到100kPa的核 酸吸附性多孔膜是優選的。結果，核酸吸附性多孔膜在加壓狀態下， 可獲得均勻的壓力。壓力損失更優選為0.5 kPa到50kPa。在本文中， 術語"壓力損失"是指水每通過100 pm的膜厚所需的最小壓力。
溶液可從其內部通過、並且水的滲濾量(水在1kg/cn一的壓力、 25'C下通過時的滲濾量)為每1分鐘每1 cm"的膜lmL到5000 mL 的核酸吸附性多孔膜是優選的。水的滲濾量(水在1 kg/crr^的壓力、 25。C下通過時的滲濾量)更優選為每1分鐘每1 cm4勺膜5 mL至U 1000 mL。
溶液可從其內部通過、並且核酸吸附量為每1 mg的多孔膜O.l 叫或更多的核酸吸附性多孔膜是優選的。核酸吸附量更優選為每1 mg的多孔膜0.9嗎或更多。
溶液可從其內部通過、並且其所含的纖維素衍生物具有下述特 徵的核酸吸附性多孔膜是優選的，所述纖維素衍生物的特徵為在將 邊長為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸中時，該纖維素衍 生物在l小時以內(不含l小時)不溶解，但是在48小時以內(不 含48小時)溶解。此外，具有下述特徵的纖維素衍生物是優選的， 所述特徵為在將邊長為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸 中時，該纖維素衍生物在1小時以內(不含1小時)溶解，但是在將 所述膜浸在5 mL 二氯甲烷中時，該纖維素衍生物在24小時以內(不 含24小時)不溶解。其中更優選的是這樣的纖維素衍生物在將邊 長為5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸中時，該纖維素衍生 物在l小時以內(不含l小時)溶解，但是在將所述膜浸在5mL二 氯甲烷中時，該纖維素衍生物在24小時以內(不含24小時)不溶解。200580016159.1
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在核酸混合物溶液通過核酸吸附性多孔膜時，優選的是，使核 酸混合物溶液從多孔膜的一側流到另一側，從而使溶液與多孔膜均勻 接觸。在核酸混合物溶液通過核酸吸附性多孔膜時，為了使孔不容易 被堵，優選的是，使核酸混合物溶液以從較大孔徑向較小孔徑的方式 通過核酸吸附性多孔膜。
當核酸混合物溶液通過核酸吸附性多孔膜時，流速優選為每
單位膜面積(cm2) 2)iL/秒到1500 pL/秒，從而使溶液與多孔膜達到 合適的接觸時間。如果溶液與多孔膜的接觸時間太短，則不能得到充 分的分離和純化的效果；而如果時間太長，則從可操作性來說不是優 選的。流速優選為每單位膜面積(cm2) 5 ^L/秒到700 一L/秒。
此外，溶液可從其內部通過的核酸吸附性多孔膜可以以一層的 方式使用，但也可以以多層的方式使用。核酸吸附性多孔膜的多層可 以彼此相同或互不相同。
優選使用這樣的核酸分離柱該核酸分離柱在具有至少兩個開 口的容器內容納有核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可通過該多孔
膜。此外，優選使用這樣的核酸分離柱該核酸分離柱在具有至少兩 個開口的容器內容納有多層核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可通
過該多孔膜。在這種情況下，具有至少兩個開口的容器所容納的多層 核酸吸附性多孔膜可相同或不同。 .
多層核酸吸附性多孔膜可以是無機材料核酸吸附性多孔膜和有機 材料核酸吸附性多孔膜的組合。其實例是玻璃濾膜與再生纖維素多孔 膜的組合。多層核酸吸附性多孔膜還可以是無機材料核酸吸附性多孔 膜和有機材料核酸非吸附性多孔膜的組合。其實例是玻璃濾膜和尼龍 (或聚碸)多孔膜的組合。
根據柱的形狀的不同，可以將上述核酸吸附性多孔膜製成除膜 以外的其它形式。例如，可將其製成片狀或塊狀。
核酸分離純化柱除了在具有至少兩個開口的容器內容納有核酸 吸附性多孔膜(如上所述，溶液能夠通過該膜)以外，不應該包含其 它組件。可使用的容器材料的實例包括塑料，例如，聚丙烯、聚苯乙 烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯。此外，優選使用可生物降解的材料。此外，
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容器可以是透明的或有顏色的。
可使用這樣一種核酸分離純化柱，該柱具有用於區分各個核酸 分離純化柱的裝置。用於區分各個核酸分離純化柱的裝置可包括條形 碼、二維條形碼、磁條和IC卡。
還可使用具有這樣一種結構的核酸分離純化柱，所述結構使得 可以很容易地從所述具有至少兩個開口的容器中取出核酸吸附性多 孔膜。
本發明所使用的試驗樣品不受限制，只要試驗樣品中含有核酸 即可，例如，其在診斷領域中包括作為試驗樣品收集的體液(例如 全血、血漿、血清、尿、排洩物、精液和唾液)，或者植物(或其一 部分)、動物(或其一部分)、細菌、病毒、培養的細胞以及由生物 材料(例如上述樣品的裂解產物和勻漿)製成的溶液。
使用含有試劑的水溶液處理這些試驗樣品，所述試劑能分解細 胞膜和核膜，並溶解核酸，所以被稱為核酸溶解試劑。由此可以使細 胞膜和核膜分解，並且使核酸分散到水溶液中，從而得到核酸混合物 溶液。
含有核酸的樣品可以是含有單獨 一 種核酸的樣品，或者可以是 含有多種不同核酸的樣品。待回收的核酸不受種類的限制，其可以是
DNA或RNA，可以是單鏈的或雙鏈的，以及直鏈的或環狀的。樣品 數可以為一個或多個(使用多個容器平行處理多個樣品)。對待回收 的核酸的長度也沒有特別的限定，可以使用(例如)從幾bp到幾 Mbp之間的任何長度的核酸。為了使操作方便，待回收的核酸的長 度通常為約幾bp到約幾百kbp。本發明用於分離和純化核酸的方法 能夠使試驗人員迅速回收到比使用常規的用於分離和純化核酸的簡 單方法得到的核酸相對更長的核酸，並且可以用來回收長度優選為 50kbp或更長、更優選為70kbp或更長、進一步優選為100kbp或更 長的核酸。為了回收較長的DNA，優選進行溫和的攪拌和吸液。
通過裂解細胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核 酸的樣品溶液的步驟將在下文描述。在本發明中，核酸溶解試劑通過 使細胞膜和核膜裂解，而用來使核酸溶解，核酸溶解試劑的實例包括
含有選自離液鹽、表面活性劑、消泡劑、蛋白酶和核酸穩定劑這類化 合物的溶液。
作為通過裂解細胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含 有核酸的樣品溶液的方法，以下說明一種方法，該方法包括以下步驟
(I) 向容器中加入含細胞或病毒的樣品；
(II) 向容器中加入含離液鹽或表面活性劑的核酸溶解試劑，並 將樣品與核酸溶解試劑的溶液混合；
(III) 溫育所得到的混合溶液；
(IV) 向經溫育的混合溶液中加入水溶性有機溶劑。 在通過裂解細胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有
核酸的樣品溶液的步驟中，通過均質處理樣品可提高其對自動化處 理的適應性。例如，這種均質處理可通過超聲波處理、使用尖銳突 出物處理、高速攪拌處理、通過細孔擠出處理或使用玻璃珠處理來 實施。
此外，在通過裂解細胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得 到含有核酸的樣品溶液的歩驟中，通過使用含有蛋白酶的核酸溶解 試劑，可提高核酸的回收量和回收率，從而可使含有核酸的樣品的 用量減少並使分析加速成為可能。
可優選使用至少一種選自絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金 屬蛋白酶等中的蛋白酶作為這種蛋白酶。此外，可優選使用多種蛋 白酶的混合物。
沒有特別限定絲氨酸蛋白酶，例如，可優選使用蛋白酶K。沒 有特別限定半胱氨酸蛋白酶，例如，可優選使用木瓜蛋白酶和組織 蛋白酶。
沒有特別限定金屬蛋白酶，例如，可優選使用羧肽酶。 蛋白酶的使用量可以優選為在添加後達到每毫升全部反應體
系有0.001IU到IOIU、更優選為0.01IU到IIU的蛋白酶。
此外，可優選使用不含核酸酶的蛋白酶作為這種蛋白酶。此外， 可優選使用含有穩定劑的蛋白酶。可優選使用金屬離子作為穩定劑。 具體地說，優選鎂離子，例如，可以以氯化鎂的形式添加。在蛋白酶中加入穩定劑可以使回收核酸所需的蛋白酶的量降至微量，從而 減少核酸回收所需的費用。基於反應體系的總量，蛋白酶所用穩定
劑的量優選為1毫摩爾/L到1000毫摩爾/L、更優選為10毫摩爾/L 到100毫摩爾/L。
蛋白酶通過預先與其它試劑(例如離液鹽和表面活性劑)混合， 可以作為一種試劑使用，而用於回收核酸。
作為可供選擇的另一種方式，蛋白酶可以與其它試劑(例如離 液鹽和表面活性劑)分開使用。
在後一情況下，樣品首先與含有蛋白酶的試劑混合，然後把混 合物與含有離液鹽和表面活性劑的試劑混合。或者，在首先把樣品 與含有離液酸(chaotr叩ic acid)和表面活性劑的試劑混合後，再混 入蛋白酶。
此外，可以從容納蛋白酶的容器逐滴直接加入到樣品或樣品與 含有離液鹽和表面活性劑的試劑形成的混合物中，就像滴眼藥水一 樣。在此情況下，可簡化操作。
核酸溶解試劑還可以優選為以千燥態供給。此外，例如，可以 使用含有預先通過冷凍-乾燥而得到的乾燥態蛋白酶的容器。還可以 通過同時使用以乾燥態供給的核酸溶解試劑和預先含有乾燥蛋白酶 的容器，得到一種含有核酸的樣品溶液。
核酸溶解試劑中離液鹽的濃度優選為0.5摩爾/L或更高，更優 選為0.5摩爾/L到4摩爾/L，甚至更優選為1摩爾/L到3摩爾/L。關 於離液鹽，己知的離液鹽都可以使用，而沒有特別限定。例如，可以 使用胍鹽、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀。特別優選為胍鹽。胍鹽的 實例包括鹽酸胍、異硫氰酸胍和胍的硫氰酸鹽(硫氰酸胍)，並且特 別優選的是鹽酸胍或胍的硫氰酸鹽。這些鹽可單獨使用，或者將其中 的兩種或多種組合使用。
可以使用諸如脲之類的離液物質來代替離液鹽。
表面活性劑(例如)包括非離子型表面活性劑、陽離子表面活 性劑、陰離子表面活性劑和兩性表面活性劑。
在本發明中，可優選使用非離子型表面活性劑和陽離子表面活
性劑。
非離子型表面活性劑包括聚氧亞乙基烷基苯基醚類表面活性 劑、聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑和脂肪酸烷醇醯胺，並且優選為 聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑。在聚氧亞乙基(POE)烴基醚類表 面活性劑中，更優選的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷 基醚、POE亞烷基癸醚、POE脫水山梨糖醇單月桂酸酯、POE脫水 山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、四油酸聚氧化 亞乙基山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。
陽離子表面活性劑包括溴化十六烷基三甲基銨、氯化十二烷基 三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨和氯化十六垸基吡啶錙。
這些表面活性劑可以單獨使用，或者將其中的兩種或多種組合 使用。在核酸溶解試劑中，表面活性劑的濃度優選為0.1重量％到20 重量o/。。
當回收除RNA以外的核酸(例如DNA)時，優選的是，在使 核酸溶解、從而由試驗品製成含核酸的樣品溶液的步驟中，向核酸溶 解試劑溶液中加入RNA降解酶。在這種情況下，能夠減少與待回收 核酸共存的RNA的幹擾。還優選加入DNA降解酶抑制劑。反之， 在回收除DNA之外的核酸(例如RNA)的情況下，優選的是向核酸 溶解試劑溶液中加入DN A降解酶。在這種情況下，能夠減少與待回 收核酸共存的DNA的幹擾。還優選加入RNA降解酶抑制劑。能夠 特異性地抑制RNA降解酶的那些RNA降解酶抑制劑是優選的。對 RNA降解酶沒有特別限定，並且可優選使用能夠特異性地降解RNA 的酶(例如核糖核酸酶H) (RNase H)。對DNA降解酶沒有特別 限定，並且可優選使用能夠特異性地降解DNA的酶(例如DNaseI)。 可以按常規使用的濃度來使用核酸降解酶和核酸降解酶抑制劑。還可 以對它們進行常規的溫熱處理。優選的是將溫熱處理與蛋白降解酶處 理一起進行。
作為核酸穩定劑，可舉出這樣的試劑其可以發生反應使核酸 酶的活性失活。根據試驗樣品的不同，存在這樣的情況其中含有核 酸酶(能夠使核酸降解)，結果當核酸被均化時，核酸酶與核酸發生
反應，從而導致回收量顯著降低。為了達到避免這種情況發生的目的， 可以使具有使核酸酶失活的功能的穩定劑與核酸溶解溶液共存。結 果，核酸的回收率和回收效率提高，而使得試驗樣品的用量最少化並 使操作加速。
作為具有使核酸酶活性失活的功能的核酸穩定劑，可使用通常 被用作還原劑的化合物。還原劑的實例包括氫化化合物，例如，氫 原子、碘化氫、硫化氫、氫化鋁鋰和硼氫化鈉；髙正電性金屬，例如， 鹼金屬、鎂、鈣、鋁和鋅，或它們的汞合金；有機氧化物，例如，醛 類、糖類、甲酸和草酸；以及巰基化合物。在這些物質當中，巰基化 合物是優選的。巰基化合物的實例包括N-乙醯半胱氨酸、巰基乙醇 和烷基硫醇或類似的化合物。巰基化合物可以單獨使用，或者將其中 的兩種或多種組合使用。
在核酸溶解試劑中，核酸穩定劑的濃度優選為0.1重量％到20 重量％，並且更優選為0.3重量％到15重量％。在核酸溶解試劑中，
巰基化合物的濃度優選為0.1重量％到10重量％，並且更優選為0.5 重量％到5重量％。
在細胞膜和核膜被分解並且使核酸溶解、從而由試驗品製成含 核酸的樣品溶液的上述步驟中，優選的是，含核酸的樣品溶液中含有 防沫劑(消泡劑)。
作為消泡劑，可舉出如下試劑矽類消泡劑(例如，矽油、二 甲基聚矽氧垸、有機矽乳液、改性聚矽氧烷和有機矽複合物等)、醇 類消泡劑(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亞烷基
二醇等)、醚類消泡劑(例如，庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山
梨糖醇等)、脂肪油類消泡劑(例如，動物油和植物油等)、脂肪酸 類消泡劑(例如，硬脂酸、油酸和棕櫚酸等)、金屬皂類消泡劑(例 如，硬脂酸鋁和硬脂酸鈣等)、脂肪酸酯類消泡劑(例如，天然蠟和 磷酸三丁酯等)、磷酸鹽酯類消泡劑(例如，辛基磷酸鈉等)、胺類 消泡劑(例如，二戊基胺等)、醯胺類消泡劑(例如，硬脂酸醯胺等) 和其它消泡劑(例如，硫酸鐵和礬土等)。這些消泡劑可以單獨使用 或者將其中的兩種或多種組合使用。特別優選的是，將矽類消泡劑和
醇類消泡劑這兩種化合物組合在一起使用。
在核酸溶解試劑中，消泡劑的濃度優選為0.1重量％到10重量%。
核酸穩定劑優選為以乾燥態供給。此外，還可以使用預先裝有 乾燥態(例如通過冷凍乾燥)的蛋白酶的容器。也可以通過同時使用 上述乾燥態的核酸溶解試劑和預先裝有乾燥態的蛋白酶的容器，而得 到含核酸的試驗樣品。在通過上述方法獲得含核酸的試驗樣品時，核 酸溶解試劑和蛋白酶具有良好的儲存穩定性，並且可以在不改變經分 離和純化的核酸的收率的情況下使操作簡化。
對混合樣品和核酸溶解試劑溶液的方法沒有特別限定。
混合時，優選使用攪拌器在30到3000卬m下混合3分鐘，由
此可以提高所分離和純化的核酸的收率。此外，還優選用上下翻轉 (end-over-end)的混合操作方式混合5到30分鐘。此外，還可以 通過反覆吸液操作10到50次來實施混合。在此情況下，通過簡單 操作可以提高經分離和純化的核酸的收率。
通過在蛋白酶的最佳溫度下以最佳反應時間來溫育樣品和核 酸溶解試劑溶液的混合物，可以提高經分離和純化的核酸的收率。 溫育溫度通常為20°C到70°C，這優選為蛋白酶的最佳溫度，溫育 時間通常為1分鐘到18小時，這優選為蛋白酶的最佳溫育時間。對 溫育方法沒有特別限定，並且可以用浸入熱浴或放入加熱室的方式 來實施。
在上述細胞膜和核膜被分解並且使核酸溶解、從而由試驗品制 成含核酸的樣品溶液的上述步驟中，被加入到經溫育的混合溶液中的 水溶性有機溶劑的實例為醇類、丙酮、乙腈和二甲基甲醯胺。特別優 選使用的是醇類。任何伯醇、仲醇和叔醇都可以作為醇類使用。優選 使用的是甲醇、乙醇、丙醇和其異構體、以及丁醇和其異構體之類的 醇。更優選使用的是乙醇。這些水溶性有機溶劑中的每一種都可以單 獨使用或者可將其中的多種組合使用。在核酸溶解試劑溶液中，這種 水溶性有機溶劑的濃度優選為1重量％到20重量％。在含核酸的樣 品溶液中，這種水溶性有機溶劑的最終濃度優選為5重量％到90重
量％。
在通過裂解細胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有 核酸的樣品溶液的步驟中，核酸溶解試劑溶液的pH優選為5到10，
更優選為6到9，進一步更優選為7到8。
在上述細胞膜和核膜被分解並且使核酸溶解、從而由試驗品制 成含核酸的樣品溶液的上述步驟中，所得到的含核酸的樣品溶液的表 面張力優選為0.05J/m2或更低，其粘度優選為lmPa至lj 10，000mPa， 而其比重優選為0.8到1.2。
下文將對洗滌步驟進行說明。實施洗漆操作的結果是，可以提 高核酸的回收量和回收純度，並且使含核酸的試驗品的需求量較少。 關於洗滌步驟，為了達到快速的目的，可進行一次洗滌步驟，而如果 純度更重要時，則優選為重複洗滌多次。
在洗滌步驟中，使用試管、移液管、自動注入裝置或具有類似 功能的供料裝置，將洗滌液提供給容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分 離純化柱。將洗滌液從核酸分離純化柱的第一個開口 (含有核酸的核 酸混合物溶液已通過該開口注入)供入，並且使用與所述第一個開口 連接的壓力差產生裝置(例如，滴液管、注射器、泵和電動移液管等)。 由此使核酸分離純化柱的內部形成加壓狀態，從而使洗滌液通過核酸 吸附性多孔膜，並從不同於所述第一個開口的另一個開口排出洗滌 液。此外，洗滌液可由第一個開口供入並由該第一個開口排出。此外， 洗滌液可由不同於所述第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通 過該開口注入)的另一個開口供入，並由該同一開口排出。在這些方 式中，非常優選的方式如下洗滌液由核酸分離純化柱的第一個開口 供入、通過核酸吸附性多孔膜並由不同於所述第一個開口的另一個開 口排出，這是因為該方式具有優異的洗滌效率。
在洗滌操作中，洗滌液的量優選為2 ^L/mmS或更多。當使用大 量的洗滌液時，可改善洗滌效果，但為了保持可操作性並防止樣品被 排出，其用量優選為200liL/mn^或更少。
當在洗滌步驟中供入洗滌液、然後使其停留50秒或更長時，可 以顯著提高核酸的回收量。當洗滌液停留更長的時間時，可預料到會
使回收量達到穩定，但是為了加快操作，選擇1,000秒或更短的時間。 在本發明中，在自動提取裝置供入洗滌液之後開始計時，因此
允許停留時間是自動控制的。
在洗滌過程中，在使洗滌液通過核酸吸附性多孔膜時，流速優
選為每單位膜面積(cm2) 2pL/秒到1500liL/秒，更優選為每單 位膜面積(cm2) 5 pL/秒到700 ^L/秒。通常，降低通過速度以延長 時間，從而使洗滌進行得更充分。但是，優選的是，通過使用本發明 的上述範圍，可以使分離和純化RNA的步驟快速地實施，而不會降 低洗滌效率。
在洗滌步驟中，洗滌液的溫度優選為4 。C到70 °C。此外，更 優選的是，洗滌液溫度為室溫。在進行洗滌步驟的同時可對核酸分離 純化柱通過超聲波或機械振動進行攪動。另一方面，可通過實施離心 操作來進行洗滌。
通常，在洗滌步驟中，雖然洗滌液中不含諸如核酸降解酶之類 的酶，但是其中可以含有降解諸如蛋白質之類的汙染物的酶。在某些 情況下，洗滌液中也可以含有DNA降解酶、RNA降解酶等。使用含 DNA降解酶的洗滌液的結果是，只能夠選擇性地回收試驗品中的 RNA。反之，使用含RNA降解酶的洗滌液的結果是，只能夠選擇性 地回收試驗品中的DNA。
在洗滌步驟中，洗滌液優選為這樣的溶液其含有水溶性有機 溶液和水溶性鹽中的至少 一 種。洗滌液必須具有的能力是能夠洗出核 酸混合物溶液中的雜質，該雜質是與核酸一起被吸附到核酸吸附性多 孔膜上的。在這一方面，洗滌液必須具有這樣的成分該成分僅使雜 質從核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不會使核酸解吸附。為達到所述 目的，由於核酸極難溶於水溶性有機溶劑(例如醇類)，因此水溶性 有機溶劑適合於保留核酸而使其它物質解吸附。此外，加入水溶性鹽 可以增強核酸的吸附效果，因此可以使除去雜質和不需要物質的操作 的選擇性得以提高。
關於洗滌液中所含的水溶性有機溶劑，可以使用甲醇、乙醇、 異丙醇、正丙醇、丁醇、丙酮等，在這些有機溶劑中，優選使用乙醇。
洗滌液中所含的水溶性有機溶劑的量優選為20重量％到100重量％，
更優選為40重量％到80重量％。
另一方面，對於洗滌液中所含的水溶性鹽來說，滷鹽是優選的， 並且在滷鹽中，氯化物是更優選的。水溶性鹽還優選為一價陽離子或 二價陽離子的鹽，特別優選鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽。在這些金屬鹽中， 鈉鹽和鉀鹽是最優選的。當洗滌液中含有水溶性鹽時，其濃度優選為 10毫摩爾/L或更高，並且對濃度上限沒有特別限定，只要該上限不 影響雜質的溶解性即可，其濃度優選為l摩爾/L或更低，更優選為 0.1摩爾/L或更低。在上述所有情況中，水溶性鹽為氯化鈉並且氯化 鈉濃度為20毫摩爾/L或更高是特別優選的。
此外，洗滌液的特徵在於其中不含離液物質。結果，可減小洗 滌步驟後離液物質混入回收步驟中的可能性。在回收步驟中，當離液 物質混入其中時，該物質通常會抑制諸如PCR反應之類的酶反應， 因此，考慮到之後的酶反應，理想的情況是洗滌液中不含離液物質。 此外，因為離液性物質具有腐蝕性和危害性，所以為了操作的安全性， 不需要時就不使用離液性物質對實驗人員極為有利。
在本文中，離液物質是指上文所述的脲、氯化胍、異硫氰酸胍、
硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀等。
由於洗滌液對柱或者類似的容器具有高度的潤溼性，所以在核 酸分離純化過程中的洗滌歩驟期間，洗滌液常常保留在容器中，結果 洗滌步驟之後的回收步驟受到洗滌液汙染，從而導致核酸純度降低並 使隨後步驟中的反應性降低。因此，在本發明的第一種方法和第二種 方法中，當使用柱或類似的容器進行核酸的吸附和解吸附時，重要的 是，在吸附或洗滌中使用的溶液、特別是洗滌液不能留在柱內，這樣 它就不會對下一步驟產生影響。
因此，為了防止洗漆步驟中使用的洗滌液對隨後步驟中使用的 回收液造成汙染，並由此保持柱內的洗滌液殘留量為最小，洗滌液的 表面張力小於0.035 J/n^是理想的。當表面張力小時，可改善洗滌液 對柱的潤溼性能並且可控制殘留溶液的體積。
然而，為了提高洗滌效率，可增加水的比例，但在這種情況下，
洗滌液的表面張力增大並且殘留溶液的量增多。當洗滌液的表面張力
為0.035 J/iT^或更大時，可通過增強柱的斥水性從而控制殘留溶液的
量。通過增強柱的斥水性，而形成液滴，並且可通過液滴的向下流動
來控制殘留溶液的量。用於增強斥水性的方法的實例包括在柱表面 上塗敷防水劑(例如矽)；在柱成形時，混入防水劑(例如矽)；以 及類似的方法，但不限於此。
在使用本發明中的核酸吸附性多孔膜時，可以簡化洗滌步驟。 由此，(1)洗滌液通過核酸吸附性多孔膜的次數在這種情況下僅為 一次；(2)能在室溫下實施洗滌步驟；(3)在洗滌後，在這種情況 下可以直接將回收液注入到提取柱內；(4)可以是上述(1) 、 (2) 和(3)中的任何一個或兩個或多個步驟。其原因在於，在常規方法 中，為了快速地除去洗滌液中所含的有機溶劑，因此通常需要乾燥步 驟，但是由於本發明中的核酸吸附性多孔膜是薄膜，所以可以省略幹 燥步驟。
在常規的核酸分離和純化的步驟中，存在以下問題在洗滌步
驟期間，洗滌液經常濺散並附著在其它部位上，從而造成樣品玷汙(汙 染)。通過改善廢液容器和核酸分離純化柱的形狀，可以抑制洗滌步 驟中的這類汙染，其中，在所述柱內，核酸吸附性多孔膜被容納在具 有兩個開口的容器中。
下面，將說明核酸從核酸吸附性多孔膜上解吸附並回收的步驟。 在回收步驟中，使用自動注入裝置或具有類似功能的供料裝置將回收 液供給裝有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱。將回收液由核酸分 離純化柱的第一個開口(含有核酸的樣品溶液已通過該開口注入)供 入，並在使用與所述第一個開口連接的壓力差產生裝置使核酸分離純 化柱的內部形成真空的狀態下，使回收液通過核酸吸附性多孔膜，並 且可從不同於所述第一個開口的另一個開口排出。也可以將回收液由 所述第一個開口供入並由同一開口排出。還可以使回收液由不同於核 酸分離純化柱的所述第一個開口(含有核酸的樣品溶液已通過該開口 注入)的另一個開口供入，並且也從該開口排出。然而，以下方法具
有優異的回收效率，因而是更優選的，所述方法為回收液由核酸分
離純化柱的第一個開口供入、通過核酸吸附性多孔膜並由不同於所述 第一個開口的另一個開口排出。
當在回收步驟中供入回收液、然後使其停留20秒或更長時，可
以顯著提高核酸的回收量。當回收液停留更長的時間時，可預料到會
使回收量達到穩定，但是為了加快操作，選擇300秒或更短的時間。
在本發明中，在自動提取裝置供入回收液之後開始計時，因此 可以自動控制回收液的允許停留時間。
調節回收液的體積與含核酸的樣品溶液(由試驗品製備得到) 的體積之比，由此可實現核酸的解吸附。含有經分離和純化的核酸的 回收液的體積取決於當時所使用的試驗品的量。儘管回收液的常規用 量為幾十微升到幾百微升，但是當樣品的量極少，或者反之，當大量 核酸待分離和純化時，回收液的用量可在1微升到幾十毫升之間變 化。
關於回收液，可優選使用經純化的蒸餾水、Tris/EDTA緩衝液以 及類似的溶液。此外，當使回收的核酸進行PCR (聚合酶鏈式反應) 時，可使用PCR用的緩衝液(例如，含有最終濃度為50毫摩爾/L 的KC1、 10毫摩爾/L的Tris-HCl和1.5毫摩爾/L的MgCl2的水溶液)。
優選的是，回收液的pH為pH 2到pH 11，更優選為pH 5到pH 9。此外，離子強度和鹽濃度會對被吸附核酸的洗脫產生特別影響。 優選的是，回收液的離子強度為290毫摩爾/L或更低，鹽濃度為90 毫摩爾/L或更低。其結果是，核酸的收率提高，並且可回收更多的 核酸。被回收的核酸可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。
當參照含核酸的樣品溶液的初始體積來減小回收液的體積時， 可以得到含有濃縮核酸的回收液。優選的是，可以使(回收液的體 積)(樣品溶液的體積)為1:100到99:100，更優選的是，可以使(回 收液的體積):(樣品溶液的體積)為1:10到9:10 。其結果是，在這種 情況下可以容易地濃縮核酸，而無需在核酸分離純化之後的步驟中實 施濃縮操作。根據這種方法，可提供一種用於製備核酸溶液的方法， 其中，該溶液中的核酸濃度比試驗品中的高。
另一種方法是，在回收液的體積大於含核酸的樣品溶液的初始
體積的條件下使核酸解吸附，由此可製備出含有所需濃度的核酸的回 收液，並且可製備出適合於下步操作(例如PCR)的含核酸的回收
液。優選的是，可以使(回收液的體積):(樣品溶液的體積)為1:1到 50:1，更優選的是，可以使(回收液的體積):(樣品溶液的體積)為1:1 到5:1 。其結果是得到這樣的優點在核酸分離純化之後，不再需 進行繁瑣的濃度調整操作。此外，使用足量的回收液的結果是，能夠 提高從多孔膜回收的核酸的回收率。
對回收液注入的次數沒有限定，注入次數可以是一次或多次。 通常，在方便快捷地分離和純化核酸時，可通過一次回收操作的方式 來進行，但是在要回收大量核酸時，可以多次注入回收液。
在回收步驟中，可將核酸的回收液配製成在後續步驟中可以使 用的組合物。經分離和純化的核酸經常要通過PCR (聚合酶鏈式反 應)方法進行擴增。在此情況下，經分離和純化的核酸溶液必須使用 適合於PCR方法的緩衝液來進行稀釋。當適合於PCR方法的緩衝液 被用於本發明的回收步驟的回收液中時，就可以方便快捷地轉入隨後 的PCR步驟。
並且，在回收步驟中，可加入用於阻止RNA (被回收在RNA 回收液中)降解的穩定劑。作為穩定劑，可加入抗細菌劑、抗真菌劑、 核酸降解抑制劑以及類似的試劑。作為核酸酶抑制劑，可舉例為 EDTA及類似的試劑。此外，作為另一種實施方案，也可以預先向回 收容器中加入穩定劑。
並且，對回收步驟中所使用的回收容器沒有特別限定，可使用 由在260nm處沒有吸收的原料製成的回收容器。在此情況下，無需 把回收的RNA溶液轉移到其它容器就可測量該溶液的濃度。作為在 260nm處沒有吸收的原料，可使用(例如)石英玻璃和類似的原料， 但該原料不限於此。
可使用容納有核酸吸附性多孔膜(各溶液能按上文所述的方式 通過該膜)的核酸分離純化柱、並按照以下步驟來分離和純化核酸。 可列出以下步驟(a)向在具有至少兩個開口的容器內容納有核酸吸 附性多孔膜(溶液可以通過該膜)的核酸分離純化柱的第一個開口注
入含核酸的樣品溶液；(b)使用與核酸分離純化柱的所述第一個開口 連接的壓力差產生裝置，使核酸分離純化柱的內部形成加壓狀態，使 被注入的含核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜、並從核酸分離純 化柱的另一個開口排出，由此將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；(C) 向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入洗滌液；(d)使用與核酸分 離純化柱的所述第一個開口連接的壓力差產生裝置，使核酸分離純化 柱的內部形成加壓狀態，使被注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜、 並從另一個開口排出，由此在核酸仍吸附在核酸吸附性多孔膜上的狀 態下，洗滌該膜；(e)向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入回收 液；以及(f)使用與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接的壓力差 產生裝置，使核酸分離純化柱的內部形成加壓狀態，使被注入的回收 液通過核酸吸附性多孔膜、並從另一個開口排出，由此使核酸從核酸 吸附性多孔膜上解吸陽，並且將解吸附的核酸排放到核酸分離純化柱 的外部。
在上述步驟(b)、 (d)和(f)中的每一步中，含核酸的樣品溶液、洗 滌液或回收液都是在加壓狀態下通過核酸吸附性多孔膜。更優選的 是，在上述步驟(b)、 (d)和(f)中的每一步中，含核酸的樣品溶液、洗 滌液和回收液都被注入到在具有至少兩個開口的容器內容納有核酸 吸附性多孔膜的核酸分離純化柱的第一個開口中，並且都使用與該柱 的所述第一個開口連接的壓力差產生裝置使該柱的內部形成加壓狀 態，由此每種被注入的溶液都從所述柱流過並由另一個開口排放。含 核酸的樣品溶液、洗滌液或回收液在加壓狀態下通過上述多孔膜的結 果是，所述裝置能夠以緊湊的方式自動操作，因此是優選的。實施加 壓的程度優選為約10kpa到200kpa，更優選為40kpa到100kpa。
在上述分離和純化核酸的步驟中，從最開始注入含核酸的樣品 溶液，直到在核酸分離純化柱的外部得到核酸，該過程可以在10分 鍾之內完成，或者，在合適的環境下，該過程可以在2分鐘之內完成。 在按照上述步驟分離純化核酸之後，還可以製備出收率為試驗品所含 核酸的總量的50重量％或更高的核酸，在合適的環境下，其收率為 90重量％或更高。
在上述分離和純化核酸的步驟中，可以回收分子量範圍寬達為
lkpb到200kpb (特別是20kpb到140kpb)的核酸。與使用玻璃濾膜 的離心柱的常規方法相比，本發明能夠回收鏈更長的核酸。
此外，在上述分離和純化核酸的步驟中，可回收得到這樣的核 酸在含有DNA的情況下，可回收得到其純度與紫外光-可見光分光 光度計的吸光度測量值(260nm/280nm)為1.6到2.0相對應的核酸； 在含有RNA的情況下，可回收得到其純度與紫外光-可見光分光光度 計的吸光度測量值(260nm/280nm)為1.8到2.2相對應的核酸，並 且可以穩定地得到幾乎不含雜質汙染物的高純度核酸。此外，可回收 得到紫外光-可見光分光光度計的吸光度測量值(260nm/280nm)為 約1.8的DNA和吸光度測量值(260nm/280nm)為約2.0的RNA。
實施例
實施例1
以下對通過採用本發明的核酸提取方法而進行的核酸提取步驟 所收集的核酸的收率進行測量試驗。在本試驗中，使用上述實施方案 中所說明的核酸提取裝置。
(1) 核酸分離純化容器的製作 關於用作本實施例的提取柱的核酸分離純化容器，用高抗衝聚
苯乙烯製成這樣的核酸分離容器其內徑為7mm，其中容納有用於 吸附核酸的固相，並具有兩個開口。底端開口的直徑為2.5mm。
(2) 核酸分離純化單元
關於核酸吸附性多孔膜，使用通過將三醋酸纖維素多孔膜進行 皂化處理而製備的多孔膜(膜厚80pm)，並將其裝在上述(1)所 製作的核酸分離柱的核酸吸附性多孔膜的容納部分中。
(3) RNA溶解試劑和洗滌液的製備 按照以下配方來製備RNA溶解試劑和洗滌液。
(RNA溶解試劑的配方) 鹽酸胍(由Life Technology公司生產) 382g Tris (由Life Technology公司生產) 12.lg
Triton X-100 (由ICN公司生產) 蒸餾水
(洗滌液的配方) 10毫摩爾/L Tris-HCl (pH7.5) 30%的乙醇
(回收液的配方) 1毫摩爾/L Tris-HCl (pH6.5)
(4)核酸的純化操作 製備經溫育的人骨髓瘤細胞(HL60)溶液。收集經溫育的溶液， 使其含有1X1S個細胞，將得到的細胞溶液在300X 5g的條件下離 心沉澱，並除去上清液從而得到細胞。向上述HL60細胞(1X1S個) 中加入200pL的上述RNA溶解試劑，然後進行攪動，向其中加入 200pL的乙醇，並對混合物進行攪動從而得到含RNA的樣品溶液。 將含RNA的樣品溶液注入到核酸純化單元(在上述(1)和(2)中 製備)的第一個開口中，其中，所述的核酸純化單元具有有機大分子 物質的多孔膜，並且所述的有機大分子物質含有具有不同乙醯值的醋 酸纖維素的混合物；然後將壓力差產生裝置與所述第一個開口連接， 使核酸分離純化單元的內部形成加壓狀態，從而使被注入的含RNA 的樣品溶液通過上述多孔膜以便與多孔膜接觸，然後從核酸分離純化 單元的另一個開口排放出樣品溶液。之後，將洗滌液注入到上述核酸 分離純化單元的所述第一個開口，將壓力差產生裝置與所述第一個開 口連接，使核酸分離純化單元的內部形成加壓狀態，從而使被注入的 洗滌液通過上述多孔膜、並從另一個開口排出。接著，將回收液注入 到上述核酸分離純化單元的所述第一個開口，將壓力差產生裝置與核 酸分離純化單元的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內部形 成加壓狀態，從而使被注入的回收液通過所述多孔膜、並從另一個開 口排出，同時回收排出的溶液。
10g
1,000mL
(5)經分離和純化的RNA的確認
測量回收液在260nm處的吸收光譜，從而確定RNA的收率，並 對RNA的收率與本實施例的核酸提取步驟中的洗滌液允許停留時間 和回收液允許停留時間的關係進行評價。作為本實施例的結果，核酸 的收率與注入洗滌液之後使其停留的時間這兩者之間的關係顯示在 圖11中。此外，核酸的收率與注入回收液之後使其停留的時間這兩 者之間的關係顯示在圖12中。
如圖11和圖12所示，可以發現當對注入洗滌液之後使其停 留的時間和注入回收液之後使其停留的時間進行控制、從而使它們達 到預定的時間時，RNA的收率顯著提高。更具體地說，如圖ll所示， 可以發現當使被注入的洗滌液停留50秒或更長時，可以顯著提高 RNA的收率，並且當時是使洗滌液與RNA —起停留。如圖12所示， 可以發現當使被注入的回收液停留20秒或更長時，可以顯著提高 RNA的收率，並且當時是使回收液與RNA—起停留。
工業適用性
根據本發明，在通過用核酸吸附性多孔膜吸附含核酸的樣品溶 液中的核酸、然後通過洗滌等使核酸解吸附的核酸分離純化方法中， 可以以緊湊和廉價的方式來制定核酸提取方法並構造核酸提取裝置，
用該方法和該裝置來處理含核酸的樣品溶液具有以下優點高效、簡
便、快速、優異的自動化適應性和良好的重複性。
本申請要求的外國優先權所對應的各外國專利申請的全部公開 內容都以引用方式併入本文，如同其全部內容在此描述一樣。
權利要求
1. 一種提取核酸的方法，該方法包括通過使含核酸的樣品溶液與核酸吸附性固體載體接觸，從而將核酸吸附到所述的核酸吸附性固體載體上；在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固體載體上時，通過使洗滌液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而對所述的核酸吸附性固體載體進行洗滌；以及通過將回收液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而使所述核酸從所述的核酸吸附性固體載體上解吸附；其中，在所述洗滌液的分注及允許停留的時間以及所述回收液的分注及允許停留的時間這二者中，至少有一個所述時間被控制為預定時間。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中將所述洗滌液的允許停留時間控制為50秒到1,000秒。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中將所述洗滌液的允許停留時間控制為100秒到300秒。
4. 根據權利要求1到3中的任意一項所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時間控制為20秒到300秒。
5. 根據權利要求1到3中的任意一項所述的方法， 其中將所述回收液的允許停留時間控制為25秒到60秒。
6. 根據權利要求1到5中的任意一項所述的方法， 其中所述的核酸吸附性固體載體是通過基本不涉及離子鍵的相互作用來吸附核酸的核酸吸附性固體載體。
7. 根據權利要求1到6中的任意一項所述的方法，其中用於製備含核酸的樣品溶液的方法包括將含有選自離液鹽、表面活性劑、消泡劑、蛋白酶和核酸穩定劑 中的化合物的預處理溶液與試驗樣品混合，從而得到混合後的溶液；以及向所述的混合溶液中加入水溶性有機溶劑。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的核酸穩定劑為巰基化合物。
9. 根據權利要求7或8所述的方法， 其中所述的離液鹽為胍鹽。
10. 根據權利要求7到9中的任意一項所述的方法， 其中所述的水溶性有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一種。
11. 根據權利要求1到10中的任意一項所述的方法， 其中所述的核酸吸附性固體載體被容納於核酸提取柱的、具有至少兩個開口的容器的內部；以及 其中所述方法包括在將所述的含核酸的樣品溶液分注到所述的核酸提取柱中之後， 通過壓力差使所述的樣品溶液中的所述核酸吸附到所述的核酸吸附 性固體載體上；在將所述的洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之後，通過壓力差 除去雜質；以及在將所述的回收液分注到所述的核酸提取柱中之後，通過壓力差 使吸附到所述的核酸吸附性固體載體上的所述核酸從該核酸吸附性 固體載體上分離出來，從而與所述回收液一起回收所述核酸。
12. —種用於實施根據權利要求11的所述方法的核酸提取裝置， 其中所述的核酸吸附性固體載體為過濾材料。
13. 根據權利要求12所述的核酸提取裝置， 其中所述的核酸提取裝置通過加壓自動地實施提取操作；以及 其中所述的提取操作包括在將含核酸的樣品溶液分注到核酸提取柱中之後，使所述的樣品溶液中的所述核酸吸附到所述的過濾材料上；在將洗滌液分注到所述的核酸提取柱中之後，除去雜質；以及在將回收液分注到所述的核酸提取柱中之後，使吸附到所述的過 濾材料上的所述核酸從該過濾材料上分離出來，從而與所述回收液一 起回收所述核酸。
14. 根據權利要求12或13所述的核酸提取裝置，該裝置包括壓縮空氣供給機構，其通過加壓嘴將壓縮空氣引入到所述的核酸提取柱中；以及分注機構，該機構包括第一分注嘴，用於將洗滌液分注到所述的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用於將回收液分注到所述的核酸 提取柱中。
15. 根據權利要求12到14中的任意一項所述的核酸提取裝置， 該裝置包括保持機構，用於保持多個經排布的核酸提取柱和多個經排布的回 收容器，所述回收容器用於接收所述的含核酸的回收液；壓縮空氣供給機構，用於將壓縮空氣由單個加壓嘴引入到所述的 多個經排布的核酸提取柱中；分注機構，該機構包括第一分注嘴，用於將洗漆液分注到所述 的多個經排布的核酸提取柱中；以及第二分注嘴，用於將回收液分注 到所述的多個經排布的核酸提取柱中；以及移動裝置，用於使所述的壓縮空氣供給機構的所述的單個加壓嘴 和所述的保持機構這兩者之一相對於另一者進行相對移動。
16. 根據權利要求12到15中的任意一項所述的核酸提取裝置， 其中，所述的多個經排布的核酸提取柱被支承在固定側；以及 其中，所述的壓縮空氣供給機構的所述的單個加壓嘴以在所述的多個經排布的核酸提取柱的排布方向上可移動的方式受到支承。
17. 根據權利要求12到16中的任意一項所述的核酸提取裝置， 其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴中的至少一者與所述的單個加壓嘴被設置成一體化的可移動件。
18. 根據權利要求12到17中的任意一項所述的核酸提取裝置， 其中，所述的壓縮空氣供給機構的所述的單個加壓嘴被支承在固定側；以及其中，所述的多個經排布的核酸提取柱以在該多個經排布的核酸 提取柱的排布方向上可移動的方式受到支承。
19. 根據權利要求12到18中的任意一項所述的核酸提取裝置， 其中，以相同的排布間距來設置所述的多個核酸提取柱；以及 其中，所述的第一分注嘴和所述的第二分注嘴分別與所述的單個加壓嘴的排布距離均為所述的多個核酸提取柱的所述的相同的排布 間距的整數倍。
全文摘要
一種提取核酸的方法，該方法包括通過將含核酸的樣品溶液與核酸吸附性固體載體接觸，從而使核酸被吸附到所述的核酸吸附性固體載體上；在所述核酸吸附在所述的核酸吸附性固體載體上時，通過將洗滌液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而洗滌該核酸吸附性固體載體；通過將回收液與所述的核酸吸附性固體載體接觸，從而使所述核酸從所述的核酸吸附性固體載體上解吸附，其中在所述洗滌液的分注及允許停留的時間以及所述回收液的分注及允許停留的時間這二者中，至少有一個時間被控制為預定時間。
文檔編號C12M1/00GK101389757SQ200580016159
公開日2009年3月18日 申請日期2005年5月17日 優先權日2004年5月18日
發明者森壽弘 申請人:富士膠片株式會社