細胞跨膜電位的激活和監測的製作方法

2023-07-26 20:53:11 2

專利名稱：細胞跨膜電位的激活和監測的製作方法
技術領域：
本發明涉及可用於監測和操縱細胞跨膜電壓的組合物和方法。具體地，公開了納 米顆粒和它們在監測和操縱跨膜電壓中的應用。
背景技術：
細胞具有磷脂膜，該磷脂膜用作雙分子屏障，將細胞內含物與胞外環境隔開。通過 調節物質穿過膜的通道(作為細胞內信號傳遞的功能)，磷脂膜維持細胞區室和胞外環境之 間必要的組成差異。正常的不可透過的磷脂膜具有靜息膜電位，其源自帶正電荷和帶負電 荷的離子在細胞外和細胞內區室中的不等分布。通過響應於激活刺激來改變膜對某種離子 的滲透性，從而允許離子沿著它們的電化學梯度向下流動，可以改變膜電位。參見，例如， 2006年3月8日提交的共同擁有的和共同未決的美國申請系列號11/371,465。細胞通過 膜電位的變化而彼此通訊。因此，監測細胞膜電位和它的變化允許監測細胞存活、細胞通訊 (例如，特定神經元、肌肉和其它可興奮細胞)和細胞功能以及分化。離子通道是在可興奮的和不可興奮的細胞的磷脂膜中存在的跨膜蛋白。離子通道 允許並調節離子跨正常離子非透性的脂雙層的沿著它們的電化學梯度向下運動和傳導。離 子通道激活的不同狀態會為更有效的藥物發現提供獨特的機會，實現狀態依賴性的分子的 開發，例如，所述分子僅結合非傳導的(未激活的)通道或在重複使用後其行為和結構發生 變化的通道。希望的目的之一是，將藥物靶向表現出異常電活動性的組織，同時保持活動組 織中的正常通道不受影響。離子通道作為藥物靶標和在離子通道安全藥理學中是特別重要的。離子通道參與 許多重要的功能，且由生化調節的變化、表達水平或結構突變造成的離子通道功能障礙可 以不利地影響活生物體的健康。在人類中，遺傳的或誘導的離子通道功能的變化會導致健 康的嚴重併發症。異常的離子通道功能或離子通道表達已經與許多治療領域相關聯，包括 心律失常、高血壓、癲癇、疼痛、囊性纖維化和偶發性共濟失調。存在對這些疾病的更有效的 離子通道調節劑藥物的持續需要。在離子通道研究中使用了許多實驗方案。例如，一種研究離子通道的方法是膜 片鉗方法(Neher,見H Nature (1976) 260(5554) :799-802; Hami 11, 0. P.等人， Pflugers Arch. (1981) 391 (2) :85-100)。儘管該技術允許對離子通道生理學做出某些詳 細的生物物理學表徵，但是通量非常低，且膜片鉗儀器的使用容易性對於大規模篩選(mass screening)而言通常不能令人滿意。膜片鉗儀器也不允許以生理學上有關的方式重複刺激 細胞來產生動作電位。離子通道高通量篩選(「HTS」)的需求包括與令人滿意的使用容易 性相組合的耐用(robust)儀器和高的信號-背景比。在歷史上，離子通道HTS與低信息容量等同，突出了對新穎、快速且容易的方法的需求，在所述方法中，可以收集關於不同細胞 類型中的膜電位變化的更有用的信息。可靠且耐用的離子通道HTS試驗在基於離子通道的藥物發現中是重要的。離子通 道是動態蛋白，因此需要「感知」它們的不同功能狀態的試驗。競爭結合試驗儘管成功地用 於其它靶標類別，卻經常無法鑑定調節特定離子通道狀態的配體。因此，基於細胞的功能試 驗對於離子通道靶標的HTS而言是優選的。用於離子通道篩選的一些HTS技術包括結合試驗、離子流試驗、螢光成像和電生 理學。HTS膜片鉗技術被廣泛用於研究穿過離子通道的電流。目前，全細胞膜片鉗用於在藥 物發現過程的晚期對選擇的先導分子進行三道篩選(tertiary screening)。但是，全細胞 膜片鉗不適合最初的高通量篩選。儘管非常有效，但是該技術是勞動密集的，因此，限於每 天少量數據點測量。該低通量已經迫使使用其它更低特異性的和更低靈敏度的技術進行離 子通道靶標的高通量篩選。理想地，耐用的HTS離子通道篩選方法具有高瞬時分辨力、高靈 敏度和高信息容量，導致低的「假陰性」和「假陽性」率。儘管有材料和方法可用於研究離 子通道，仍需要簡便、耐用和有用的新的材料和方法。

發明內容
在一個方面，提供了用於測定或監測跨膜電位的變化的方法，該方法包括提供至 少一個靶細胞；使所述靶標接觸至少一個激活平臺以形成處理過的靶標，其中所述激活平 臺包含至少一層固定化的納米晶體，所述納米晶體被至少一層粘附基質覆蓋；刺激處理過 的靶標；測定來自激活平臺的發射；以及將發射與跨膜電位的變化相關聯。本文提供的方 法可以使用這樣的激活平臺，其包含2層或更多層固定化的納米晶體。例如，激活平臺可以 包含約2至約15層固定化的納米晶體。在某些實施方案中，激活平臺可以包含約5至約10 層固定化的納米晶體。在另一個方面，提供了用於監測跨膜電位的方法。所述方法包括提供至少一個靶 細胞；用嵌入質膜中的納米晶體處理所述靶標，建立一個感知平臺以形成處理過的靶標，其 中下面的激活平臺包含至少一層固定化的納米晶體，所述納米晶體被至少一層粘附基質覆 蓋；刺激處理過的靶標；測定來自感知平臺的發射；以及將發射與跨膜電位的變化(或其缺 乏)相關聯。在另一個方面，提供了用於測定或監測跨膜電位的變化的方法，其包括提供至 少一個靶細胞；使所述靶標接觸至少一個激活平臺以形成處理過的靶標，其中所述激活平 臺包含至少一層固定化的納米晶體；刺激處理過的靶標；測定來自激活平臺的發射；以及 將發射與跨膜電位的變化相關聯。該刺激步驟可以包括光學刺激、電刺激、磁刺激、化學刺激、生物刺激、使靶標接觸 疑似能夠激活離子通道的藥物、使靶標接觸疑似能夠抑制離子通道的藥物或其組合。在某 些實施方案中，電刺激包括使用膜片鉗或施加外部電場。在一個實施方案中，化學刺激包括 使靶標接觸鉀鹽或鈉鹽。在某些實施方案中，生物刺激包括使靶標接觸光敏感的離子通道。該刺激步驟可以包括將靶標維持在第一膜電位電壓，去極化或超極化靶標至第 二膜電位電壓，然後使靶標恢復至第一膜電位電壓。在某些實施方案中，第二膜電位電壓比 第一膜電位電壓更正(more positive)。在一個實施方案中，第二膜電位電壓是正的，且第一膜電位電壓是負的。在某些實施方案中，第一膜電位電壓和第二膜電位電壓之一是約0 mV。在一個實施方案中，第一膜電位電壓是約-70 mV，且第二膜電位電壓是約+40 mV。細胞可以是真核細胞、原核細胞、細菌細胞、革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細 菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞、爬行動物細胞、卵母細胞、兩翼昆蟲細胞、斑馬魚細 胞、線蟲細胞、魚細胞、兩棲動物細胞或哺乳動物細胞。激活平臺的結構可以是膜、納米絲、圖案化的基質或網。典型地，納米晶體是量子點。在某些實施方案中，該刺激步驟包括在適合激活平臺吸收的波長或波長範圍照 射。刺激步驟可以包括雷射照射、水銀燈照射、氙燈照射、滷素燈照射或LED照射。使用光學檢測可以進行測定發射。光學檢測包括使用照相機、數位照相機、視頻攝 像機、CCD照相機、安裝在螢光顯微鏡上的數位照相機、光電倍增管、螢光計、光度計、顯微鏡 或人眼。測定步驟可以包括在單個時間點、在多個時間點測定或檢測，或者連續檢測。在另一個方面，提供了用於激活細胞的方法。本文另外提供了集成的光學試驗，其 組合了光學刺激(通過激活平臺)和細胞活性的光學記錄。某些方法使用離子敏感的染料 檢測細胞活性。可以採用光學記錄細胞活性的任何合適的方法。因而，本文提供的方法可 以另外包括在測定跨膜電位的變化的同時或協同地光學記錄細胞活性。在一個方面，提供了光控激活平臺，其包含一種或多種類型的納米材料(例如，半 導體納米晶體)。在某些實施方案中，納米材料能夠起到光學電壓傳感器的作用。在其它實 施方案中，納米材料能夠激活細胞膜電位的變化。在某些實施方案中，納米材料包含納米晶 體(例如，半導體納米晶體)。在另一個方面，提供了用於監測和操縱細胞跨膜電位的組合物，其包含基質和激 活平臺，其中所述激活平臺被安置在基質表面上，其中所述激活平臺包含一層或多層固定 化的納米晶體。在某些方面，激活平臺包含2種或更多種類型的納米晶體，其中所述2種或 更多種類型具有不同的光學性質。納米晶體可以是半導體納米晶體。每個納米晶體可以包 含半導體核心。所述半導體核心可以另外包含在核心上的塗層。所述塗層可以包含親水化 合物。各納米晶體可以另外包含在核心和塗層之間的半導體殼，諸如帶正電荷的化合物或 帶負電荷的化合物。納米晶體可以包含表面塗層，其中所述塗層包含這樣的材料，其具有一 個或多個巰基、磺酸酯基和羧酸酯基。所述塗層可以包含1-硫甘油、巰基乙酸、2-巰基乙基 磺酸酯、聚(丙烯酸)或其衍生物、硫辛酸、二氫硫辛酸、聚乙醯亞胺、半胱胺、聚烯丙胺、組 氨酸、聚組氨酸、賴氨酸或聚賴氨酸。激活平臺可以另外包含粘附基質，且所述粘附基質可 以包含聚-L-賴氨酸、纖連蛋白、膠原、彈性蛋白、透明質酸、層粘連蛋白、基質膠、凝集素、 細胞膜蛋白的抗體或RGD肽和它們的子代(progeny)。所述一層或多層納米晶體可以另外 包含聚合物，諸如瓊脂糖、聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯醯胺。激活平臺可以包含2層或更多 層固定化的納米晶體(例如，約2至約15層或約5至約10層)。所述組合物可以另外包 含一層或多層有機材料，諸如聚合物(例如，合成的聚合物)。所述聚合物可以是PDDA。在 某些實施方案中，所述納米晶體是水可分散的。在還另一個方面，提供了製備激活平臺的方法，其包括提供基質；將一層或多 層納米晶體施加於所述基質的表面上；以及將細胞粘附層施加於所述一層或多層納米晶 體上。通過包括旋轉鑄模(spin casting)、滴落鑄模(drop casting)、滾動塗布(rollcoating)、根據需要滴落噴墨列印(drop on demand inkjet printing)、PDMS (聚二甲基矽 氧烷)衝壓列印(stamp printing)、靜電逐層裝配在內的任意方法，可以將所述一層或多 層納米晶體施加於基質的表面上。在另一個方面，提供了用於監測和操縱細胞跨膜電位的試劑盒，其包含基質和激 活平臺，其中所述激活平臺被安置在所述基質的表面上，其中所述激活平臺包含一層或多 層納米晶體。包含在試劑盒中的基質可以是玻璃蓋玻片、容器、多孔板、陶瓷微球或碳納米 纖維。本文提供的基於半導體納米晶體的材料會提供優於傳統有機電壓敏感的染料的 許多優點，因為這些納米晶體具有大斯託克斯位移、高量子產率、耐光性和多路傳輸能力。 這些性質使得這些材料特別適用於高通量藥物發現篩選應用。基於納米晶體的激活平臺能 夠在可興奮細胞中產生光觸發的動作電位，且在用光脈衝照射後可以重複觸發細胞激活。 所述激活平臺能夠遞送與光學詢問方法相容的生理學上有關的激活刺激。本文所述的激活 平臺會提供非侵入性的詢問細胞的方案，且可以在對細胞形態學、分化和生理學應答沒有 任何不良作用的情況下，用於基於細胞的試驗和組織切片。因而，這些平臺與用於動力學試 驗的短期細胞培養物相容。本文所述的激活平臺的另一用途是在研究突觸生理學的混合培 養物中。通過光學地刺激突觸前細胞，可以監測所引起的它們的突觸後配偶體的變化。在 離子通道的大多數藥物研究中的一個重要遺漏是，這些研究是在沒有正常的突觸引起的活 動的情況下進行的，儘管在正常腦中的所有離子通道依賴於此。本文提供了允許實際的突 觸行為的方法，其中可以光學地控制和監測突觸場(field)，而不需要用電極穿透單獨的神 經元對。這些方法可以放大到細胞場或網絡，其迄今為止使用傳統方案尚未在實踐中是可 行的。另外，可以刺激和監測亞細胞域，包括dendritic abhor，其獨立於神經元體細胞激 活。本文所述的感知和激活平臺也可以用於原位、全腦用途，且具有治療去除神經支配的組 織的治療潛力。例如，通過光脈衝可以活化原位遞送的激活顆粒，以恢復或控制CNS或PNS 或心臟或肌肉組織中的神經元激活。本文所述的材料和方法也可以用於體內，以在體內和 原位神經生理學模型(包括小鼠、大鼠、兔子、貓、猴、狗、豬)中研究和更好地理解突觸活動 和神經元生理學，並最終用於人類在臨床中驗證和證實的用途。


下面的附圖構成本說明書的一部分，且被包括在內以進一步說明本發明的某些方 面。參考這些附圖中的一幅或多幅，並結合本文提供的特定實施方案的詳細描述，可以更好 地理解本發明。圖1的簡圖描繪了與半導無限固體的能量帶隙相比的半導納米晶體能量帶隙(Eg) 和分子的電子能量水平。圖2的簡圖顯示了由於半導體納米晶體的尺寸依賴性的能量帶隙，半導體納米晶 體的尺寸和它們的發射波長之間的關係。圖3的圖顯示了尺寸不同的量子點納米晶體綴合物的光學性質QD0T 525 (1)、 QDOT 565 (2),QDOT 585 (3),QDOT 605 (4),QDOT 625 (5),QDOT 655 (6),QDOT 705 (7)、 QDOT 800 (8)。量子點材料在紫光激發後表現出寬帶吸收(實線)，並表現出在寬波長範圍 的發射。量子點材料的尺寸決定了它的發射光譜(虛線)。
圖4顯示了具有約5 nm(A)的橫斷面直徑的單個Cdk量子點和尺寸均勻的量子 點的集合(B)的晶體結構。圖5是顯示量子點納米晶體的相對尺寸的圖。圖6顯示了提出的在沒有(A)和有(B)電場存在下基於量子點納米晶體的電壓傳 感器的作用機理。圖7顯示了在細胞去極化之前㈧和之後(B)，含有基於量子點納米晶體的電壓傳 感器的磷脂細胞膜。圖8顯示了使用基於量子點納米晶體的電壓傳感器對CHO細胞㈧、NG108細胞 (B)和神經元網絡(C)進行特異性的膜標記的螢光圖像。圖9是用基於量子點的電壓傳感器標記的CHO細胞的螢光圖像，顯示了靜息發射 強度。圖10的圖顯示了誘導的膜去極化(施加100 mM KCl)在多個CHO細胞中引起的 一類基於量子點納米晶體的電壓傳感器隨時間的螢光強度(RFU)變化。圖11的條線圖顯示了兩類(標記的X和Y)基於納米晶體的電壓傳感器的平均熒 光變化。圖12顯示了在用千兆封口膜片電極電刺激之前用基於量子點的電壓傳感器標記 的在圖9中顯示的相同的CHO細胞。圖13A的圖顯示了以全細胞模式使用膜片鉗方法電生理刺激細胞引起的圖12所 示的CHO細胞的螢光強度變化。X-軸的參照時間標尺條(內置)顯示了 1秒的持續時間。 圖1 是表示沿著與圖13A相同的時間標尺相對應的電壓刺激方案的跡線。圖14顯示了提出的基於量子點納米晶體的電壓傳感器的作用機理，其在光照射 後釋放電子。圖15是基於量子點納米晶體的激活蓋玻片的示意圖，顯示了納米材料和活細胞 之間的界面。圖15A是安置在蓋玻片上的激活平臺的展開圖。圖16是在基於量子點納米晶體的激活蓋玻片上培養的海馬神經元的明視野圖 像，所述蓋玻片上連接了刺激千兆封口膜片電極(patch pipette)。圖17是實驗膜片鉗方案的示意圖。圖18顯示了用光重複觸發後膜電位和動作電位隨時間的變化。圖19顯示了使用交替的電和光學激發時膜電位隨時間的變化。圖20顯示了在激活光脈衝(380 nm)之前(A)和之後(B)負載螢光鈣指示劑的 NG108細胞的螢光圖像。圖21的圖顯示了在380 nm激活光脈衝(用箭頭指示)之後Fluo_4鈣指示劑隨 時間的螢光強度。該圖反映了光觸發的動作電位引起的細胞內鈣濃度的變化。圖22顯示了在激活光脈衝(380 nm)之前(A)和之後(B)負載Fluo_4鈣指示劑 的海馬神經元的寬視野螢光圖像。圖23顯示了光觸發的神經元網絡激活引起的氟-4鈣指示劑的螢光強度相對於時 間的圖。該圖解釋了神經元網絡的光觸發激活引起的幾個神經元中細胞內鈣濃度的變化。
具體實施例方式除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技 術人員通常理解的相同的含義。在本文中引用的所有專利、申請、公開的申請和其它出版物 都通過引用整體併入。如果在本部分中闡述的定義與在本文中通過引用併入的專利、申請、 公開的申請和其它出版物中闡述的定義相反或另有不一致，在本部分中闡述的定義優先於 通過引用併入本文的定義。本文使用的「一個」或「一種」是指「至少一個(種)」或「一個(種)或多個(種)」。本文使用的術語「約」當用於描述數值時，應當包括最多到該數值士 15%的範圍， 除非上下文另外清楚地指示。儘管以「包含」(解釋為是指「包括，但不限於」)不同組分或步驟的方式描述了組 合物和方法，所述組合物和方法也可以「基本上由」或「由」所述不同組分或步驟「組成」，這 樣的術語應當解釋為界定基本上封閉的成員組。儘管生物學上有關的分子在活細胞內的定位的顯示是重要的，但是對於健康和疾 病中的細胞體內穩態的更好理解的需求，決定了建立允許追蹤細胞間和細胞內信號傳遞途 徑的活動(具有空間和時間保真度)的新材料(例如，螢光探針)和方法的必要性。每個細 胞具有靜息膜電位，其源自跨磷脂雙層的電荷的分離。膜電位的變化被轉換成對不同類型 的細胞蛋白的細胞應答，包括電壓-門控的離子通道、電壓-依賴性的磷酸酶和GPCR。它們 控制著大量細胞過程，包括但不限於自主神經系統、腸神經系統、外周神經系統和中樞神經 系統的發育、分化、功能，心搏，血壓，感覺功能，腦功能，肌肉收縮，突觸傳遞，細胞增殖和激 素分泌。感知、報告和產生膜電位的變化的能力，對於理解跨膜信號傳遞和突觸活動是至 關重要的。儘管電生理方法是監測細胞電活動性的黃金標準(歸因於它們的高信息容量)， 但是光學方法具有幾個優於電生理方法的優點。具體地，光學方法會提供非侵入的優勢，允 許一次從多個細胞進行記錄，且可以用於研究廣範圍的細胞類型，包括在組織切片或完整 器官中的細胞。本文提供了用於進行感知和刺激細胞跨膜電位變化的試驗的材料、方法和試劑 盒。在某些方面，提供了非侵入地操縱細胞(例如，神經元)的膜電位的光學方法。公開的 方法可以用於以時間上精確的且空間上分辨的方式控制細胞的功能性活動。具體地，提供 了用於細胞的光學電壓感知和光控制電激活的材料和方法。所述的材料和方法可用於監測 細胞膜電位的動態變化以及通過改變細胞膜電位操縱細胞功能。具體方法使用光控外部激 活平臺。該激活平臺為細胞激活提供生物相容的界面。當將激活平臺放置在細胞附近並用 可見光照射時，通過激活平臺的激發產生累積的電磁場。該電磁場調節細胞膜電位，並通過 光的開和關來簡單控制而不會干擾目標細胞。對於研究某些細胞類型(例如，幹細胞)而言， 該非侵入性的方案是特別合乎需要的。另外，光控激活平臺允許通過觸發生理學上有關的 激活(經由光學誘導的電場)來重複刺激細胞數秒、數分鐘、數小時、甚至數天。本文提供了非侵入地誘導細胞和組織中的離子通道激活(例如，誘導細胞產生動 作電位)的方法。當評價靶向離子通道的新的潛在藥物時，或當評價可以改變離子通道功 能(作為副作用)的新藥物時，誘導細胞產生動作電位是必需的。另外，光控激活平臺允許通 過觸發生理學上有關的激活(經由電場)重複刺激細胞。
激活平臺包括一種或多種類型的材料，它們可以在用光照射後誘導局部電場的變 化。激活平臺的照射可以使構成平臺的材料產生電流。產生的電流又可以觸發鄰近激活平 臺或在其附近的細胞的膜中的電壓變化。在某些實施方案中，本文提供的激活平臺利用某 些類型的納米材料(例如，量子點)的光電子性質。本文所述的基於激活平臺的試驗的潛在用途包括電壓-敏感的膜蛋白的功能研 究；離解的細胞培養物或組織切片中的細胞之間的通訊的研究，包括突觸可塑性；心臟病 學研究；激活-刺激的細胞擴增和幹細胞分化。所述技術的其它潛在用途包括激活突觸功 能，和在全腦中治療抑鬱症、退化和削弱或改變腦功能的其它病症，以及包含目前在電刺激 控制下(例如，肌肉功能障礙，諸如肌營養不良症，或在心臟起搏器中)的組織刺激的其它 用途。在一個方面，提供了測定或監測跨膜電位的變化的方法，其包括提供至少一個靶 細胞；使所述靶標接觸至少一種納米結構(例如，激活平臺)，其中所述納米結構包含至少 一層固定化的納米晶體，所述納米晶體完全或部分地被粘附基質覆蓋；刺激處理過的靶標； 測定來自納米結構的發射，以及將發射與跨膜電位的變化相關聯。某些方法利用定位在靶 細胞質膜中的光發射性納米晶體來測定發射。本文所述的納米結構通常具有至少一個在納 米尺寸量級的尺寸。例如，納米結構可以由一層或多層納米晶體形成，其中所述納米結構的 厚度是約5-100 nm。一個任選的額外的步驟可以包括，在接觸步驟之後，但是在刺激步驟之前，測定來 自納米結構的發射。該額外步驟可以作為「對照」或「空白」測量。由於它們獨特的物理和光化學性質，半導體納米晶體(例如，Qdot納米晶體，購自 Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA)為具有空前能力和簡單性的基於多路熒 光的檢測提供平臺。Qdot納米晶體被用於亮度高的、耐光的且多色的細胞和組織成像、流式 細胞術、蛋白印跡、單分子檢測、體內成像以及其它。本文所述的方法利用量子點的獨特物 理和光化學性質的優勢，並將它們的用途擴展到超出它們的公認的「燈泡」用途。在一個具體的實施方案中，將多層納米晶體放置在固體支持物(諸如蓋玻片)上， 並放置單層粘附基質(例如，蛋白或基於有機化學品的粘合劑)，其覆蓋所述納米晶體。然 後使細胞接觸覆蓋納米晶體的粘附基質或放置在粘附基質上適當的時間以進行附著。在某 些實施方案中，細胞可以附著和/或生長在蓋玻片上1天、2天、3天或5天或更久。在某些 實施方案中，納米結構包含至少一層納米顆粒(例如，納米晶體)，其被至少一層粘附基質覆 蓋，形成激活平臺。可以採用任何合適的粘附基質。粘附基質優選地是對活細胞無毒的。在一個實施 方案中，粘附基質是聚-L-賴氨酸。其它附著或粘附基質包括允許細胞結合基質的那些基 質，其引起或誘導或者不引起或不誘導形態學變化、分化、細胞增殖、細胞凋亡、停滯或其它 生理學變化。這樣的基質包括但不限於纖連蛋白、膠原I和IV或其它膠原、彈性蛋白、透明 質酸、層粘連蛋白、基質膠、凝集素、細胞膜蛋白的抗體、RGD肽和它們的子代(progeny)等。 或者，粘附基質可以包括氟化的材料，諸如磺化的基於四氟乙烯的氟聚合物-共聚物(可
NAFION^g Ε. I. du Pont de Nemours and Company ；Wilmington, DE) 。 可以通過任意機理附著。在某些實施方案中，僅單層粘附材料用於覆蓋納米晶體層。可以 採用額外層，其不幹擾從納米晶體向附著的細胞的能量轉移。
該接觸步驟可以包括使細胞接觸粘附基質層任何合適量的時間。在某些實施方案 中，可以在接觸步驟過程中刺激細胞。在某些實施方案中，可以將刺激因子、細胞凋亡因子、 小分子、抗體等加入已放置的激活層和/或包被附著的細胞的介質，以影響信號傳遞環境 和評估在特定環境刺激下膜電位的變化的影響。刺激方法的其它實例包括電刺激、磁刺激、 化學刺激、生物刺激或其組合。電刺激的實例包括使用膜片鉗和施加外部電場。化學刺激 的實例包括使靶標接觸鉀鹽或鈉鹽，或接觸不同類型的膜內成孔分子。生物刺激的實例包 括用光敏感的離子通道激活靶標，或使靶標接觸化學實體，後者起離子通道活動的調節劑 的作用。磁刺激的實例包括用適當頻率和振幅的交替電磁場激活靶標。通過多種方法可以電刺激靶標。通常基於目標離子通道的激活動力學選擇一種 刺激方案(刺激的電壓振幅和持續時間)。例如，可以使靶標維持在第一膜電位電壓，在第 二膜電位電壓使靶標處於去極化脈衝，然後恢復至第一膜電位電壓。第二膜電位電壓通常 比第一膜電位電壓正，但是第一膜電位電壓可能比第二膜電位電壓正。例如，第一膜電位 電壓可以是負的，而第二膜電位電壓可以是正的。一個實例是，第一膜電位電壓是-70 mV, 而第二膜電位電壓是+40 mV。或者，第一或第二膜電位電壓可以是0 mV。實例包括第一膜 電位電壓是-200 mV，第二膜電位電壓是0 mV。另一個實例是第一膜電位電壓是0 mV，第 二膜電位電壓是200 mV。第一膜電位電壓和第二膜電位電壓的具體實例可以獨立地選自 約-200 mV、約-180 mV、約-160 mV、約-140 mV、約-120 mV、約-100 mV、約-80 mV、約-60 mV、約-40 mV、約-20 mV、約 0 mV、約 20 mV、約 40 mV、約 60 mV、約 80 mV、約 100 mV、約 120 mV、約140 mV、約160 mV、約180 mV、約200 mV和這些值中的任意2個之間的範圍。或者，在所述方法中可以使用更複雜的電壓模式。所述方法可以另外包括使靶標 暴露於至少一個跨步電壓(st印voltage)，然後在第二膜電位電壓使它們處於去極化脈 衝。該跨步電壓是第一膜電位電壓和第二膜電位電壓之間的中間電壓。跨步電壓可以用於 測量漏減(leak subtraction)。例如，可以使用-80 mV的第一膜電位電壓、-50 mV的跨步 電壓和20 mV的第二膜電位電壓。去極化脈衝通常可以施加任意的時間長度。例如，去極化脈衝可以施加高達約 5，000秒。時間長度的實例包括約10微秒、約1毫秒、約10毫秒、約100毫秒、約1秒、約2 秒、約3秒、約4秒、約5秒、約10秒、約20秒、約30秒、約40秒、約50秒、約60秒、約70 秒、約80秒、約90秒、約100秒、約500秒、約1，000秒、約2，000秒、約3，000秒、約4，000 秒、約5，000秒和這些值中的任意2個之間的範圍。靶標可以是一個或多個合適的完整細胞，其具有膜和膜電位。可以採用任何合適 的細胞，包括但不限於細菌(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性)細胞、真核細胞、原核細胞、真 菌細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞、爬行動物細胞、卵母細胞、兩翼昆蟲細胞、斑馬魚細胞、線蟲細 胞、魚細胞、兩棲動物細胞或哺乳動物細胞。主要的哺乳動物細胞的實例包括人、小鼠、大 鼠、狗、貓、熊、麋鹿、牛、馬、豬或中國倉鼠卵巢(「CH0」)細胞。細胞類型的其它實例包括免 疫系統細胞(例如，B-細胞、T-細胞)、卵母細胞、紅細胞、白細胞、神經元細胞、上皮細胞、 神經膠質細胞、成纖維細胞、癌細胞和永生化的細胞。納米結構可以採取不同的構造。例如，納米結構可以是納米顆粒(例如，納米晶 體)、納米絲、膜、圖案化的基質和網的形式。一種示例性的納米結構是用半導體材料(例 如，CdSe)形成的納米絲，其可以誘導或報告電位的變化。例如，可以貫穿或緊挨細胞膜、細胞場或突觸神經氈或肌肉細胞或其它可興奮細胞而插入納米絲。納米絲可以以類似於標準 的電刺激電極(諸如起搏器電極)的方式起作用。納米絲引起細胞的膜電位的變化，該變化 在周圍組織中觸發場電位和動作電位。在某些實施方案中，納米結構是由一層或多層支持材料(例如，納米晶體)形成 的激活平臺。在其它實施方案中，納米結構包含激活顆粒(例如，球狀體)，其可以放置到 可興奮組織深處，並與激發光接近。建立包含被至少一層粘附基質覆蓋的納米顆粒層(例 如，納米晶體)的納米結構或激活平臺的方法包括將納米晶體層固定化在支持結構上(例 如，在微孔板的孔的底部上)，覆蓋至少一層粘附基質，並隨後向實驗小室(experimental chamber)(諸如微孔板孔)中加入含有細胞的溶液。在激活平臺的構建中，可以採用納米 顆粒(例如，納米晶體)的任意組合。可以採用單一類型的納米顆粒，或可以採用在目標性 質方面存在差異的納米顆粒的混合物。納米顆粒通常可以是任何合適的半導體納米晶體或量子點。量子點是納米級無機 晶體，其含有幾百-幾千個半導體材料的原子。它們的行為受到量子物理學規則的控制。量 子點不完全是一個分子，儘管它們具有離散電子能量水平，也不是一塊半導體，儘管它們表 現出自旋軌耦合併且具有較大的介電常數。小的半導納米晶體的行為更象分子，並因此具 有較高的帶隙能，而大的半導納米晶體的行為更象無限固體，並因此具有較低的帶隙能。圖 1描繪了半導體納米晶體、分子和半導無限固體的電子性質之間的差異。隨著結構的物理尺寸減小，量子效應逐漸變得重要。三維空間中光產生的激子的 量子限制決定了量子點的光物理性質，諸如納米晶體的有效帶隙，並由此決定了螢光的波 長。量子點發螢光不同於傳統螢光團。具有高於帶隙的能量的任意光子的吸收造成激子 或庫侖-相關的電子空穴對的形成。該寬帶吸收波譜是指，量子點吸收在每個波長至它們 發射的藍色的光，且通過在單個波長至最藍發射的藍色激發不同尺寸的量子點，可以得到 許多顏色。電子和空穴保持分離數十至數百納秒，然後放射地重組，引起光子的發射。圖2 顯示了一系列瓶子200，其中每個瓶子裝有不同尺寸的量子點群，並證實量子點發射特定波 長(例如，525 nm至655 nm)的光，所述波長取決於量子點的尺寸。參考圖2，用光204照 射更小尺寸的量子點202，引起更短波長(例如，525 nm)的光206的發射，而更大尺寸的量 子點208發射更長的波長(例如，655 nm)。在用具有例如約400-475 nm的波長的光激發 後，量子點材料可以表現出寬帶吸收，且可以發射跨寬範圍波長的光(圖幻。參考圖3，在 約430-450 nm(用箭頭302指示)的不同尺寸的量子點的激發引起發射約500-約900 nm 波長的光，其取決於量子點的尺寸。此外，量子點的發射波譜非常狹窄且對稱。量子點由數百至數千個重複原子組成，每個原子均作用於納米晶體吸收光的能 力。結果，量子點具有特別高的消光(IO6 - IO7 M-1CnT1),遠大於任何有機染料。此外，最佳 地合成的量子點具有接近100%理論最高限的量子產率。突出的吸收性質與大的量子產率 的這種組合產生了亮度和靈敏度高於有機螢光團超過一千倍的材料，經常引起用於生物學 用途的工作濃度的急劇降低和檢測罕見事件的急劇增強的能力。另外，量子點的高耐光性 允許在會造成其它類型螢光團的光誘導性衰退的條件下進行長期成像實驗。由於量子點突 出的耐光性、亮度、寬激發、窄發射、長螢光壽命和多路能力，它們正在改變生命科學成像。量子點是高度工程化的材料，其通常含有幾個結構不同的元件。半導體納米晶體 通常具有半導體核心、殼和任選的一次或多次表面處理。示例性的納米晶體包括但不限於在美國專利號 5，505，928,5, 990，479,6, 114，038、6，207，229、6，207，392,6, 251，303、 6，319，426、6，444，143、6，274，323、6，306，610、6，322，901、6,326,144、6，423，551、 6，699，723,6, 426，513、6，500，622,6, 548，168,6, 576，291,6, 649，138,6, 815，064、 6，819，692,6, 821，337,6, 921，496,7, 138，098,7, 068，898,7, 079，241 和 7，108，915 中所述
的那些。納米晶體核心在很大程度上決定了它的關鍵的光吸收和發射特徵。已經廣泛研究 了納米晶體核心，且合成中的改進已經引起關鍵生理化學性質的優化，得到在光激發後具 有均勻的尺寸分布和強度、窄發射帶的納米晶體核心。但是，就大多數應用而言，單獨的納 米晶體核心缺少足夠強烈或穩定的發射強度。納米晶體核心對於它們的環境特別敏感；例 如，許多生物學應用所需的含水環境可以導致納米晶體核心發光性的完全破壞。因而，光穩 定化納米晶體核心(例如，保護它們的發光性質)和使它們在含水介質中穩定和有用的方 法對於生物學應用而言具有重大意義。通常，這可如下實現通過在核心上施加殼以形成所 謂的核心/殼納米晶體。包被納米晶體核心的能力已經成為許多研究的領域，且用無機殼包被納米晶體核 心以形成「核心/殼納米晶體」已經產生提高的發射強度、化學和光化學穩定性、降低的自 猝滅特徵、在多種環境中的穩定性等。用無機殼包被納米晶體核心對根本的發光能量的影 響尚未被很好的理解，且通常基於一小組標準(例如，如，塗層材料的選擇和殼的密度和厚 度)來控制。通常認為無機殼會鈍化核心納米晶體的最外面的表面，由此減少或消除與核心有 關的表面能量狀態，並使核心與外部環境絕緣。這可以減少或消除從核心到環境的激子的 非發光性損失，保持核心可以具有的有效螢光性質。通過用無機殼包被核心也可以減少光 化學降解，並可以提高發射效率和穩定性。儘管納米顆粒核心決定了它的顏色，但是納米顆粒殼決定了它的亮度、耐光性和 環境不敏感性。通常根據與核心絕緣的電子性質來選擇殼材料。通常使殼材料的選擇與核 心材料匹配。例如，殼材料通常可以具有比核心更寬的帶隙，這使它能夠保護核心所處的激 活態(當它已經被光激活時)，形成分離的電子和空穴。理想地可以將殼選擇為具有與核心 材料緊密匹配的原子間距和格柵結構，以最好地保持核心的光物理屬性，這是因為核心和 殼之間的界面的不規則性可能引起非發光的能量耗散機理，後者會降低發光效率。無機殼 在這些量子點核心上的適當放置產生複合的核心-殼結構，其具有顯著增強的化學和光物 理性質。最常見的量子點由Cdk組成，並表現出可以從、00 nm至飛50 nm變化的最大發 射波長(隨著納米晶體的尺寸從2-7 nm的變化)。圖4顯示了在不同細節水平的典型量子 點的晶體結構。為了用於大多數基於螢光的生物學應用，通常需要如下修飾赤裸的核心-殼納米 晶體通過把配體連接到殼的表面上來使其可分散於水中並對生物功能性修飾具有反應 性。得到的納米顆粒可以具有約10-20 nm的尺寸，類似於綠色螢光蛋白(GFP)(圖5)。完 整裝配的量子點對外部環境不敏感，且因此可以象用於大分子檢測的試劑一樣用於定量。半導體納米晶體核心和殼可以獨立地由下述元素的材料製成元素周期表第2或 12族的元素，和選自元素周期表第16族的元素或元素的組合。這樣的材料的實例包括 ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe > SrS > Srk、SrTe、BaS、Bak和BaTe。或者，半導體納米晶體核心和殼可以獨立地由下述元素的材料製成元素周期表第13族的元素和元素周期表第15族的元素。這樣的材料的實例包括 GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs和hSb。或者，半導體納米晶體核心和殼可以獨立地 由元素周期表第14族的元素製成的材料製成。這樣的材料的實例包括Ge和Si。或者，半 導體納米晶體核心和殼可以獨立地由諸如PbS或1 的先導材料製成。半導體納米晶體 核心和殼也可以由上面列出的任意材料的合金或混合物製成。該半導體納米晶體通常可以具有任意尺寸(平均直徑)，但是尺寸通常是約0. 1 nm至1，000 nm。更窄的尺寸範圍包括約0. 1 nm至約1 nm、約1 nm至約50 nm和約1 nm至 約20 nm。具體的尺寸實例包括約0. 1 nm、約0. 5 nm、約1 nm、約2 nm、約3 nm、約4 nm、約 5 nm、約 6 nm、約 7 nm、約 8 nm、約 9 nm、約 10 nm、約 11 nm、約 12 nm、約 13 nm、約 14 nm、 約 15 nm、約 16 nm、約 17 nm、約 18 nm、約 19 nm、約 20 nm、約 25 nm、約 30 nm、約 35 nm、約 40 nm、約45 nm、約50 nm和這些值中的任意2個之間的範圍。在某些實施方案中，已經發 現具有約1至約20 nm的平均直徑的半導體納米晶體是特別實用的。其它實施方案利用具 有約3至約10 nm的平均直徑的納米晶體。納米晶體的一種典型的單色製備物具有這樣的晶體，它們優選地具有基本上相同 的尺寸和形狀。通常認為納米晶體的形狀是球形或接近球形，但是實際上可以是任意形狀。 或者，納米晶體的形狀可以是非球形。例如，納米晶體的形狀可以向扁球形球狀體和杆變 化，以實現更紅的顏色。優選地，至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95% 和理想地約100%的顆粒具有相同的尺寸。可以將尺寸偏差測量為直徑的均方根(「rms」)， 小於約10%的均方根是優選的。尺寸偏差可以是小於約10% rms、小於約9% rms、小於約8% rms、小於約7% rms、小於約6% rms、小於約5% rms或這些值中的任意2個之間的範圍。這 樣的顆粒集合有時稱作「單分散」。眾所周知，通過改變納米晶體的尺寸和組成可以「調節」半導體納米晶體的顏色 (發射的光)。如上面討論的，納米晶體優選地吸收廣譜波長，並發射狹窄波長的光(參見 圖3)。激發和發射波長通常是不同的和不重疊的。在發射帶的半高全寬(FWHM)，發射寬度 優選地小於約50 nm，更優選地小於約20 nm。發射寬度(FWHM)的實例包括約50 nm、約40 nm、約30 nm、約20 nm和約10 nm。發射的光優選地具有對稱的發射波長。發射最大值通常 可以是從約200 nm至約2，000 nm的任意波長。發射最大值的實例包括約200 nm、約400 nm、約 600 nm、約 800 nm、約 1,000 nm、約 1,200 nm、約 1,400 nm、約 1,600 nm、約 1,800 nm、 約2，000 nm和這些值中的任意2個之間的範圍。納米晶體也可以具有金屬核心，且在有些情況下，具有周圍的殼結構。金屬核心可 以由貴金屬製成。這樣的金屬的實例包括銀、金和銅。任選地，所選擇的提供與分散介質具有相容性的有機的或其它的外塗層可以施加 於殼的部分或大部分表面上；該外塗層可用於使無機顆粒可溶於或容易地分散於選擇的介 質中，所述介質可以是水性的或有機的、親水的或疏水的。對於某些應用，納米晶體可以具 有添加不同功能性的表面塗層，它們。例如，可以將納米晶體衍生化來提高水溶解度或提供 用於連接生物分子的反應基團。例如，可以給納米晶體包被脂質、磷脂、脂肪酸、多聚核酸、 聚乙二醇、第一抗體、第二抗體、抗體片段、基於蛋白或核酸的適體、生物素、鏈黴抗生物素、 蛋白、肽、小有機分子、有機或無機染料、貴重的或貴金屬簇。或者，納米晶體可以由多種無機材料製成，包括矽、鋁、鋯、鈰、釔以及錫和鋅的氧化物。例如，矽納米顆粒具有複合的半導體納米晶體的多種有利特徵，諸如跨可見波譜的大 小可調的發光。另外，矽納米顆粒也具有低毒性、高生物相容性、有效且穩定的表面官能化 和潛在的低成本。在離子通道試驗中使用納米晶體具有多種期望的特徵。因為與現有的有機的、電 壓-感知的螢光團相比，納米顆粒具有快速響應時間和信號變化，所以它們對於表徵動作 電位和突觸活動而言是理想的。納米晶體也具有其它希望的性質，諸如低毒性、高光穩定 性、用於多路用途的能力和使用綴合的或以其它方式結合的材料靶向它們的能力。此外，不 同於隨著它們光漂白而可能產生有毒的反應物質(例如，單態氧)的有機螢光團，尚未顯示 納米晶體會產生任何這樣的有毒物質。由於它們的高光穩定性、快速的響應時間、大的信號 變化和低毒性，納米晶體是用於研究活細胞中的離子通道和神經元功能的理想材料。一般而言，使用任何合適的測量光的或積聚光的儀器可以監測納米晶體的波譜特 徵。這樣的儀器的實例是CCD (電荷耦合裝置)照相機、視頻裝置、CIT成像、安裝在螢光顯 微鏡上的數位照相機、光電倍增管、螢光計和光度計、不同配置的顯微鏡以及甚至人眼。可 以連續地或在一個或多個離散的時間點來監測發射。納米晶體的耐光性和靈敏度允許在延 長的時間段內記錄電位的變化。測定來自納米結構的發射的其它方法包括測量光強度、光極化、光吸收、發射顏 色、發射壽命或半衰期或「閃爍」模式的變化。本文描述了可用於監測細胞膜處或之中的變化和/或操縱細胞膜處或之中的電 位的不同材料。某些材料可以用作電壓傳感器(例如，作為螢光指示染料的替代物)。這樣 的材料能夠感知電位的變化，其中所述變化被檢測為材料的光學性質(例如，波長和/或強 度)的變化。其它材料能夠影響或調節細胞電位的變化。例如，在用光照射後，納米晶體變 成自由載荷子流通過膜的途徑，使電流穿過，並反過來影響跨膜電位。這樣，通過改變例如 入射光的強度和/或極化可以實現細胞上的電壓控制。本文提供了可以永久地或暫時地定位在細胞膜中/細胞膜處的材料。納米晶體保 留在細胞膜中或細胞膜處的能力可以隨核心、殼和/或塗層組成和/或構造以及顆粒形狀 的變化而變化。可以合成不同複雜度的形狀的納米顆粒，諸如球形、杆、盤、三角形、納米環 (nanoring)、納米殼、四腳體等。每個這樣的幾何形狀具有特有的性質表面電荷的空間分 布、入射光波的極化的朝向依賴性和電場的空間範圍。為了操縱自由載荷子濃度和流動性，可以向納米顆粒中摻雜雜質，諸如銦、磷、硼 和鋁等。納米顆粒和有機聚合物的混合物對於該應用而言可能是有利的，因為納米顆粒可 以高效地傳導電子，而聚合物可以更好地傳導空穴。用生色團將半導體納米顆粒官能化也 可以通過將光子吸收與自由載荷子運輸分開來優化該應用。特定傳感器可以保留在膜中/膜處的持續時間經常由用於處理顆粒表面的塗層 決定。代表性的塗層包括能夠結合質膜的肽，諸如短桿菌肽、蜂毒肽和阿拉黴素等抗微生物 肽和α螺旋兩親肽和成孔肽。使用本領域技術人員已知的方法，諸如將肽中的組氨酸殘基 偶聯到量子點的表面(其表面已經用咪唑處理過)上，可以將肽固定化到量子點上。某些實 施方案利用能滲透進細胞的細胞滲透性肽(CPP)。其它類型的塗層包括組氨酸、賴氨酸、硫 代甘油、兩性黴素和膽固醇。量子點的代表性塗層材料包括帶正電荷的聚合物，諸如聚乙醯亞胺(PEI)。PEI聚合物是親水的，且對金屬離子具有親和力，使得這類聚合物特別適用於 與量子點形成穩定絡合物。PEI聚合物可以用於在量子點上形成塗層，其可以賦予量子點水 分散性和水穩定性，而不損害量子效率。另外，PEI聚合物包括大量胺官能團，它們可以使 用例如雙功能的胺反應性化合物來交聯。適合相互作用或插入的條件可以包括多種方法。這些方法的實例包括經由內吞作 用的被動或主動攝取、電穿孔、脂質體介導的遞送、Pluronic嵌段共聚物介導的遞送、細胞 滲透性肽介導的攝取、蛋白介導的攝取、顯微注射、轉染、病毒遞送、optoporation、成孔基 質、膜嵌合劑或其組合。由於納米顆粒具有與細胞膜近似相同的厚度，插入膜中會將納米顆粒的極點 (pole)暴露於細胞外和細胞內空間。在用光照射後，納米顆粒變成自由載荷子流通過膜的 途徑，使電流穿過，並反過來影響跨膜電位。這樣，通過改變例如入射光的強度和/或極化 可以實現細胞上的電壓的控制。因此，光學控制靶標的跨膜電位的方法可以包括提供至少一個靶標，其中所述靶 標是細胞或細胞碎片；在適合納米結構與細胞或亞細胞膜相互作用或插入的條件下，使所 述靶標接觸至少一種納米結構，以製備處理過的靶標；向處理過的靶標遞送能量；以及檢 測靶標的應答。所述細胞可以是上述的任意細胞。所述納米結構可以是任意的納米結構，包括上 述的任意納米結構。本文提供的另一個實施方案涉及激活平臺用於控制和/或操縱細胞跨膜電位的 應用。暴露於光的納米顆粒(例如，納米晶體)可以作為在它們附近的局部電磁場的發生 器。認為該效應的原因在於自由載荷子(在照射納米顆粒後的電子空穴對)和連續電荷分 離的產生。不希望受理論的約束，目前提出的作用機理是細胞膜和半導體表面的靜電偶聯， 有效地形成電容器。當納米晶體放置在細胞附近時，由光激發的納米晶體產生的累積電磁 場可以與細胞跨膜電梯度相互作用，產生決定細胞膜電位的電磁場。將細胞膜的一部分局 部去極化可能足以在整個細胞中產生去極化。因此，本文提供了光學地控制和/或操縱靶細胞跨膜電位的方法，其包括至少一 個靶細胞；在適合所述靶細胞附著激活平臺的條件下，使靶細胞接觸所述激活平臺以形成 處理過的靶標；通過所述激活平臺向處理過的靶標遞送能量；以及檢測靶標的應答。遞送能量可以包括遞送光、電能、磁能等。通過基本上任意的照射方法，包括雷射 照射、水銀燈照射、氙燈照射、滷素燈照射、LED照射等，可以進行該遞送能量步驟。優選地 在適合激活平臺中的納米晶體吸收的波長或波長範圍進行照射步驟。使用多種方法，其中使用任何合適的測量光的或累積光的儀器，可以進行該檢測 步驟。這樣的儀器的實例是照相機、數位照相機、攝像機、CMOS照相機、CCD照相機、安裝在 螢光顯微鏡上的數位照相機、光電倍增管、螢光計、光度計、顯微鏡和甚至人眼。可以以任何 合適的方式連續地或在一個或多個離散的時間點來監測細胞應答。或者，該檢測步驟可以包括使用第二檢測機理。這樣的第二檢測機理的一個實例 是使用螢光共振能量轉移(「FRET」)。利用FRET，納米結構可以將它的能量轉移至第二分 子，後者然後發射可檢測的信號。額外的第二檢測機理依賴於細胞中的可以獨立檢測的變 化。例如，該細胞可以經歷裂解。或者，細胞可以經歷化學變化，提高或降低可以被獨立測量的一種或多種化學劑或生化劑(例如，鈣離子)的濃度。可以將至少一種額外的材料添加到至少一個細胞或處理過的細胞中，以測試細胞 對額外材料的應答。例如，可以首先使細胞接觸所述至少一種納米晶體，照射，並檢測細胞 應答作為「對照」樣品。然後可以使處理過的細胞接觸該額外的材料，以製備材料處理過的 細胞，照射，並檢測。該第二次細胞應答可以與第一次(對照)細胞應答相對比。第一次細 胞應答和第二次細胞應答之間的差異，將指示所述材料的加入是否對細胞行為具有任何影 響。可以加入不同的額外材料或額外劑量的相同的額外材料，隨後照射，並檢測第三次細胞 應答。這可以以連續方式進行任意次數。例如，可以檢測遞增劑量的材料，產生第三次細胞 應答、第四次細胞應答、第五次細胞應答、第六次細胞應答等。可以將這些連續的細胞應答 繪圖或以其它方式進行對比，並可以測定系列處理的效果。或者，可以平行地進行「對照」和「實驗」樣品。例如，可以使第一個細胞接觸納米 晶體，照射，並檢測對照細胞應答。平行地(連續地或同時地)，可以使第二個細胞接觸納米 晶體和試驗材料，照射，並檢測試驗細胞應答。可以將對照細胞應答和試驗細胞應答進行對 比。所述至少一種額外的材料通常可以是任意材料。可以與激活平臺組合地使用已 知能調節離子通道行為的材料。參見，例如，Ashley (編)，Ion Channels: A Practical Approach (Oxford University Press 1996)。這些材料的實例包括藥物候選物、細胞功能 調節劑、用於增強藥物遞送的分子部分、分子探針候選物等。除了上述納米晶體的用途以外，修飾的納米晶體可以用於實現強的、穩定的和可 控的局部電場。這樣的修飾包括高表面電荷(例如，CdTe/Cdk作為核心/殼組合)、向納 米晶體中摻雜可以作為一類自由載荷子的供體或受體的材料、產生具有P-或η-型表面阱 (surface trap)的納米晶體、綴合有助於電荷分離的分子等。通過使用可以將光轉化成電 力的納米晶體可以實現細胞跨膜電位的有效產生。在某些實施方案中，半導體納米晶體包括下述元素的材料元素周期表第 12 (IIB)族的元素，和選自元素周期表第16 (VIA)族的元素或元素的組合。例如，納米晶體 核心可以由Cdk、CdTe、CdS或HgTe或者其混合物或合金形成。或者，納米晶體核心可以包 括下述元素的材料第13族的元素，和選自第15族的元素或元素的組合。例如，納米晶體 核心可以由InP或者其混合物或合金形成。經常構造半導體納米晶體材料以提高它們的光學性質。這樣的材料通常包括半導 核心，其被絕緣殼材料包圍，所述絕緣殼材料通常相對較厚(例如，約2 nm至約4 nm)。但 是，絕緣殼的存在可以使納米晶體對它們的局部環境相對不敏感。相反，某些應用要求納米 晶體材料對局部電場的變化特別敏感。通過改變殼材料的組成和/或構造可以提高靈敏 度。本文提供的納米晶體材料可以感知或調節局部電場中的變化。這些材料特別適用於包 含監測電壓-門控的離子通道的生物學試驗。因此，提供了包括殼層的半導體納米晶體，所 述殼層僅覆蓋半導體核心的一部分。某些納米晶體包括這樣的殼材料，其足夠薄以允許電 子流通過激活平臺，同時仍然增強顆粒的光學性質。例如，所述殼相對薄(相對於可購得的 量子點)，並僅包括鈍化殼材料的幾個單層。例如，一類環境敏感的納米晶體包括被薄ZnS 或CdS殼包圍的由CcKe和/或CdTe形成的核心。提供了其它類型的納米晶體，它們設計成在有電場存在下不發螢光。這樣的材料被設計為用於有效地將光轉化成電流，且可以用於包含電流變化的非光學檢測的應用。為 這樣的應用提供了不包括絕緣殼的半導體納米晶體。缺少殼的納米晶體可以有效地吸收 光，以生成和傳導電流。當在本文所述的激活平臺形式中時，電流可以自由地穿過平臺，並 有效地去極化接觸平臺的細胞。具有或沒有額外的表面塗層且僅由半導體核心(且沒有 殼)組成的顆粒可以被光激發，並以非光學方式檢測，諸如用膜片電極，且沒有去極化效率 的損失。可以用表面塗層修飾納米晶體，以添加不同的官能團或改變在下面的納米晶體的 性質。除了已經描述的表面塗層以外，其它類型的配體和塗層材料可以為光電應用提供額 外的益處。例如，可以處理納米晶體以使它們的水溶解性或水分散性更高。通常在有諸如 TOPO和TOP的疏水溶劑(它們賦予納米晶體水不溶性)存在下，合成納米晶體。通過用親水 的和/或帶電荷的配體的衍生化可以增加納米晶體的水溶性。例如，可以對納米晶體進行 配體交換反應，使表面結合的疏水基團與更親水的配體交換。在某些實施方案中，可以用為 納米晶體提供淨正電荷或淨負電荷的配體或聚合物包被納米晶體。可以用於產生具有淨負 電荷的納米晶體的材料的代表性實例包括含有例如一個或多個巰基、磺酸酯基和羧酸酯 基的那些材料，諸如1-硫代甘油、巰基乙酸、2-巰基乙基磺酸酯、聚(丙烯酸)或其衍生物 或硫辛酸。可以用於產生具有淨正電荷的納米晶體的材料的代表性實例包括，例如，聚乙醯 亞胺(PEI)、半胱胺、聚烯丙胺、組氨酸、聚組氨酸、賴氨酸和聚賴氨酸。可選地或額外地，可以用含有反應官能團(例如，可聚合的基團)的化合物(例 如，聚合物)包被或衍生化納米晶體。在適當激活(例如，光或熱)後，反應官能團可以聚 合以形成包被的納米晶體。具有反應性的或可聚合的基團的聚合物的代表性實例包括乙烯 基聚合物和丙烯酸聚合物，所述聚合物可以用於在納米晶體表面上形成聚合物層。可以用於包被或覆蓋本文所述的納米材料(例如，作為在納米晶體上的塗層，或 作為激活平臺中的層)的材料的其它實例包括天然存在的或合成地製備的聚合材料。天 然存在的聚合材料的代表性實例包括瓊脂糖和多種細胞粘附材料，例如聚-L-賴氨酸、 聚-D-賴氨酸、聚L-和D-鳥氨酸、纖連蛋白、RGD肽、基質膠、膠原I和IV、凝集素、彈性蛋 白、透明質酸、層粘連蛋白、細胞表面蛋白的抗體、胞外蛋白等。合成地製備的聚合物的一 種代表性實例是聚(二烯丙基二甲基氯化銨)(PDDA)。某些激活平臺在所述裝置的一層或 多層中利用PDDA。用於所述方法的一種激活平臺包括本文所述的一種或多種類型的納米材料(例 如，納米晶體)。激活平臺可以具有多種構造，取決於使用的具體納米材料和用途。例如， 激活平臺可以是基本上平面的，且可以採取例如薄膜、陣列、圖案化的塗層等形式，或可以 具有更複雜的三維構造。通過改變多種設計參數，例如，如納米晶體層數、納米顆粒的組成 (例如CdSe、CcTTe、CdS、&1%、ZnS等)和不同層中納米顆粒的類型和/或尺寸，可以構建 三維結構。激活平臺通常固定化在基質或表面上。對於用於光學試驗，希望基質是透光的，使 它不會顯著阻礙或散射在試驗中使用的光(例如，波長在紫外線附近至紅外線附近的光)。 某些實施方案要求基質由透光(例如，透明)材料(諸如玻璃或塑料)製成。基質可以具有不同的構造。例如，基質可以是平面的表面或彎曲的表面。基質的 代表性實例包括顯微鏡載玻片、蓋玻片、試管、容器、多孔板(例如微量滴定板)、微珠(玻璃或聚合物)、陶瓷微球、碳納米纖維等。在某些實施方案中，激活平臺另外包括一層或多層的粘附基質(例如，粘附層)。 如上所述，粘附基質允許細胞結合基質，引起或誘導或者不引起或不誘導形態學變化、分 化、細胞增殖、凋亡、停滯或其它生理學變化。粘附基質優選地是對活細胞無毒的和不妨 礙激活應答的非絕緣材料。用於製備粘附基質的材料的實例包括例如聚-L-賴氨酸、 聚-D-賴氨酸、纖連蛋白、膠原、彈性蛋白、透明質酸、層粘連蛋白、胞外基質蛋白、氟化的表 面活性劑、聚1-和d-鳥氨酸、纖連蛋白、RGD肽、基質膠、膠原I和IV、凝集素、彈性蛋白、 透明質酸、層粘連蛋白、細胞表面蛋白的抗體、胞外蛋白等。通常選擇納米顆粒的類型和排列以使從激活平臺向細胞中傳遞的電荷最大化，並 使激活平臺內的電荷傳導最小化。在某些實施方案中，這可以通過設計薄膜形式的激活平 臺來實現。這樣的薄膜可以構造成高度絕緣。儘管電荷不會在高度絕緣的材料內遠距離移 動，但是會移動一定距離。在某些實施方案中，薄膜的電導率使得電荷移動的距離與薄膜厚 度處於相同的尺寸量級。該距離通常遠遠小於細胞直徑(細胞直徑是微米尺寸量級)，所 以電荷不會繞著細胞移動。薄膜可以包括一種或多種類型的納米材料(例如，納米晶體顆 粒)，且可以由一層或多層材料形成。另外，納米顆粒經常包括表面塗層或處理，其預防或最 小化顆粒向含水介質中的滲透。納米顆粒可以均勻地分散在薄膜層中，或可以定位在薄膜 的特定域中，且可以嵌入薄膜中和/或安置在薄膜表面上。例如，納米顆粒可以排列在薄膜 內的離散域中或在薄膜的表面上，形成一維或二維陣列。或者，納米顆粒以「肩並肩，，方式 鄰近地排列在基質表面上。在還另一個系統中，激活平臺是圖案化陣列的形式。這樣的陣 列可以由例如納米晶體材料的離散斑片(例如，斑點)形成。選擇斑片之間的間距以消除 薄膜之間的電子傳導。在有些系統中，斑片約為細胞的尺寸。細胞尺寸的斑片可以由高傳 導性材料形成，同時能把所有電荷導向細胞。某些薄膜被納米晶體顆粒飽和。含有高濃度納米晶體的薄膜允許納米晶體緊密堆 積，且可以有效地負載電流和去極化細胞。薄膜不應當對細胞有毒，且可以是不妨礙細胞去 極化的任意厚度。例如，薄膜可以是在約10 nm至約100 nm的厚度範圍。某些薄膜是非常 均勻的，且可以通過在整個薄膜表面提供均勻濃度的納米晶體顆粒來製備，和/或具有均 勻的厚度。薄膜可以由多個納米晶體層形成(例如，通過逐層裝配(LBL)來製備)。圖15顯 示了一個示例性的激活平臺。參考圖15，試驗系統1500包括基質1502 (例如，玻璃蓋玻 片)，所述基質具有固定化在它的表面1504上的激活平臺1506，所述激活平臺上放置含有 核1510的細胞1508，所述細胞具有靜息電位(例如，-70 mV)。在圖15A所示的一個具體的 實施方案中，激活平臺1506包括量子點1514的多層1512。激活平臺可以包括帶正電荷的 和/或帶負電荷的量子點。在某些激活平臺中，使用帶正電荷的和帶負電荷的量子點的交 替層。使用的量子點層的數目由多種因素決定，諸如使用的納米晶體的類型、基質的構造、 待試驗的細胞的類型、可用於製備薄膜的時間、使用的細胞粘附層的類型、納米晶體的表面 塗層、薄膜是否被圖案化和使用的聚合物的類型，但是通常是約1至約30層。某些激活平臺 使用具有小於20層或更少、或約2至約15層的薄膜。其它激活平臺具有10層或更少，或 約5至約10層。具體的激活平臺僅使用約5-7層。每個納米晶體層可以包括相同類型的材 料。或者，不同層可以包括不同類型的納米晶體或不同電荷的納米晶體。任選地，一層或多層的材料1516 (例如聚合物)插入在鄰近的量子點層之間。可以以此方式使用的一類聚 合物是PDDA。在某些類型的激活平臺中，材料1516 (例如聚合物)被安置在基質1502的 表面1518上，以將激活平臺1506固定化在基質上。任選地，粘附基質(例如粘附層)1520 覆蓋量子點層的堆疊1512，以增強細胞1508向粘附基質1506的粘附。通常選擇粘附層組 成，以實現細胞和粘附基質之間的緊密接觸。另一類激活平臺包括多個量子點層，它們固定化在由諸如氧化銦錫(ITO)的透明 導體形成或包被的基質上。可以用量子點層直接處理這樣的基質。或者，這樣的基質可以安 置在透光基質(諸如玻璃顯微鏡載玻片)的全部或一部分上(例如，以圖案化陣列的形式)。 激活平臺包括多個層，其中每個層包括量子點群。所述群通常包含具有均勻尺寸的量子點。 排列量子點的層和類型以促進穿過激活平臺的電子的流動，諸如激活在激活平臺表面上或 附近的細胞。通過以在結構中的具體量子點類型具有特異性的波長照射，可以激發激活平 臺。下面的示例性的激活平臺解釋了可以用於本文所述方法中的一個具體構造。這樣的 平臺包括已經固定化在一個表面上的平面ITO基質，吸收紅光波長的第一層納米晶體和吸 收藍光波長(但不吸收紅光波長)的第二層納米晶體。可以將納米晶體的連續層(例如，第 三和第四層)添加到所述結構上，它們分別吸收例如綠和黃光。因為通過顆粒尺寸可以調 節量子點的傳導帶的能量，所以通過優化每個連續層中的顆粒尺寸可以優化電子轉移。例 如，所述平臺可以包括第一層CdTe納米晶體，其具有約700 nm的發射波長。所述結構包括 第二層CdSe納米晶體，其具有約490 nm的發射波長；第三層CdSe納米晶體，其具有約545 nm的發射波長；以及第四層CdSe納米晶體，其具有約630 nm的發射波長。可以將任選的 細胞粘附層安置在暴露於細胞(例如，細胞培養基)的第四層的表面上。如果需要，可以將 諸如聚(亞乙基二氧噻吩)(PEDOT)的有機半導體安置在ITO基質和CdTe納米顆粒薄膜 之間，以進一步提高薄膜效率。在該示例性的裝置中，當用紅光照射時，僅可以激發CdTe顆 粒。在激發CdTe層後，電子可以逐層移動到激活平臺的表面，它們在這裡最終調節細胞的 膜電位。本文提供的另一個實施方案涉及一個或多個容器，其具有安置在一個或多個表面 上的納米結構層或激活平臺層。例如，所述容器可以是試管、離心管或微孔板(例如，96或 384孔板)。可以用上述納米結構包被試管或平板孔的整個內表面。或者，可以用納米結構 包被試管或孔的下部或底部內表面。可以儲存這些試驗材料，隨後與細胞一起使用。使用多種方法可以構造本文所述的納米結構。形成激活平臺的一種代表性的方法 使用逐層(LBL)裝配。LBL方法包括，將帶電荷的基質(例如帶負電荷的玻璃)浸入帶正電 荷的聚電解質的溶液中。用水衝洗後，聚電解質在基質表面上形成帶正電荷的單層。浸入 帶負電荷的納米晶體溶液中形成新層，由此轉換表面電荷。這使得新的聚電解質層的吸附 成為可能。可以重複該循環需要的次數。最後，可以安置一層或多層粘附層以覆蓋薄膜結 構。製備激活平臺的另一種代表性的方法包括將含有多個納米顆粒的組合物安置在 固體基質(例如玻璃蓋玻片)上以形成薄膜。所述組合物可以包含聚合物(例如瓊脂糖、 聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯醯胺等)和任選的溶劑、引發劑或其它組分。使用本領域技術人 員已知的任意合適的安置方法，包括例如旋轉鑄模、噴霧塗布、滴落鑄模、滾動塗布、拖拉塗 布、根據需要滴落噴墨列印、PDMS(聚二甲基矽氧烷)衝壓列印、靜電逐層裝配，可以將所述組合物安置在基質上。一旦被安置在基質上，組合物可以採取薄膜的形式，所述薄膜中已經 嵌入多個納米顆粒。如果需要，可以使用任何合適的安置方法，將額外的納米顆粒層安置在 基質上以產生多層的結構。可以額外地加熱、風乾或交聯薄膜，以固化薄膜和/或去除殘餘 的溶劑。在某些實施方案中，可以將一層或多層的細胞粘附層添加到薄膜結構的上面，以增 強細胞粘附和存活力。其它代表性的方法包括將在有機溶液中的水不溶性的納米顆粒(例如，量子點) 滴落鑄模或旋轉塗布到基質上。或者，可以將水不溶性的納米顆粒分散在揮發性的有機溶 劑中，並噴灑到基質上。在本文所述的任意方法中，可以將兩親聚合物安置在納米顆粒薄膜 上。如果使用溶劑，在蒸發溶劑後，可以發生兩親聚合物的安置。可以將細胞粘附層添加到 兩親聚合物的上面以增強細胞粘附和存活力。本文還提供了試劑盒，其用於進行光學感知、控制和/或操縱靶細胞的跨膜電位 的試驗。試劑盒可以包含本文所述的激活平臺，且可以包含一個或多個額外的組分，諸如緩 衝液、染料、原代神經元、生長因子、細胞培養基、其它細胞和亞細胞標記物。某些試劑盒可 以包含一種或多種離子敏感的或電壓-敏感的染料。例如，試劑盒可以包含一種或多種熒 光鈣、鈉、鉀、ROS、RNS、過氧化作用或pH傳感器。在某些實施方案中，將激活平臺固定化在 固體支持物上，諸如容器(例如試管、離心管或多孔微滴定板)或平面基質(例如玻璃顯微 鏡載玻片)的表面。其它基質類型包括傳導性的陶瓷材料，其具有在內部的激活顆粒和覆 蓋它們的粘附分子，或用於暫時和長期植入組織中的其它電極形式(諸如心臟起搏器)、用 於多位點刺入組織中的細刺突樣多陣列和目前處於腦刺激研究中的其它基質。下面的實施例被包括在內來證實本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理 解在下面的實施例中公開的技術代表發明人發現的在本發明的實踐中良好地起作用的技 術，因而可以認為構成本發明實踐的優選方式。但是，本領域技術人員應當理解根據本公 開內容，可以在公開的具體實施方案中做出許多變化，且仍然獲得相同或類似的結果而不 脫離本發明的範圍。
實施例實施例1
用量子點標記膜
量子點是用作電壓敏感的探針的理想候選物，因為它們的物理尺寸與細胞膜的厚度相 當，且它們的電子性質使它們潛在地可被外部電磁場調節。參考圖6A，光子602 (所述光子 具有第一波長，且具有比量子點的HOMO價帶606和LUMO傳導帶608之間的帶隙604更高 的能量)的吸收形成電子空穴對，其可以輻射重組以發射具有第二波長的光子610。強烈的 局部電場(例如，由於跨細胞脂雙層的膜電位的變化)可以與激發的量子點產生的自由載 荷子相互作用。圖6B示意地說明了電場612可以如何調節發射的光614的光學性質。例 如，跨疏水脂雙層的100 mV的膜電位轉化成強烈的局部電場，達到IO7 V/m。該大的場可以 與在照射過程中在量子點中產生的自由載荷子(電子和空穴)相互作用，引起對它們的光 電性質的調節(例如，發射的光的強度和波長的變化)。再次參考圖6B，光614的光電性質 不同於在電場612存在下的光610的那些光電性質。如上面討論的，可購得的QDOT納米晶體已被工程化以使環境不敏感性最大化，且通常不會滿足電壓感知應用。對於用作有效電壓_傳感器和/或激活器，必須以將電場的 變化轉換成量子點發射的變化的方式，工程化納米顆粒的結構。實現該靈敏度的選擇包括 吸收效率的變化、激子行為或發射的光子的調節。另外，為了最大效率地感知膜電位變化， 量子點必須位於細胞膜中或非常接近細胞膜，通常在最高跨膜電場梯度內。參考圖7A，將納 米顆粒702定位在靜息細胞的磷脂細胞膜704內，所述靜息細胞具有在細胞外的淨正電荷 706 (如側面708所示)和在細胞內的淨負電荷710 (如側面712所示)。圖7B描述了在細 胞去極化後磷脂細胞膜704上的電荷的反轉。為了確保納米顆粒的膜內定位，本文提供了 包括專業化的塗層(諸如聚乙醯亞胺(PEI))的材料。包被的納米晶體位於多種細胞類型的 膜內。圖8顯示了 CHO細胞(A)、NG108細胞(B)和神經元網絡(C)，其具有用一類量子點 標記的膜。實施例2 量子點的篩選試驗
提供了基於QDOT納米晶體的光學電壓傳感器，以監測細胞膜電位的快速變化。當位於 細胞膜內時，納米顆粒對跨膜電壓梯度的變化敏感，並檢測跨膜電壓梯度的變化，並將它 報告為它們的發射性質的變化。製備和篩選了一系列的量子點，以監測它們響應於細胞的 化學和電刺激的光學性質。A.化學刺激的影響
根據下述方案，監測化學刺激對量子點處理過的細胞的影響。在96-孔板中將細胞與 基於納米晶體的電壓傳感器一起孵育1小時，然後洗掉任何多餘的納米顆粒。使用適合高 容量成像實驗的化學刺激物(100 mM KCl)來去極化標記的細胞群。圖10顯示了一系列用 相同的核心-殼量子點(用PEI官能化)標記的細胞隨時間的發射強度(表示為相對螢光 強度，RFU)。響應於去極化刺激，2種不同類型的PEI包被的核心-殼量子點(在圖11中 鑑別為X和Y)的螢光強度表現出飛0 %螢光變化/100 mV。B.膜片鉗試驗
經由通過膜片電極以全細胞模式遞送給細胞的電壓階躍去極化，使用標準的電生理方 法直接控制細胞膜電位。圖12顯示了用電極1202電刺激的CHO細胞1200。圖9顯示了用 基於量子點的電壓傳感器標記的CHO細胞的螢光圖像。圖13顯示了電生理刺激引起的用 基於量子點的電壓傳感器標記的細胞的螢光強度變化。圖13A顯示了沿著相同時間標尺的 電壓刺激方案。在這些實驗過程中發現基於納米晶體的電壓傳感器的螢光應答與膜電位的電生 理記錄相關聯。結果證實基於納米晶體的電壓傳感器表現出在生理膜電位範圍內的電壓 靈敏度，並為細胞成像帶來額外的優點，所述優點由半導體納米顆粒的獨特的光學性質(諸 如耐光性、大斯託克斯位移和多路能力)提供。實施例3
基於量子點的激活平臺
描述了用於遠距離可逆操縱膜電位的光控激活平臺。所述的材料和方法提供了被動監 測細胞功能性活動的替代方案，並提供了非侵入地操縱細胞的膜電位的能力，這對於理解 它們的發育、通訊和命運而言是至關重要的。傳統的非生理學方法最常見地依賴於藥理學 幹預(通過加入「高K+」溶液或藥理學通道開放劑或用微電極直接刺激細胞)。但是，這些非
23生理學方法具有嚴重的缺點，包括缺少膜電位的控制、引起的變化的不可逆性和低瞬時分 辨力。本文提供的替代方案使用光來以時間上精確的且空間上分辨的方式觸發膜電位 的遠距離可逆操縱。光逐漸被採納於體外和體內用途中。例如，使用光來操縱遺傳編碼的 光敏感的蛋白，諸如天然存在的(光敏感通道，ChR2)或化學修飾的離子通道，儘管需要在 目標細胞中高水平地表達外源蛋白。以刺激本文所述納米晶體所需的水平光刺激這些和其 它類型的細胞(例如，在有納米晶體存在下)顯示對細胞電位沒有影響(數據未顯示)。量子點代表活細胞的光控電激活的一種替代方案。如上面討論的，在暴露於光後， 量子點可以產生自由的電子和空穴。這些自由載荷子的命運是1)輻射重組，並發射光；或 2)逃逸，並產生電流。參考圖14，光子1402 (所述光子具有比量子點的HOMO價帶1406和 LUMO傳導帶1408之間的帶隙1404更高的能量)的吸收形成電子空穴對。如果釋放一個或 多個自由載荷子(即電子(e_) 1410)，則不會發生能發射光的輻射重組(描述為禁阻躍遷 1412)。正如已經工程化量子點納米晶體來使輻射重組(螢光)最大化，本文描述了納米 晶體顆粒，其已經工程化以使電流最大化。當這樣的量子點形成三維陣列時，它們之間的強 電子偶聯產生具有更長壽命的激子，並促進光產生的自由載荷子的收集和運輸。光產生的 載體分離、運輸和跨與生物界面的聯繫的界面轉移的速率都必須快速以使輸出最大化。對 於光轉換效率的提高而言重要的是電荷分離效率以及促進穿過納米結構化的平臺的電荷 運輸。為了解決用於生物學應用的光控激活平臺的需要，可以利用量子點的光電子性質 來開發納米結構化的生物相容的界面，其由被粘附層包被的半導體納米晶體的堆或層組 成。為了製備用於細胞激活的多層化的量子點薄膜，使用逐層(LBL)安置方法(諸如在實 施例9和10中所述的)來將量子點裝配到玻璃蓋玻片上。進行研究來測定粘附基質(例 如，由聚-L-賴氨酸形成的層)是否改善了細胞與激活平臺的附著。使用沒有粘附層(或 粘附基質)的納米晶體層的初期實驗證實10%或更少的細胞附著到納米晶體層上。該低水 平的細胞可用性使測定不能工作。包含粘附層會使細胞附著到基質上，其具有的額外優勢 是減小細胞和激活材料之間的距離。成像研究顯示本文所述的粘附分子與基質均勻地、緊 密聯繫地接觸。此外，在納米晶體和細胞之間加入粘附層不會干擾納米晶體和細胞之間的 能量轉移(例如，通過形成絕緣層)。細胞與激活平臺的高度粘附(例如，90%或更多的細 胞粘附)是重要的，因為光能向細胞膜電位變化的轉換效率與基質和細胞之間的距離成反 比。此外，粘附分子對於大多數細胞、尤其是神經元的充分分化、擴散、附著是關鍵的。當這 些納米晶體放置在細胞附近並用可見光照射時，由光激發的納米晶體(或光誘導的電流) 產生的累積電磁場會調節細胞膜電位。因而，該基於納米晶體的光控激活平臺允許生理學 地(電場)和重複地刺激細胞。此外，該激活平臺與任意螢光讀出相容，因為由於寬吸收波 譜，半導體納米晶體可以被比它們的發射波長更短的任意光激發。實施例4 細胞的光控激活
在多種光控實驗中使用諸如在實施例3中所述的激活平臺，所述實驗設計為監測激活 平臺對不同類型的細胞的膜電位的影響。
使用電流鉗構造來記錄光引起的可興奮細胞和不可興奮細胞的膜電位的變化。圖 17顯示了一個示例性的電流鉗構造1700，其包含透明的蓋玻片1702，所述蓋玻片具有固 定化在它的表面1704上的被壁1708包圍的激活平臺1706。激活平臺由量子點1726和聚 合物1728 (例如聚(二烯丙基二甲基氯化銨)(PDDA))的交替層形成。細胞1710停留在 激活平臺1706的上表面1712上。含水介質(例如水、緩衝液或細胞培養基)1714覆蓋激 活平臺1706和細胞1710。電極1716插入細胞1710。參照電極1718浸入含水介質1714 中。通過使來自水銀燈(未顯示)的「激活」光1720穿過物鏡1722，使得光進入透明的蓋 玻片1702的底面1724來實現細胞的去極化。典型地，使用短脈衝光(例如，在350和450 nm之間，使用來自弧光燈的寬帶激發或來自雷射源的窄帶)照射激活平臺。光穿過透明的 蓋玻片，並照射激活平臺1706。包含在激活平臺1706中的量子點1726的激發，觸發細胞 1710的膜電位和動作電位(mV)的變化。使用多層激活平臺測定量子點對可興奮細胞和不可興奮細胞類型(CH0細胞、RBL 細胞、NG108細胞、海馬神經元)的影響。在聚-L-賴氨酸包被的納米晶體分層的玻璃蓋玻 片上培養細胞3-14天。圖16顯示了在基於量子點的激活蓋玻片上培養的海馬神經元的原 代培養物的明視野偽相差(pseudo phase)圖像。在這些實驗過程中，沒有觀察到納米晶體 對細胞形態學、分化或生理應答的不利影響。圖18顯示了在用光脈衝1800重複觸發在基 於量子點的激活蓋玻片上培養的海馬神經元原代培養物後，膜電位的變化。細胞中的去極 化應答與光強度成比例，且它們的吸收應答(例如波長依賴性)與在激活平臺中使用的納 米材料的預期吸收性質直接平行。在激活平臺蓋玻片上培養的神經元的光暴露引起膜去極 化，其觸發動作電位1802。圖19顯示了使用第一電流脈衝1910注射(通過圖17所示的膜 片鉗電極)、光脈衝1902和第二電流脈衝1912，交替產生的動作電位在基於量子點的光控 激活平臺上培養的NG108細胞中引起的膜電位的變化。光暴露1902引起膜去極化，其觸發 動作電位1904。得到的動作電位1904 (由光脈衝1902產生)與使用電流脈衝注射1910和 1912引起的動作電位1906和1908相當。無論刺激來源如何，動作電位的時間和量級幾乎 相同，儘管光誘導的刺激的恢復(復極化)表現出一些輕微的差異。在光照射後，激活平臺表現出重複去極化不可興奮細胞(CH0細胞、RBL細胞)的 膜的能力(數據未顯示)，並在可興奮細胞(諸如NG108細胞和海馬神經元原代培養物)中 產生動作電位，唯一的限制是千兆封口穩定性。千兆封口電極在長時間段後失效，具有按小 時測量的有限的實用性，這進一步證實了本文所述的非侵入的、基於光學的方法的實用性。實施例5
監測細胞活性的集成的光學試驗
描述了集成的光學試驗，其組合了光學刺激(通過激活平臺蓋玻片)和細胞活性的光 學記錄。測量細胞內鈣濃度的變化(通過鈣指示染料)來監測細胞的光觸發的激活的影響。在該實驗中使用玻璃蓋玻片，其具有固定化在它的表面上激活平臺，諸如在實 施例1-4中所述的。由於這些納米晶體包被的激活平臺是透明的，它們與不同的光學詢 問方法相容。使用標準方法，使NG108細胞負載Fluo-4 (—種螢光鈣指示劑，購自Life Technologies Corporation ；Carlsbad, CA)。圖 20 顯示了在激活光脈衝之前(A)和之後 (B)負載的NG108細胞的明視野圖像。在照射激活平臺後，Fluo-4指示劑發出螢光，指示細 胞內鈣水平的增加。圖21顯示了在激活光脈衝(380 nm)(在箭頭指示的時間)之前和之後Fluo-4指示染料的螢光強度的變化，並表示穿過NG108細胞中光觸發的動作電位所涉及 的電壓門控鈣通道的鈣流入。結果表明，通過納米材料塗層將光向電場的轉換以及隨後電 壓依賴性鈣流的開放，細胞的光觸發的電去極化會引起細胞內鈣濃度增加。在圖20B中所 示的增加的螢光是由於進入細胞中的鈣和結合其的螢光探針。該實施例證實，光啟動的去 極化會產生與使用膜片鉗實驗(其中電子記錄去極化)所得到的結果相同的結果。實施例6
神經元網絡的不均勻激活
如實施例5所述，給海馬神經元的原代培養物負載Fluo-4鈣指示劑。圖22顯示了在 激活光脈衝之前(A)和之後(B) Fluo-4負載的海馬神經元的圖像。激活光脈衝造成細胞 內鈣水平的增加，其誘導Fluo-4指示劑的螢光性質的變化。如圖22B所示，激活的細胞引 起指示劑發螢光。圖23的圖顯示了光觸發的神經元網絡激活引起的Fluo-4螢光強度隨 時間的變化，並反映了神經元的細胞內鈣濃度的變化。在箭頭指示的時間，發生激活光脈衝 (380 nm)。數據證實，光激發引起神經元網絡的不均勻激活。在這裡，一些神經元直接被光 激活(注意到快速升高的鈣流)，而其它神經元通過神經元間連接(注意到延遲的和有時多 峰的鈣流模式)被間接地激活。圖21和圖23中的數據證實，使用激活平臺光觸發細胞的 激活，引起細胞內鈣濃度增加。數據進一步證實，基於納米晶體的激活平臺可以用於遞送與 所述記錄的光學方法相容的生理學上有關的激活刺激。實施例7
包被的納米晶體的製備
將根據美國專利號6，322，901的實施例1製備的氧化三辛基膦(TOPO)包被的CdSe納 米晶體與大大過量的硫代甘油混合。在70°C將混合物攪拌過夜。次日早晨，加入異丙醇來 沉澱納米晶體。將納米晶體重新分散於0. IM NaHCO3中，隨後加入異丙醇，以再次沉澱納米 晶體來去除溶液中任何殘餘的硫代甘油。加入0. IM NaHCO3，以分散納米晶體。納米晶體 可以進一步使用超濾過濾器純化。使用相同的方法用巰基乙酸或硫辛酸處理TOPO包被的 CdSe納米晶體。實施例8
聚乙醯亞胺包被的納米晶體的製備
將根據美國專利號6，322，901的實施例1製備的氧化三辛基膦包被的CdSe納米晶體 與吡啶混合，並在攪拌下在110°C加熱5小時。將聚乙醯亞胺溶於重量濃度為5-15%的乙醇 中。然後，將聚合物溶液加入納米晶體溶液，並在70°C攪拌過夜。次日早晨，使用旋轉式蒸 發器去除多餘的溶劑。向剩餘的納米晶體中加入去離子蒸餾水以分散納米晶體。最後，使 用超濾過濾器純化納米晶體以去除多餘的聚合物。實施例9
納米晶體膜的製備(LBL方法)
在超聲浴中，在0.5M NaOH溶液中清潔玻璃蓋玻片。在去離子蒸餾水中徹底衝洗清潔 過的蓋玻片，並立即浸入聚(二烯丙基二甲基銨)(PDDA)溶液中。10分鐘後，從PDDA溶 液中取出蓋玻片，並在去離子蒸餾水中徹底衝洗以去除任何未結合的PDDA。衝洗後，將蓋 玻片浸入硫代甘油包被的水溶性的CdSe納米晶體溶液中以沉積一層量子點薄膜。10分鐘 後，從CdSe溶液取出蓋玻片，並在水中徹底衝洗以去除任何未結合的CdSe納米晶體。通過交替地重複浸入PDDA和CdSe溶液，可以沉積其它層的量子點薄膜，直到達到希望的薄膜厚度。實施例10
分層的納米晶體薄膜的製備(LBL方法)
如實施例9所述，用PDDA清潔和處理玻璃蓋玻片。衝洗後，將蓋玻片浸入巰基乙酸包 被的水溶性的CdSe納米晶體溶液以沉積第一層量子點薄膜。10分鐘後，從CdSe-巰基乙酸 溶液中取出蓋玻片，並在水中徹底衝洗以去除任何未結合的納米晶體。衝洗後，將蓋玻片放 入聚乙醯亞胺包被的水溶性的CdSe納米晶體溶液以沉積一層帶正電荷的量子點薄膜。通 過交替沉積帶相反電荷的水溶性的納米晶體可以沉積其它的量子點層。實施例11
激活平臺的聚賴氨酸處理
通過如實施例9和10所述的逐層(LBL)方法製備量子點薄膜後，將蓋玻片浸入聚賴氨 酸溶液30分鐘。然後從聚賴氨酸溶液中取出蓋玻片，在水中徹底衝洗以去除任何未結合的 材料，並在氮氣下乾燥。或者，根據量子點薄膜的表面電荷，首先將蓋玻片浸入聚苯乙烯磺 酸酯溶液10分鐘，然後在水中洗滌蓋玻片，再浸入聚賴氨酸溶液。實施例12
ITO激活平臺的製備
描述了在氧化銦錫(ITO)基質表面上安置量子點的方法。將ITO基質浸入水和聚陽離 子聚合物(例如，PDDA)的溶液中。由於ITO具有帶負電荷的表面，因此陽離子聚合物可以 粘附到ITO上，並使其表面帶正電荷。用去離子水洗滌ITO基質，然後浸入帶負電荷的CdTe 納米顆粒(例如，二氫硫辛酸(DHLA)包被的CdTe)的水溶液。帶負電荷的顆粒會粘附到基 質上的陽離子聚合物表面，並使表面帶負電荷。可以重複該過程以產生具有多個納米顆粒 層的裝置。基於ITO的激活平臺可以任選地連接成迴路以建立持續的電荷流。實施例13
量子點薄膜的旋轉塗布
在熱板上，以1% W/V濃度，將電泳級瓊脂糖溶於0. IM NaHCO3中。在瓊脂糖溶液變得 完全光學澄清後，在攪拌下，將小量巰基乙酸包被的水溶性的CdSe納米晶體加入瓊脂糖溶 液中。趁熱將瓊脂糖溶液倒至或旋轉塗布至化學處理過的玻璃蓋玻片上。在環境溫度風乾 後，在蓋玻片上形成嵌有量子點的瓊脂糖薄膜。實施例14
InP納米晶體的製備
如下製備InP核心。在惰性氣氛下的反應燒瓶中，混合0.88 g醋酸銦(In (OAc) 3)、 0.254 g油酸和14. 8 g 1-十八烷烯(ODE)(經過純化以去除氧)和水。將燒瓶的內含物 加熱至260°C，同時將氮氣流通入燒瓶以隨時去除形成的醋酸。在該溫度5分鐘後，停止氮 氣流。通過將0.45 g TMS3P加入7. 101 g ODE中來製備0. 02 M的三(三甲基甲矽烷基) 膦(TMS3P)在ODE中的溶液。將燒瓶的內含物加熱至300°C。在300°C，將TMS3P溶液快速 注入混合物。通過標準方法(達到希望的螢光發射波長)監測納米晶體形成，直到得到希 望的顆粒尺寸的InP核心，然後將反應冷卻至室溫。實施例15CdSe納米晶體的製備
將TDPA (0.549 g)、T0P0 (6. 000 g)和磁力攪拌棒加入乾淨的、乾燥的50 mL 3頸圓 底燒瓶中。燒瓶的第一個口配有氣體進入接頭，以允許抽氣和氮氣回充，第二個口配有溫度 探頭，其連接溫度控制裝置，第三個口配有橡膠隔片。抽空燒瓶，並重新充滿氮氣，並維持在 氮氣氛下。加入TOP (3.6 mL)和1. 972 g Cd-TOP溶液(含有溶於TOP中的醋酸鎘，濃度 為0.5 mol鎘/kg溶液)。將針插入在第三個孔上的隔片。加熱混合物到260°C，並在該溫 度保持20分鐘。取下針，並將反應燒瓶加熱至355°C。在該加熱步驟期間，加入二苯基膦 (0. 030 mL)，並在340°C加入1. 4 ml TOP-Se (1M在TOP中的硒粒)。每30秒取試樣以測 定當前的發射最大值。通過加入4.0 ml室溫TOP來停止反應。實施例16
具有薄CdS殼的CdSe核心的製備
將Τ0Ρ0 (3.383 g)和磁力攪拌棒加入50 mL 3頸圓底燒瓶。如實施例1所述配備口 1、2和3。抽空燒瓶，並重新充滿氮氣。在真空和恆定攪拌下，將Τ0Ρ0加熱至180°C 1小時。 給燒瓶重新充滿氮氣，並冷卻至100°C，然後加入TOP (3. 4 mL)。將乙醇(21. 3 mL)和在實 施例15中製備的核心樣品(10.7 mL，溫熱至50°C)加入60 mL離心管。將混合物離心，拋 棄上清液，並將沉澱物重新分散在己烷中。然後將分散物加入100°C的反應燒瓶。抽真空， 以去除己烷，剩下分散在Τ0Ρ0和TOP中的納米晶體。將癸胺(2.8 mL)加入反應燒瓶。在第 二個燒瓶中，在氮氣氛下，將3. 905 g在實施例15中所述的Cd-TOP溶液、TDPA (2. 730 g) 和TOP (2.7 mL)的混合物暫時加熱至250°C，然後冷卻至100°C。45分鐘後，將2. 5 ml醋 酸鎘/TDPA/T0P溶液加入至核心中。將反應燒瓶加熱至230°C，並在3小時的時間段內，逐 滴加入3. 9 ml含有TOP (2.926 g)和六甲基二矽硫烷(0.203 g)的溶液。如果需要更薄 的殼，在例如1或2小時時停止滴加。定期從反應中取出試樣以跟蹤發射性質。根據本公開內容，無需過多實驗就可以製備和執行本文公開的和要求保護的所有 組合物和/或方法和/或過程和/或儀器。儘管已經以優選實施方案的方式描述了本發明 的組合物和方法，本領域技術人員應明白可以將變化施加於所述組合物和/或方法和/或 儀器和/或過程以及本文所述方法的步驟或步驟次序，而不脫離本發明的概念和範圍。更 具體地，應當明白化學上和生理學上有關的某些試劑可以替換本文所述的試劑並達到相 同或類似的結果。對於本領域技術人員顯而易見的所有這些類似的替換和修飾應視作在本 發明的範圍和概念內。
權利要求
1.用於測定或監測跨膜電位的變化的方法，所述方法包括 提供至少一個靶細胞；使靶標接觸至少一個激活平臺以形成處理過的靶標，其中所述激活平臺包含至少一層 固定化的納米晶體，所述納米晶體被至少一層粘附基質覆蓋； 刺激所述處理過的靶標； 測定來自所述激活平臺的發射；以及 將所述發射與跨膜電位的變化相關聯。
2.權利要求1的方法，其中所述刺激步驟包括光學刺激、電刺激、磁刺激、化學刺激、 生物刺激、使所述靶標接觸疑似能夠激活離子通道的藥物、使所述靶標接觸疑似能夠抑制 離子通道的藥物或其組合。
3.權利要求2的方法，其中所述電刺激包括使用膜片鉗或施加外部電場。
4.權利要求2的方法，其中所述化學刺激包括使所述靶標接觸鉀鹽或鈉鹽。
5.權利要求2的方法，其中所述生物刺激包括使靶標接觸光敏感的離子通道。
6.權利要求1的方法，其中所述刺激步驟包括將所述靶標維持在第一膜電位電壓， 去極化或超極化所述靶標至第二膜電位電壓，然後使所述靶標恢復至第一膜電位電壓。
7.權利要求6的方法，其中所述第二膜電位電壓比所述第一膜電位電壓更正。
8.權利要求6的方法，其中所述第二膜電位電壓是正的，且所述第一膜電位電壓是負的。
9.權利要求6的方法，其中所述第一膜電位電壓和所述第二膜電位電壓之一為約0mV。
10.權利要求6的方法，其中所述第一膜電位電壓是約-70mV，且所述第二膜電位電 壓是約+40 mV。
11.權利要求1的方法，其中所述細胞是真核細胞、原核細胞、細菌細胞、革蘭氏陽性 細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞、爬行動物細胞、卵母細胞、 兩翼昆蟲細胞、斑馬魚細胞、線蟲細胞、魚細胞、兩棲動物細胞或哺乳動物細胞。
12.權利要求1的方法，其中所述激活平臺的結構是薄膜、納米絲、圖案化的基質或網。
13.權利要求1-12中任一項的方法，其中所述納米晶體是量子點。
14.權利要求1的方法，其中所述刺激步驟包括以適於激活平臺吸收的波長或波長範 圍照射。
15.權利要求1的方法，其中所述刺激步驟包括雷射照射、水銀燈照射、氙燈照射、滷 素燈照射或LED照射。
16.權利要求1的方法，其中使用光學檢測進行所述測定發射。
17.權利要求16的方法，其中所述光學檢測包括使用照相機、數位照相機、攝像機、 CCD照相機、安裝在螢光顯微鏡上的數位照相機、光電倍增管、螢光計、光度計、顯微鏡或 人 眼。
18.權利要求1的方法，其中所述測定步驟包括在單個時間點、在多個時間點測定或 檢測，或者連續檢測。
19.權利要求1的方法，其進一步包括在測定跨膜電位的變化的同時或協同地光學記錄細胞活性。
20.權利要求1-19中任一項的方法，其中所述激活平臺包含2層或更多層固定化的納 米晶體。
21.權利要求20的方法，其中所述激活平臺包含約2至約15層固定化的納米晶體。
22.權利要求20的方法，其中所述激活平臺包含約5至約10層固定化的納米晶體。
23.用於測定或監測跨膜電位的變化的方法，所述方法包括提供至少一個靶細胞；使靶標接觸至少一個激活平臺以形成處理過的靶標，其中所述激活平臺包含至少一層 固定化的納米晶體；刺激所述處理過的靶標；測定來自所述激活平臺的發射；以及將所述發射與跨膜電位的變化相關聯。
24.用於監測和操縱細胞跨膜電位的試劑盒，所述試劑盒包含a.基質；和b.激活平臺，其中所述激活平臺被安置在所述基質的表面上，其中所述激活平臺包含 一層或多層固定化的納米晶體。
25.權利要求對的試劑盒，其中所述基質是玻璃蓋玻片、容器、多孔板、陶瓷微球或碳 納米纖維。
26.用於監測和操縱細胞跨膜電位的組合物，所述組合物包含a.基質；和b.激活平臺，其中所述激活平臺被安置在所述基質的表面上，其中所述激活平臺包含 一層或多層固定化的納米晶體。
27.權利要求沈的組合物，其中所述納米晶體是半導體納米晶體。
28.權利要求沈的組合物，其中每個納米晶體包含半導體核心。
29.權利要求觀的組合物，其中所述半導體核心進一步包含在核心上的塗層。
30.權利要求四的組合物，其中每個納米晶體進一步包含在所述核心和所述塗層之 間的半導體殼。
31.權利要求四的組合物，其中所述塗層包含帶正電荷的化合物。
32.權利要求四的組合物，其中所述塗層包含帶負電荷的化合物。
33.權利要求沈的組合物，其中每個納米晶體包含表面塗層，其中所述塗層包含具 有一個或多個巰基、磺酸酯基和羧酸酯基的材料。
34.權利要求四的組合物，其中所述塗層包含1-硫代甘油、巰基乙酸、2-巰基乙基磺 酸酯、聚(丙烯酸)或其衍生物、硫辛酸、二氫硫辛酸、聚乙醯亞胺、半胱胺、聚烯丙胺、組氨 酸、聚組氨酸、賴氨酸或聚賴氨酸。
35.權利要求沈-34中任一項的組合物，其中所述激活平臺進一步包含粘附基質。
36.權利要求35的組合物，其中所述粘附基質包含聚-L-賴氨酸、纖連蛋白、膠原、 彈性蛋白、透明質酸、層粘連蛋白、基質膠、凝集素、細胞膜蛋白的抗體或RGD肽和它們的子 代。
37.權利要求沈的組合物，其中所述激活平臺包含2種或更多種類型的納米晶體，其中所述2種或更多種類型的納米晶體具有不同的光學性質。
38.權利要求沈的組合物，其中所述一層或多層納米晶體進一步包含聚合物。
39.權利要求沈的組合物，其中所述一層或多層納米晶體進一步包含瓊脂糖、聚甲基 丙烯酸甲酯或聚丙烯醯胺。
40.權利要求沈-39中任一項的組合物，其中所述激活平臺包含2層或更多層納米晶體。
41.權利要求40的組合物，其中所述激活平臺包含約2至約15層固定化的納米晶體。
42.權利要求40的組合物，其中所述激活平臺包含約5至約10層固定化的納米晶體。
43.權利要求40的組合物，其進一步包含一層或多層有機材料。
44.權利要求43的組合物，其中所述有機材料是聚合物。
45.權利要求44的組合物，其中所述聚合物是合成的聚合物。
46.權利要求44的組合物，其中所述聚合物是PDDA。
47.權利要求沈-46中任一項的組合物，其中所述納米晶體是水可分散的。
48.權利要求四的組合物，其中所述塗層包含親水化合物。
49.製備激活平臺的方法，所述方法包括a.提供基質；b.將一層或多層納米晶體施加於所述基質的表面上；以及c.將細胞粘附層施加於所述一層或多層納米晶體上。
50.權利要求48的方法，其中通過旋轉鑄模、滴落鑄模、滾動塗布、根據需要滴落噴墨 列印、PDMS(聚二甲基矽氧烷)衝壓列印、靜電逐層裝配，將所述一層或多層納米晶體施加 於基質的表面上。
全文摘要
公開了納米結構用於監測或調節細胞膜電位的變化的用途。
文檔編號G01N27/26GK102119331SQ200980130702
公開日2011年7月6日 申請日期2009年6月4日 優先權日2008年6月5日
發明者A·薩夫欽科, E·莫洛卡諾瓦, J·巴特爾, J·特裡維, M·伊格納蒂烏斯, 趙偉文 申請人:生命科技公司