刺五加苷分化間充質幹細胞成少突膠質前體細胞及試劑盒的研製、用於神經系統疾病的藥物的製作方法
2023-07-25 11:27:46 1
專利名稱：刺五加苷分化間充質幹細胞成少突膠質前體細胞及試劑盒的研製、用於神經系統疾病的藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種刺五加苷處理人間充質幹細胞得到少突膠質前體細胞 (Oligodendrocyte Progenitor cells,0PC)及其增殖的分化培養基，及其試劑盒研製的方法，以及包括前述方法獲得的前體細胞的用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物。更具體地，本發明涉及一種刺五加苷處理人間充質幹細胞得到少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基，使用該培養基選擇性的獲得少突膠質前體細胞的方法，以及包括前述方法獲得的少突膠質前體細胞的用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物。
背景技術：
少突膠質細胞是中樞神經系統內的一種大膠質細胞。少突膠質細胞是中樞神經系統內唯一的髓鞘生成細胞，同時還分泌多種神經營養因子維持少突膠質細胞與其他神經細胞之間相互的正常生理作用。主要功能是產生髓鞘包繞神經軸突，維持神經衝動沿軸突跳躍性傳導。髓鞘(myelin)由成熟少突膠質細胞延伸的胞質膜構成。脊髓損傷造成少突膠質細胞死亡，是軸突脫髓鞘改變的直接原因。多發性硬化症是中樞神經系統慢性炎症性脫髓鞘病，脫髓鞘過程中少突膠質細胞的廣泛丟失，原發性少突膠質細胞損傷並導致繼發性脫髓鞘。目前用於神經系統疾病治療的幹細胞包括人間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSC)，它們體外向神經細胞分化，國外研究較多使用2-硫基乙醇、二甲亞碸、硫代甘油等作為誘導劑，但這些化學製劑均有一定毒性。其不能應用於人體內，使得到的細胞在製備成藥物組合物時安全性差。例如，CN200480019375. 7公開的由包括人在內的哺乳動物的海馬、小腦、脊髓等組織中分離培養獲得少突膠質祖細胞，通過睫狀神經細胞營養因子和3，3』，5』 -三碘甲腺原氨酸可獲得分化的少突膠質細胞，其倫理學問題可能限制了其的應用。CN200710195844. 6公開了人骨髓間充質幹細胞向少突膠質細胞分化的方法，採用黏附分子F3/Contactin誘導分化，其誘導分化成本可能昂貴，得到少突膠質細胞已終端分化，不具有幹細胞潛能性。綜上，亟需一種操作簡單、成本低、分化純度高、增殖性質穩定的安全的獲得少突膠質前體細胞的方法。
發明內容
本發明的目的是克服現有的誘導分化人間充質幹細胞成少突膠質細胞的方法操作繁複、成本高，分化得到的少突膠質細胞純度低，並且在分離和擴增過程使用的誘導劑中含有對人體有害的藥物，使誘導分化得到的少突膠質細胞在製備成藥物組合物時安全性差的缺點，提供一種誘導分化人間充質幹細胞成少突膠質細胞的分化培養基，使用該培養基的分離和擴增少突膠質細胞的方法操作簡單、成本低、分化純度高、性質穩定。利用經臨床驗證的傳統中藥作為誘導分化劑具有價廉、安全的優點，可望成為今後臨床神經細胞移植安全有效的誘導分化劑。已經證實一些中藥如丹參注射液、天麻、黃芩苷等，具有在體外誘導MSC向神經樣細胞分化的作用，主要為神經元樣細胞。本發明提供了一種刺五加苷處理人間充質幹細胞得到少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基，所述分化培養基包括液體基礎培養基，其中，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有l-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、 5-300ng/mL人表皮生長因子(EGF)和5_300ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。本發明還提供了一種刺五加苷處理人間充質幹細胞得到少突膠質前體細胞及其增殖的試劑盒研製的方法，其中，所述的試劑盒包括1)間充質幹細胞基礎培養基；2)刺五加苷；3)細胞因子(人表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子)；4)消化細胞的酶以及；5)使用說明書；本發明還提供了一種用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發明所述從人間充質幹細胞分化方法獲得的少突膠質前體細胞，以及和藥學上可接受的載體或賦形劑。使用本發明的分化培養基的本發明的從人間充質幹細胞分化獲得的少突膠質前體細胞及其增殖的方法，能夠高效分化和大量獲得少突膠質前體細胞。由於本發明的分化培養基選擇性強，獲得少突膠質前體細胞純度即可達到70%以上。因此，本發明的方法無需使用營養因子或化學誘導劑等高成本安全性差的藥物就能達到更高純度的分離效果，避免了繁複的操作，因而降低了成本，並且由該方法得到的少突膠質前體細胞的安全性大大提高，可以製備成本發明用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物。本發明用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物不僅安全性好，而且能在體內修復創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病中廣泛丟失或損傷的少突膠質細胞，並有軸突髓鞘質的形成。
圖1為實施例1骨髓間充質幹細胞分化成少突膠質細胞的生長形態照片(光學顯微鏡放大倍數40倍)；圖2為實施例1和3的少突膠質前體細胞表達蛋白的螢光免疫照片(螢光顯微鏡放大倍數40倍)，其中，圖2A為鼠抗人04 IgM標記後二抗顯色螢光免疫照片，圖2B為鼠抗人A2B5 IgM標記後二抗顯色螢光免疫照片，圖2C為圖2A和圖2B疊加得到的螢光免疫照片；圖3為使用實施例2和3少突膠質前體細胞移植治療創傷性脊髓損傷大鼠模型， 移植後隨著時間變化進行脊髓損傷BBB (Basso，Beatlie, Bresnahan)功能評分曲線；圖4為使用實施例2和3少突膠質前體細胞藥物組合物對創傷性脊髓損傷大鼠模型治療前後效果對比的顯微結構照片(光學顯微鏡放大倍數400倍)。
具體實施例方式本發明提供了一種刺五加苷處理人間充質幹細胞得到少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基，所述分化培養基包括液體基礎培養基，其中，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有l-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、 5-300ng/mL人表皮生長因子(EGF)和5_300ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。優選地，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有5_300ug/ mL的刺五加苷、5-15體積％的胎牛血清、10-200ng/mL人表皮生長因子(EGF)和10-200ng/ mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。進一步優選地，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有10-200ug/mL的刺五加苷、5_10體積％的胎牛血清、IO-IOOng/ mL人表皮生長因子(EGF)和lO-lOOng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。本發明的人間充質於細胞分化為少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基可以包括本領域常用的各種基本培養基，例如，選自BME細胞培養基、杜爾貝可改良伊格爾 (Dulbecco' s modified Eagle' s medium, DMEM)細胞培養基、DMEM/F12 細胞培養基、 Fischer' s細胞培養基、IMDM細胞培養基、199細胞培養基、MEM細胞培養基、FlO細胞培養基、F12細胞培養基和1640細胞培養基中的一種或幾種。優選包括的所述基本培養基為 MEM細胞培養基。所述基本培養基的成分為本領域公知，上述列舉的基本培養基名稱為它們的商品名，商業上可供。本發明提供的人間充質幹細胞可以適用於各種含有間充質幹細胞的離體組織，例如骨髓、臍帶血、臍帶、流產胚胎(例如流產的12-14周的胚胎)和流產胎兒等。但考慮到可能有悖於倫理道德、社會風俗習慣甚至法律規定，因此一般不利用流產胚胎和流產胎兒， 並且胚胎和流產胎兒的來源有限。優選所述離體組織選自骨髓、臍帶血和臍帶中的一種或幾種。其中，骨髓和臍帶血可以來自公共臍帶血庫(例如，北京臍帶血庫等)和骨髓庫(例如，中華骨髓庫等)。從來源豐富程度考慮，優選所述離體組織是臍帶，其一般作為醫療廢棄物被處理掉。此外，創傷性脊髓損傷與多發性硬化症患者的骨髓可以作為自體間充質幹細胞的來源，可以避免免疫排斥反應。本發明所述的用於分化為少突膠質前體細胞的人間充質幹細胞出於安全的保守考慮，優選使用傳代代數為第1代到第10代的間充質幹細胞，其中，傳代代數第1代到第4 代的間充質幹細胞可以作為種子間充質幹細胞使用。出於間充質幹細胞數量和穩定性的考慮，優選傳代代數為第4代的間充質幹細胞作為種子間充質幹細胞使用。所述種子幹細胞可以作為大規模培養的起始細胞，也可以採用本領域常規的冷凍保存細胞的技術將其作為細胞株長期冷凍保存起來，以備復甦使用。傳代代數第5代到第10代間充質幹細胞可以作為中間品間充質幹細胞使用。所述中間品幹細胞是指大規模培養後得到的間充質幹細胞，可以用作製備本發明分化為少突膠質前體細胞或藥物組合物的原料。此外，為了便於運輸和保存，所述少突膠質前體細胞也可以進行冷凍保存，在臨近使用前復甦即可。本發明還提供了一種用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發明所述從人間充值幹細胞分化方法獲得的少突膠質前體細胞，以及和藥學上可接受的載體或賦形劑。所述藥學上可接受的載體或賦形劑指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料，例如，包括但不限於鹽水、緩衝鹽液、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適於靜脈內、腰穿、椎管、介入、肌內、皮下、皮內注射和輸注等給藥。適於給藥的藥物組合物包括無菌水浴液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在臨近使用前在無菌可注射溶液或分散液中配製的粉末。適宜的水性或非水性載體、 稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘泊、丙二醇、聚乙二醇、竣甲基纖維素、植物油和可注射的有機酶如泊酸乙醋。這些組合物還可以含有防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑等佐劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。優選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的載體，以及以所述注射液體積為基準，1 X IO5至1 X IO8個/毫升的本發明所述的方法獲得的少突膠質前體細胞。優選所述注射液包括以所述注射液體積為基準，5X105至IXlO7個/毫升的本發明所述的方法獲得的少突膠質前體細胞。優選所述藥學上可接受的載體為生理鹽水。這裡所述的生理鹽水，是指生理學實驗或臨床上常用的滲透壓與動物或人體血漿的滲透壓相等的溶液。優選地，用於哺乳類動物和人體時是0.85-0. 9%的氯化鈉溶液。更優選0.9%的氯化鈉溶液。本發明的發明人意外地發現，少突膠質前體細胞可以對少突膠質細胞丟失或損傷進行修復，並且能夠有效作用於軸突髓鞘質的形成(參見實施例5)。因此本發明的藥物組合物用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病。使用由本發明的方法獲得的少突膠質前體細胞，處於本發明的分化培養基中，因此在製備用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物之前，可以通過除去本發明的分化培養基，用生理鹽水洗滌並重懸所述少突膠質前體細胞。所述生理鹽水的洗滌次數可以通過測定洗出液中殘留的培養基組分來決定。將本發明的用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物在注射給患者時殘留的培養基組分不會引起患者不適即可。所述組合物包括1 X IO5到1 X IO8個/mL本發明的新的少突膠質前體細胞； 優選為5X105到IXlO7個/mL。本發明還提供了本發明的方法獲得的少突膠質前體細胞， 在製備治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病藥物中的應用。本發明還提供了一種治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的方法，其包括給患者施用本發明用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物。施用本發明用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物的方式可以選自介入注射、靜脈注射、腰穿、皮下注射和皮內注射中的一種或幾種；更優選所述施用的方式為腰穿。本發明所述用於治療多發性硬化症與創傷性脊髓損傷等疾病的藥物組合物優選含有1 X IO5到1 X IO8細胞/mL的少突膠質前體細胞，其每次注射給藥量為 0. lmL-5mL/個體；更優選地，本發明所述用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物包括IXlO5到5 X107f/mL的少突膠質前體細胞，其每次注射給藥量為 0. lmL-2mL/ 個體。以上個給出了本發明所述用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物每一次注射的劑量，一個療程三次注射，每兩次注射間隔一周。本發明所述用於治療多發性硬化症與創傷性脊髓損傷等疾病的藥物組合物一般在注射完第二次後的第三天到第七天起效。所述有效的標準是脊髓損傷BBB功能評分明顯提高，可以促使有髓鞘的軸突生成。一個療程結束後，可以馬上連續進行第二個療程的治療，也可以間隔一到三個月後進行第二個療程的治療以鞏固療效，一般治療兩個至四個療程可以消除脊髓損傷病症；間隔時間為六個月或一年，患者如認為有必要，還可進行鞏固療效的治療。優選使用本發明的方法來分離創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病患者的離體組織(例如骨髓)，所得少突膠質前體細胞製備成本發明的藥物組合物給藥創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病患者自體，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應造成的副作用。以下，對本發明的具體實施例進行說明，但本發明的技術範圍不限於這些示例。實施例1 本實施例用於說明使用本發明的分化培養基從人骨髓間充質幹細胞分化為少突膠質前體細胞的方法。人骨髓來自31歲捐獻者的，與該捐獻者及醫院方籤署了知情同意書。將人骨髓用IXPBS等體積稀釋，得到人骨髓稀釋液，以人骨髓稀釋液1.077千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的體積比為2 1加入到50ml離心管中，在1500rpm、25度下進行密度梯度離心10分鐘，離心後收集中間層細胞，並使用IXPBS IOOOrpm離心10分鐘，洗滌所得細胞三次，加入完全培養基，含10%胎牛血清(美國Hyclone公司)的α-MEM 培養基(美國Gibco公司)。細胞計數後，按3 X IO5細胞/cm2的密度接種於75cm2的培養瓶中，每瓶再加入上述培養基使終體積為10ml。在37°C、5% CO2的培養箱中培養第三天後，半量換液。換液時將舊培養基緩慢吸出5ml，加入新鮮的間充質幹細胞培養基，每瓶加入5ml， 繼續在37°C、5% CO2培養。當細胞貼壁生長達到培養瓶底面的85%時，將培養基傾去，並將細胞通過用胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘收集後在含10%胎牛血清的α -MEM培養基中傳代培養。同樣當細胞貼壁生長達到培養瓶底面的85%時，進行消化傳代培養。1瓶原代培養物可以傳代三瓶，每瓶起始培養的細胞密度為2 X IO5細胞/mL。三瓶75cm2培養瓶在37°C、 5% CO2培養箱中培養6天後，得到貼壁並且生長達到培養瓶底面的90%的細胞。獲得的間充質幹細胞取1瓶進行流式細胞檢測，經胰酶消化，離心後細胞沉澱用ImL IXPBS重懸，計數。取3份20 μ L (1 X IO6個)上述的傳代得到細胞懸液分別添加到有20 μ L FITC-⑶34 (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD90 (BD 公司)；20 μ L FITC-CD45 (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD44 (BD 公司)；20μ LFITC-HLA-DR(BD公司)禾口 20 μ L PE_CD105(BD公司)的離心管中。置於4°C冰箱染色30分鐘，然後用ImL的IX磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌三次，最後用0. 5mL的IXPBS 重懸洗滌後的細胞，所得洗滌後的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結果顯示，CD44 > 95. 56%,CD90 > 98. 60%, CD105 > 91. 3%,CD34 < 3. 45%, CD45 < 2. 10%, HLA-DR < 1. 33%，符合間充質幹細胞表型特徵。取上述培養好的間充質幹細胞，傾去培養基，每瓶加入50ug/mL刺五加苷、10%胎牛血清、20ng/mL人表皮生長因子(EGF)和20ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)(美國 R&D公司)的α -MEM培養基IOml進行分化培養(分化培養基)，48小時後半量換液，換液時將舊培養基緩慢吸出5ml，加入新鮮的分化培養基，每瓶加入5ml，繼續在37°C、5 % CO2培養。第五天間充質幹細胞形態發生變化，並進行半量換液，繼續培養到第7天間充質基本分化為少突膠質前體細胞。取其中一瓶細胞，棄去培養基，按前述條件經胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘後，收集細胞沉澱用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸緩衝液)重懸，計數。取6份50yL(每份含IX IO6個細胞)上述的傳代得到細胞懸液分別接種在六孔培養板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養基後用1 XPBS洗滌一次，加入2 %甲醛固定3分鐘，用0. 5 %曲通 100 (Triton-100) IXPBS洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入1 XPBS以及用1 XPBS 稀釋的鼠抗人04IgM、1 X PBS稀釋的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀釋的鼠抗人髓鞘鹼性蛋白 IgG。在4度冰箱過夜進行染色/結合，之後用0.5% Triton-1001 XPBS洗滌3次，向鼠抗人髓鞘鹼性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-FITC，並向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分別加入用IXPBS稀釋的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育後用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之後用90%甘油封閉。螢光顯微鏡下觀測， 結果顯示，70%以上的細胞呈現A2B5和04為陽性，髓鞘鹼性蛋白為陰性，符合少突膠質前體細胞的特異性特徵，因而證明使用本發明的分化培養基從人骨髓間充質幹細胞能分化出高純度的少突膠質前體細胞。實施例2 本實施例用於說明使用本發明的分化培養基從臍帶來源間充質幹細胞分化為少突膠質前體細胞的方法。臍帶來自沈歲健康孕婦分娩後採集的臍帶。與該孕婦及醫院方籤署了知情同意書，在其分娩後收集其臍帶。將離體組織臍帶用含2%雙抗(青黴素和鏈黴素)的IXPBS洗滌三次，後用眼科剪剪碎成為約Imm3的小塊。所得剪碎的組織小塊用0. 25%胰酶溶液以1克0. 5mL的重量體積比消化5分鐘後，加入是胰酶溶液體積五分之一的胎牛血清終止消化，以IOOOrpm離心5分鐘收集消化好的組織小塊，傾去胰酶溶液上清，然後所得剪碎的組織小塊用含雙抗的α -MEM培養基洗滌三次，以IOOOrpm離心5分鐘收集洗滌好的組織小塊，傾去洗滌溶液上清。收集所述組織小塊，向其中加入含有10%胎牛血清的α-MEM培養基，沒過組織小塊就行，放置培養皿中，在37°C、5% CO2培養。第三天進行換液，緩緩吸取培養基，後加入新鮮培養基，並在371、5%0)2培養箱中培養。每隔三天換一次液，直至爬出間充質幹細胞長滿培養皿，即可使用胰酶消化進行擴增培養，將培養基傾去，並將細胞通過用胰酶消化， SOOrpm離心5分鐘收集後在含10%胎牛血清的α-MEM培養基中傳代培養。同樣當細胞貼壁生長達到培養瓶底面的85%時，進行消化傳代培養。1瓶原代培養物可以傳代三瓶，每瓶起始培養的細胞密度為2Χ IO5細胞/mL。三瓶75cm2培養瓶在37°C、5% CO2培養箱中培養 6天後，得到貼壁並且生長達到培養瓶底面的90%的細胞。上述獲得的間充質幹細胞能繼續擴增到第10代，該間充質幹細胞仍具有相同的性狀，取1瓶培養到第10代間充質幹細胞進行流式細胞檢測，經胰酶消化，離心後細胞沉澱用ImLlXPBS重懸，計數。取3份20 μ L(1 X IO6個)上述的傳代得到細胞懸液分別添加到有 20 μ L FITC-CD34 (BD 公司)禾口 20 μ LPE-CD90 (BD 公司)；20 μ L FITC-CD45 (BD 公司)和 20 μ L PE-CD44 (BD 公司)；20 μ L FITC-HLA-DR (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD105 (BD 公司)的離心管中。置於4°C冰箱染色30分鐘，然後用ImL的IX磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌三次，最後用0.5mL的IXPBS重懸洗滌後的細胞，所得洗滌後的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結果顯示，CD44 > 95. 56%,CD90 > 98. 60%,CD105 > 91. 3%,CD34 < 3. 45%, ⑶45 < 2. 10%, HLA-DR < 1. 33%，符合間充質幹細胞表型特徵。
取上述培養好的間充質幹細胞，傾去培養基，每瓶加入50ug/mL刺五加苷、10%胎牛血清、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的α -MEM培養基IOml進行分化培養，48小時後半量換液，換液時將舊培養基緩慢吸出5ml，加入新鮮的分化培養基，每瓶加入5ml，繼續在 37°C、5%C02培養。第五天間充質幹細胞形態發生變化，並進行半量換液，繼續培養到第7 天間充質基本分化為少突膠質前體細胞。取其中一瓶細胞，棄去培養基，按前述條件經胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘後， 收集細胞沉澱用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸緩衝液)重懸，計數。取6份50yL(每份含IX IO6個細胞)上述的傳代得到細胞懸液分別接種在六孔培養板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養基後用1 XPBS洗滌一次，加入2 %甲醛固定3分鐘，用0. 5 %曲通 100 (Triton-100) IXPBS洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入IXPBS以及用IXPBS 稀釋的鼠抗人04IgM、1 X PBS稀釋的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀釋的鼠抗人髓鞘鹼性蛋白 IgG。在4度冰箱過夜進行染色/結合，之後用0. 5% Triton-IOOlXPBS洗滌3次，向鼠抗人髓鞘鹼性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-FITC，並向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分別加入用IXPBS稀釋的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育後用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之後用90%甘油封閉。螢光顯微鏡下觀測， 結果顯示，70%以上的細胞呈現A2B5和04為陽性，髓鞘鹼性蛋白為陰性，符合少突膠質前體細胞的特異性特徵，因而證明使用本發明的分化培養基從臍帶來源的間充質幹細胞能分化出高純度的少突膠質前體細胞。實施例3本實施例用於說明使用本發明的分化培養基對於少突膠質前體細胞體外傳代擴增培養的方法，以及所得少突膠質前體細胞冷凍保存的方法。取實施例1和2中得到的少突膠質前體細胞，當其貼壁生長達到培養瓶底面的達到90%時，將細胞通過用胰酶消化，800rpm離心5分鐘收集後在含50ug/mL刺五加苷、10% 胎牛血清、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的α-MEM培養基培養基中傳代培養。同樣少突膠質前體細胞貼壁生長達到培養瓶底面的達到90%時，重複上述傳代培養過程。當少突膠質前體細胞擴增到培養代數第5代時，將1瓶少突膠質前體細胞用胰酶消化，SOOrpm離心 5分鐘收集得到少突膠質前體細胞沉澱，用胎牛血清重懸該少突膠質前體細胞沉澱，顯微鏡下計數使少突膠質前體細胞懸液的濃度達到5X 106/ml。應用二甲基亞碸(DMSO，Sigma) 和胎牛血清先配製成含20% DMSO的胎牛血清，後加入上述重懸液中使得DMSO濃度為10% 並調整少突膠質前體細胞濃度為5X 106/ml。將每Iml所得少突膠質前體細胞懸液分裝到 2ml凍存管中，放置程序降溫盒(美國Nalgene公司)中按照使用說明書，先在_80度冰箱保存2天後，轉至液氮中凍存。取1瓶傳代代數為第4代的少突膠質前體細胞，經胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘後細胞沉澱用ImL IXPBS重懸，計數。取6份50 μ L(每份含1 X IO6個細胞)上述的傳代得到細胞懸液分別接種在六孔培養板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養基後用IXPBS洗滌一次，加入2%甲醛固定3分鐘，用0. 5%曲通100 CTriton-100) 1 XPBS洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入IXPBS以及用IXPBS稀釋的鼠抗人04IgM、lXPBS稀釋的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀釋的鼠抗人髓鞘鹼性蛋白IgG。在4度冰箱過夜進行染色/結合，之後用0. 5% Triton-1001 XPBS洗滌3次，向鼠抗人髓鞘鹼性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-FITC，並向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分別加入用1 XPBS稀釋的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育後用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之後用90%甘油封閉。螢光顯微鏡下觀測，結果顯示，70%以上的細胞呈現A2B5和04 為陽性，髓鞘鹼性蛋白為陰性，符合少突膠質前體細胞的特異性特徵，因而證明使用本發明的分化培養基傳代培養的少突膠質前體細胞未出現分化變性的現象，保持了少突膠質前體細胞的細胞性狀。此外，為了更清楚地顯示本發明的效果，申請人還將增殖到第4代的少突膠質前體細胞按照實施例1和3的方法在六孔培養板中培養，圖2顯示了該少突膠質前體細胞表達蛋白的螢光免疫照片，其中，圖2A為鼠抗人04IgM標記後二抗顯色螢光免疫照片，圖2B 為鼠抗人A2B5IgM標記後二抗顯色螢光免疫照片，圖2C為圖2A和圖2B疊加得到的螢光免疫照片。實施例4 本實施例說明本發明方法獲得的試劑盒製備。人間充質幹細胞誘導分化少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基試劑盒，其組份配製如下1)間充質幹細胞基礎培養基，為α-MEM、DMEM/F12(1 1)或者DMEM培養基， 500ml，使用500ml無菌試劑瓶包裝；2)刺五加苷，25mg,使用2ml無菌密封西林瓶或試劑管包裝；3)細胞因子(人表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子)；人表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子都為10ug，使用2ml無菌密封西林瓶或試劑管包裝；4)消化細胞的酶以及；胰酶為IOOml，使用IOOml無菌試劑瓶包裝；5)使用說明書；詳細介紹間充質幹細胞分化為少突膠質前體細胞及其增殖的使用步驟和注意事項。實施例5本實施例說明含有本發明方法獲得的少突膠質前體細胞的用於治療創傷性脊髓損傷的藥物組合物在創傷性脊髓損傷動物模型中應用。取實施例3所得的臍帶來源間充質幹細胞分化並傳代5代的少突膠質前體細胞培養物含有2X IO6少突膠質前體細胞。SOOrpm下離心5min後收集間充質幹細胞的細胞沉澱，用0. 9%的氯化鈉溶液洗滌3次，然後用該0. 9%的氯化鈉溶液重懸至2X IO6個/mL的濃度，於4°C下保存備用。按照與實施例1和3同樣的方法傳代擴增製備臍帶血來源間充質幹細胞分化的2X IO6個/mL濃度的少突膠質前體細胞注射液。將購自北京大學醫學部的脊髓損傷大鼠模型，隨機分為A、B和C三組組，每組10 只，A組為臍帶來源的間充質幹細胞分化並傳代5代的的少突膠質前體細胞注射液治療組， B組為臍帶血來源的間充質幹細胞分化的少突膠質前體細胞注射液，C組為同體積0. 9%的氯化鈉溶液空白組。A和B兩組在第O天鼠模型脊髓損傷部位注射2X106個/mL，即ImL少突膠質前體細胞注射液，第7天和第14天以相同劑量再次注射；C組於相同時間點在脊髓損傷部位注射0.5mL生理鹽水。分別於最後一次注射後的第1、2、4、8、12、16和第M周監測鼠模型髓鞘形成，並進行移植前後BBB功能評分，結果如下表2所示。表 1
脊隨損傷大鼠模型OPC移植後BBB評分實驗評分結果
權利要求
1.一種人間充質幹細胞分化成少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基，所述分化培養基包括液體基礎培養基，其特徵在於，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有l-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生長因子 (EGF)和5-300ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。
2.根據權利要求1所述的分化培養基，其中，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有5-300ug/mL的刺五加苷、5_15體積％的胎牛血清、10-200ng/mL人表皮生長因子(EGF)和10-200ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。
3.根據權利要求2所述的分化培養基，其中，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有10-200ug/mL的刺五加苷、5_10體積％的胎牛血清、lO-lOOng/mL人表皮生長因子(EGF)和lO-lOOng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。
4.根據權利要求1所述的分化培養基，其中，所述液體基礎培養基選自BME細胞培養基、杜爾貝可改良伊格爾細胞培養基、DMEM/F12細胞培養基、Fischer' s細胞培養基、IMDM 細胞培養基、199細胞培養基、MEM細胞培養基、FlO細胞培養基、F12細胞培養基和1640細胞培養基中的一種或幾種。
5.一種人間充幹細胞分化獲得的少突膠質前體細胞及其增殖的方法，其特徵在於，所述方法使用權利要求1-5中任意一項所述的分化培養基培養所述人間充質幹細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述間充質幹細胞來自人骨髓、臍帶血和臍帶中的一種或幾種。
7.由權利要求1-6所述的方法得到的少突膠質前體細胞。
8.一種製備權利要求7所述的刺五加苷處理試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括1)間充質幹細胞基礎培養基；2)刺五加苷；3)細胞因子(人表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子)；4)消化細胞的酶以及；5)使用說明書。
9.一種用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物，其特徵在於， 所述藥物組合物包括權利要求7-8中任意一項所述的方法獲得的少突膠質前體細胞，以及和藥學上可接受的載體或賦形劑。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的載體，以及以所述注射液體積為基準，1 X IO5至1 X IO8個/毫升的權利要求7-8中任意一項所述的方法獲得的少突膠質前體細胞。
11.根據權利要求10所述的藥物組合物，其中，所述注射液包括以所述注射液體積為基準，5X IO5至5X IO7個/毫升的權利要求7-8中任意一項所述的方法獲得的少突膠質前體細胞。
12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其中，所述藥學上可接受的載體為生理鹽水。
全文摘要
本發明提供了一種刺五加苷處理人間充質幹細胞得到少突膠質前體細胞及其增殖的分化培養基，所述分化培養基包括液體基礎培養基，其中，以所述液體基礎培養基的體積為基準，所述分化培養基還含有1-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生長因子(EGF)和5-300ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)；還提供了使用前述分化培養基的製備該刺五加苷處理試劑盒的方法；還提供了包括前述的方法獲得的少突膠質前體細胞的用於治療神經系統疾病的藥物組合物。使用本發明的分化培養基的本發明的方法能夠高效分化間充質幹細胞，得到少突膠質前體細胞。本發明用於治療創傷性脊髓損傷與多發性硬化症等疾病的藥物組合物能在體內修復損傷的神經細胞，並消除神經系統病變。
文檔編號C12N5/0797GK102337246SQ201110307969
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者沈麗, 王振光, 郝麗敏, 黃啟明 申請人:北京弘潤天源生物技術有限公司