澱粉樣變性疾病的預防和治療的製作方法

2023-12-08 18:57:01 2

專利名稱：澱粉樣變性疾病的預防和治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及人及其他哺乳類脊椎動物澱粉樣變性疾病的治療方法和組合物。
背景技術：
澱粉樣變性是描述一些可以局部或全身地出現的蛋白質原纖維細胞外沉澱，形成許多的「澱粉樣沉澱」的疾病通用術語。這些沉澱的原纖維組分為各種形式的澱粉樣疾病的識別特徵。例如，以主要由β澱粉樣蛋白肽(β-AP)原纖維組成的腦內和腦血管的沉澱為特徵的阿爾茨海默氏病(家族性和偶爾發生的)，以胰島澱粉樣蛋白質肽(IAPP；糊精)為特徵的與II型糖尿病有關的胰島細胞澱粉樣蛋白沉澱中的原纖維，和由於長期的血液透析治療形成的以β2-微球蛋白為主要組分的澱粉樣蛋白沉澱。新近，與蛋白感染素有關的疾病，例如克雅氏病(Creutzfeld-Jacob)，也被認為是澱粉樣蛋白疾病。
主要根據澱粉樣變性病是否與原發性系統疾病有關，將各種形式的疾病分類。因此，某些疾病被認為是原發性澱粉樣變性，先前存在或共存的疾病中並無證據。通常，原發性澱粉樣變性疾病的特徵為存在「輕鏈型澱粉樣蛋白」(AL型)蛋白質原纖維，因此將AL原纖維N-末端區的同源性稱為免疫球蛋白輕鏈的可變的片段(κ或λ)。
二級或「反應性」澱粉樣變性的特徵為源自血清澱粉樣蛋白質A(ApoSSA)的AA型原纖維沉澱。這些澱粉樣變性形式的特徵為原發性慢性炎症或傳染病狀(例如，風溼性關節炎，骨髓炎，肺結核，麻瘋病)。
家族遺傳性的澱粉樣變性可能與ATTR運甲狀腺素蛋白型的神經性的、腎的或心血管的沉澱有關。其他的家族遺傳性的澱粉樣變性包括其他的綜合症，並可能具有不同的澱粉樣組分(例如，以AA原纖維為特徵的家族性的地中海熱)。其他形式的澱粉樣變性包括出現於離體器官的、以病灶的，通常為腫塊樣沉澱為特徵的局部形式。Othere澱粉樣變性與年齡有關，通常以在心或腦形成蝕斑為特徵。澱粉樣沉澱通常也與長期的血液透析有關。這些及其他形式的澱粉樣蛋白病概括於表1(Tan，S.Y.和Pepys，(Histopathology，25403-414，1994；Harrison的Harrison’s Handbook of Internal Medicine，第十三版，Isselbacher，K.J.等，編著，McGraw-Hill，San Francisco，1995)。
a精囊腺外分泌蛋白質通常，形成大部分澱粉樣沉澱的原纖維源自於一種或多種初級前體蛋白質或肽，通常與硫酸鹽化氨基葡聚糖有關。另外，如下文詳述，澱粉樣沉澱可以包括各種型式的較小的蛋白質和肽，以及其他組分，例如含蛋白多糖，神經節苷脂和其他糖。
目前，對於任何澱粉樣疾病沒有特效的、直接針對澱粉樣疾病的治療。對於原發疾病或相關的疾病狀態，治療是通過治療原發疾病從而減少澱粉樣變性蛋白質的產生。例如，用抗生素治療肺結核，從而減少微生物負荷，導致炎症的減少和相關的SSA蛋白質的減少。對於由多發性骨髓瘤引起的AL澱粉樣變性，化療有助於病人減少漿細胞，降低骨髓瘤免疫球蛋白水平。隨該水平下降，可以清除AL澱粉樣變性。共同擁有的1998年11月30日提出的美國專利申請USSN 09/201,430和1999年5月28日提出的USSN 09/322,289顯示通過給用產生或給予直接針對β澱粉樣變性肽(Aβ)及其片段的藥劑，可以大大地減少(和預防)與阿爾茨海默氏病有關的澱粉樣血小板負荷。本發明發現誘導針對各種澱粉樣血小板組分的免疫反應可有效地治療廣譜澱粉樣疾病。
發明概述本發明涉及用於治療多種澱粉樣疾病的藥物組合物和方法。本發明一個方面包括一種藥物組合物，其中包括活性成分，即有效地誘導病人的針對澱粉樣的成分的免疫反應的藥劑。這樣的組合物通常也包括賦形劑，在最優方案中可以包括輔劑。在進一步優選的方案中，輔劑包括，例如，氫氧化鋁，磷酸鋁，MPLTM，QS-21(StimulonTM)或弗氏不完全佐劑。按照有關的實施方案，藥物組合物可以包括有效誘導病人針對超過一種的澱粉樣成分的免疫反應的藥劑。
在有關的實施方案中，藥劑有效地產生直接針對原纖維肽或蛋白質澱粉樣成分的免疫反應。優選這樣的原纖維肽或蛋白質源自於如本文所描述的，已知與某些形式的澱粉樣疾病有關的原纖維前體蛋白。這樣的前體蛋白質包括，但不局限於血清澱粉樣A蛋白質(ApoSSA)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、ApoAI、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、纖維根(fibrogen)α鏈、凝溶膠蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、澱粉樣β蛋白質前體(β-APP)、β2微球蛋白、蛋白感染素前體蛋白(PrP)、心鈉素、角蛋白、胰島澱粉樣多肽、肽類激素和合成核素(synuclein)。這樣的前體也包括突變株蛋白質、蛋白質片段和這樣的前體的溶解蛋白肽。在一個優選方案中，藥劑有效地誘導直接針對由有關原纖維前體蛋白的原纖維蛋白質或肽形成的新的表位的免疫反應。即，如本申請更詳細的描述，許多形成原纖維的肽或蛋白質是如上述的這樣的前體蛋白質的片段。當例如通過溶解蛋白分裂形成這樣的片段時，表位可能顯示不存在該前體，因此當片段是前體蛋白的一部分時，表位對免疫系統不具有免疫可用性。針對這樣的表位的藥劑可能是優選的治療劑，因為它們誘導病人的自身免疫反應的可能性更小。
按照有關實施方案，本發明藥物組合物包括針對澱粉樣組分的藥劑，這些組分例如選自，但不限於下列原纖維肽或蛋白質AA、AL、ATTR、AapoAl、Alys、Agel、Acys、Aβ、AB2M、Ascr、Acal、AIAPP和合成核素-NAC片段。這些肽的全稱和組成描述於此。如本申請所述，這樣的肽可按照本領域眾所周知的方法製備。
按照另一個有關的實施方案，在這樣的藥物組合物中包含的藥劑也包括某些硫酸鹽化含蛋白多糖。在一個有關的實施方案中，該含蛋白多糖是硫酸肝素氨基多糖，優選基底膜聚糖、硫酸皮膚素、軟骨素-4-硫酸酯或戊聚糖多硫酸酯。
按照另一個有關方面，本發明包括預防或治療哺乳動物患者的澱粉樣的沉澱病症的方法。按照本發明的該方面，對患者給用有效量的藥劑，使其產生針對患者患有的以澱粉樣的病症為特徵的澱粉樣組分的免疫反應。本質上來講，該方法包括給用包含如上所述的對上述病症特效的致免疫的澱粉樣組分的藥物組合物。這樣的方法的另外的特徵是有效地誘導患者的致免疫反應。按照一個優選方案，該方法產生有效的免疫學反應，該反應的特徵是相對於致免疫藥劑直接針對的澱粉樣組分的血清滴定度至少為1∶1000。在另一優選方案中，對於原纖維成分的最小血清滴定度為1∶5000。按照一個有關實施方案，免疫反應的特徵為免疫活性血清的量比在預處理對照血清樣品中測量的免疫活性的血清水平高四倍。後面的特徵特別適於通過ELISA技術測量血清免疫活性，但是它也可適用於任何相對的或絕對的血清免疫活性的測量。按照優選方案，在血清稀釋約1∶100時測量免疫活性。
按照另一個有關方面，本發明包括確定正在進行澱粉樣病症治療的患者預後的方法。此時，測量針對以選定的病症為特徵的澱粉樣組分的病人免疫活性的血清量，並且病人血清的免疫活性至少為血清免疫活性的基線對照水平的4倍，說明與特定澱粉樣病症相關的預後狀態得到改善。按照優選方案，針對存在於患者血清中的選定的澱粉樣的成分的免疫活性的量的特徵為關於澱粉樣的成分具有至少約1∶1000，或至少1∶5000的血清滴定度。
按照另外的有關方面，本發明也包括用於預防或治療澱粉樣的疾病的所謂的「被動免疫」方法和藥物組合物。按照本發明的這個方面，對病人給用有效劑量的與選擇的澱粉樣的成分特異結合的抗體，優選存在於作為被治療疾病特徵的澱粉樣沉澱中的原纖維成分。通常，選擇這樣的抗體是因為它們具有特異結合本申請前述的藥物組合物和方法中描述的各種的蛋白質、肽和組分的能力。按照有關實施方案，這樣的方法和組合物可以包括結合至少兩個澱粉樣的原纖維組分的抗體的組合。通常，給用藥物組合物可使針對目標澱粉樣成分的血清免疫活性量比針對對照血清樣品中測量的血清免疫活性水平高至少約四倍。如本申請所述，給用抗體時可能同時使用載體。通常，按照本發明的這個方面，這樣的抗體可通過腹膜、口服、鼻腔內、皮下、肌內、局部或靜脈內給藥(或為給藥將抗體製成製劑)，但是可以通過任何藥學上有效的途徑(即，如上述及此處所述，可有效地產生明顯的治療水平)給藥或製成製劑。
按照有關實施方案，治療抗體可能通過給用一種編碼至少一個抗體鏈的多核苷酸進行給藥。按照本發明的這個方面，在患者體內該表達多核苷酸以在患者體內產生藥學上有效量的抗體鏈。這樣的多核苷酸可以編碼抗體的重鏈和輕鏈，從而在患者體內產生重鏈和輕鏈。
按照優選方案，上面描述的免疫療法可以包括按照本領域已知方法，或按照患者需要，根據免疫學的反應評定以多劑量給用包括抗體在內的藥劑，例如6月以上的周期，例如首次免疫一定間隔後例如6星期間隔加強注射。選擇性地，或另外這樣的療法可以包括使用「持續釋放」製劑，如本領域已知的那些。
當結合附圖閱讀下列本發明的詳細說明時，更容易理解本發明的這些及其他目的和特徵。
附圖的簡要描述

圖1用Aβ-42注射後轉基因小鼠的抗體滴定度。
圖2海馬體中的澱粉樣蛋白的負荷。通過腦切片免疫活性的計算機輔助定量圖像分析測定澱粉樣的斑點佔據海馬體面積的百分比，由與Aβ-特異的單克隆抗體3D6的反應性定義。個體小鼠的數值顯示為按處理組排序。各組水平線表示分布的中值。
圖3海馬體中的神經炎性營養不良。通過免疫活性腦切片的計算機輔助定量圖像分析測定營養不良的軸突佔據海馬體面積的百分比，由與人體APP特異的單克隆8ES的反應性定義。個體小鼠的數值顯示為AN1792處理組和PBS處理控制組。各組水平線表示分布的中值。
圖4脾後皮層中的星形細胞增生。通過免疫活性腦切片定量計算機輔助圖像分析測定神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP〕陽性星形細胞佔據皮層面積的百分比。通過處理組排序方式顯示個體小鼠的值，水平線表示中間組值。
圖5用包括0.14，0.4，1.2，3.7，11，33，100或300μg的八種劑量的Aβ42(「AN1792」)免疫後的Aβ42幾何平均抗體滴定度。
圖6AN1792免疫的抗體反應動力學。滴定度用每組6隻動物的幾何平均值來表示。
圖7用PBS和用AN1792處理過的小鼠的皮層澱粉樣蛋白負荷的定量圖像分析。
圖8用PBS和用AN1792處理過的小鼠的神經炎斑點負荷的定量圖像分析。
圖9用PBS和用AN1792處理過的小鼠星形細胞增生佔據脾後皮層百分比的定量圖像分析。
圖10用AN 1792處理過(上組)或用PBS處理過(下組)的小鼠的脾細胞淋巴細胞增生試驗。
圖11大腦皮質總的Aβ水平。使用同弗氏佐劑相結合的Aβ或APP衍生物對小鼠進行免疫作用的個體Aβ輪廓分布圖。
圖12通過使用Aβ肽共軛物Aβ1-5、Aβ1-12和Aβ13-28使小鼠免疫的免疫活性腦切片的定量圖像分析測定的皮層澱粉樣的負荷；全長Aβ集合Aβ42(「AN1792」)和Aβ1-40(「AN1528」)和PBS處理對照組。
圖13用同弗氏佐劑相結合的Aβ或APP衍生物免疫的小鼠組的Aβ特異抗體的幾何平均數滴定度。
圖14用同各種輔劑相結合的AN1792或其棕櫚醯基化衍生物免疫作用的豚鼠組的Aβ特異性抗體的幾何平均數滴定度。
圖15(A-E)用含不同輔劑的AN或AN1528處理的12個月大的PDAPP小鼠的皮層Aβ水平。
圖16用Aβ的多克隆抗體處理的小鼠的平均滴定度。
圖17用Aβ的單克隆抗體10d5處理的小鼠的平均滴定度。
圖18用Aβ的單克隆抗體2F12處理的小鼠的平均滴定度。
發明的詳細說明A.定義除非另有說明，本申請使用的全部術語具有與本發明領域技術人員已知的相同的含義。專業人員可具體參照Sambrook等的MolecularCloning(1989)A Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.，和Ausubel，F.M.等的Current Protocols inMolecular Biology(1998)，John Wiley Sons，New York，NY中生物化學和分子生物學領域已知的定義、術語和標準方法。當然本發明不局限於特別描述的方法、規定和試劑，因為它們可以變化而產生相同的結果。
術語「輔劑」指當與抗原一起給藥時，會增加抗原的免疫反應，但是當其單獨施用時不產生抗原免疫反應的化合物。輔劑可以通過若干機制包括補充淋巴細胞，刺激B和/或T細胞，以及刺激巨噬細胞增加免疫反應。
「澱粉樣蛋白病」或「澱粉樣變性」指症狀或部分症狀為澱粉樣的斑點病理學累積或形成的所有病症。
「澱粉樣的斑點」是主要由蛋白質的原纖維組成的細胞外的沉澱。通常，原纖維由佔優勢的蛋白質或肽組成；但是如本申請描述，斑點可能也包括另外的肽或非肽分子組分。
「澱粉樣組分」是存在於澱粉樣的斑點中的任何分子實體，包括此種分子的抗原部分。澱粉樣組分包括但是不局限於蛋白質、肽、蛋白聚糖和碳水化合物。「特定的澱粉樣的組分」指主要地或僅在所述的澱粉樣的斑點中發現的分子實體。
「藥劑」是合成的或生物學來源的化學分子。在本發明中，藥劑通常為可被用於藥物組合物的分子。
「抗澱粉樣變性的藥劑」是通過主動或被動免疫技術給藥時，能夠針對脊椎動物患者澱粉樣的斑點組分產生免疫反應的藥劑。
術語「多核苷酸」和「核酸」在本申請可互換使用，指具有可支撐基底的主鏈的聚合分子，該基底可通過氫鍵鍵合到典型的多核苷酸上，該聚合物主鏈具有這樣的基底，它在某種意義上允許可以一系列特殊方式在聚合的分子和典型的多核苷酸(例如，單鏈DNA)之間建立氫鍵。代表性的這樣的基底為次黃嘌呤核苷、腺苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷。聚合的分子包括雙鏈和單鏈RNA和DNA及其主鏈修飾，例如，膦酸甲酯連接。
本申請使用的術語「多肽」指由通過肽鍵連接的單鏈胺基酸殘基組成的化合物。術語「蛋白質」可以與術語「多肽」同義或可以指兩個或更多多肽的複合體。
術語「肽」也指由通過肽鍵連接的胺基酸殘基組成的化合物。通常肽由100或更少胺基酸組成，而多肽或蛋白質具有100個以上的胺基酸。本申請使用的術語「蛋白質片段」也可以指肽。
「原纖維肽」或「原纖維蛋白質」指單體的或集合形式的蛋白質或肽，它們形成存在於澱粉樣的斑點中的原纖維。本申請提供這樣的肽和蛋白質的例子。
「藥物組合物」指適於對哺乳動物個體給藥的化學的或生物學的組合物。這樣的組合物可以為通過一個或多個途徑給藥而製成特殊的製劑，該途徑包括但並非限於口服、腸胃外、靜脈內、動脈內、皮下、鼻腔內、舌下、脊柱內，大腦室內等等。
「藥物賦形劑」或「藥學上可接受的賦形劑」是一種載體，通常是液體，在其中配製活性治療劑。在製劑中賦形劑通常不提供任何藥理學的活性，可是它可以提供化學和/或生物學的穩定性、釋放特性等等。製劑的例子可以從，例如，《雷氏藥物科學》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第19版，Grennaro，A著，1995中找到。
「糖蛋白」是在其上可共價地連接至少一個碳水化合物鏈(寡糖/多糖)的蛋白質。
「含蛋白多糖」是其中至少一個碳水化合物鏈是氨基多糖的糖蛋白，該氨基多糖為重複二糖的長線型聚合物，其中一個通常是糖酸(糖醛酸)，另一個是氨基糖。
術語「免疫學的」或「免疫的」或「致免疫的」反應指脊椎動物個體中針對抗原的體液的(抗體介導的)和/或細胞的(通過抗原特異的T細胞或它們的分泌產品介導的)反應。這樣的反應可以是通過給用免疫原誘導的主動反應，或通過給用抗體或預處理的T細胞誘導的被動反應。通過與Class I或Class II MEC分子相聯繫的多肽表位的表達激活抗原特異的CD4+T輔助細胞和/或CD8+細胞毒性T細胞誘導細胞的免疫反應。該反應也可包括活化單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、嗜鹼細胞、樹狀細胞、星形細胞、小神經膠質細胞、嗜酸性粒細胞或其他先天免疫的組分。通過本領域已知的標準增殖試驗(CD4+T細胞)或CTL(細胞毒性T細胞)試驗可以測定細胞介導的免疫反應的存在。體液反應和細胞反應對免疫原的保護或治療的效果的相對貢獻可以通過分別地離析同種同基因的動物的免疫球蛋白(IgG)和T細胞片斷，並測量第二名患者的保護或治療效果來辨別。
「免疫藥劑」或「免疫原」或「抗原」是對患者給藥後能誘導針對它本身的免疫學反應的分子，既可與輔劑同時使用，也可無輔劑時使用。這樣的分子包括，例如，與載體蛋白如鑰孔血藍素、Cd3或破傷風毒素共軛的澱粉樣的原纖維肽或片段。
「表位」或「抗原決定區」指與抗體的抗原結合區域結合的抗原部分。
術語「Aβ」，「Aβ肽」和「澱粉樣的β」肽是同義的，指一種或多種源自如本申請描述的β澱粉樣的前體蛋白(β APP)約38-43胺基酸的肽組合物。「Aβxx」指澱粉樣的β肽1-xx，其中xx是顯示肽中胺基酸數目的數字；例如Aβ42與Aβ1-42相同，在本申請中也相當於「AN1792」，Aβ40與Aβ1-40相同，在本申請中也相當於「AN1578」。
解聚的或單體的Aβ指可溶解的、Aβ的單體肽單位。一種製備單體Aβ的方法是使用超聲處理將凍幹的肽溶解在純的DMSO中。將所得溶液離心除去不溶性顆粒。聚集的Aβ是其中單體的單位通過非共價鍵結合在一起的低聚物。
術語「裸多核苷酸」指沒有與膠態物質複合的多核苷酸。裸多核苷酸有時在質粒載體中克隆。
術語「患者」包括接受預防或治療的人及其他哺乳動物患者。
術語「顯著不同的」，「統計上顯著的」，「顯著地高(或低)」和類似的字句指數據或其它測量值之間的比較，其中兩個比較的個體或組的差異對於有訓練的觀測者顯著地或相當不同，或統計上顯著(如果本短語包括術語「統計上地」或如果有一些統計試驗的指標，例如p-值或通過本領域已知的標準統計檢驗分析時，數據產生統計的差異)。
「包括」一種或多種敘述要素的組合物或方法可以包括其他的不特定敘述的要素。例如，包括原纖維成分肽的組合物也包括離析肽和作為較大的多肽序列的組分的肽。還例如包括要素A和B的組合物也包括由A，B和C組成的組合物。
B.澱粉樣的疾病1.綜述和發病機理澱粉樣的疾病或澱粉樣變性包括一些具有各式各樣的外在症狀的疾病狀態。這些病症都具有蛋白質原纖維的反常細胞外沉澱，稱為「澱粉樣沉澱」或「澱粉樣斑點」，它們的直徑通常約10-100μm，位於特定的器官或組織區域。這樣的斑點主要由天然的可溶解的蛋白質或肽組成。這些不溶的沉澱通常由直徑為大約10-15nm的原纖維側向聚集體組成。當用剛果紅染料著色時，澱粉樣原纖維在偏振光下產生特有的蘋果綠雙折射。如下所述，根據形成斑點沉澱的主要原纖維組分將病症分類。
形成斑點沉澱的肽或蛋白質經常由較大的前體蛋白產生。更具體地說，澱粉樣的原纖維沉澱的發病機理通常包括「反常的」前體蛋白溶解蛋白分裂成片段。這些片段通常聚集變成逆平行β摺疊片；可是，在家族性澱粉樣多發性神經病(變體運甲狀腺素蛋白原纖維)和與滲析有關的澱粉樣變性(β2微球蛋白原纖維)中，某些前體蛋白的未離解形式聚集並形成原纖維(Tan等，1994，同上)。
2.臨床綜合症本部分描述主要的澱粉樣變性類型，包括它們特有的斑點原纖維成分。本發明發現，可以通過給與用來刺激針對各種病原特異的澱粉樣的沉澱的一種或多種組分的免疫反應的藥劑治療澱粉樣的疾病。如下面C章節更詳細的論述，這樣的組分優選是形成斑點的原纖維的組分。以下章節用來例舉主要的澱粉樣變性的形式，但並不打算限制本發明。
a.AA(反應性)澱粉樣變性通常，AA澱粉樣變性是引起持續急性階段反應的疾病的表現形式。這樣的疾病包括慢性的炎症性的病症、慢性的局部或全身的微生物感染和惡性腫瘤。
AA原纖維通常由通過血清澱粉樣的A蛋白質(apoSSA)，一種存在於HDL粒子並且響應如IL-1，IL-6和TNF的細胞活素而合成的循環脫脂蛋白，溶解蛋白切割形成的8000道爾頓片段(AA肽或蛋白質)組成。沉澱可在身體內廣泛分布，尤其是實質器官。脾為常見的沉澱位置，並且也可能影響腎。沉澱也常見於心臟和胃腸道。
AA澱粉樣疾病包括，但是不局限於炎症性的疾病，例如類風溼性的關節炎、少年慢性關節炎、僵硬性脊椎炎、牛皮癬、牛皮癬性關節病、瑞特氏綜合症、成人斯蒂爾病、貝切特氏綜合症和克羅恩氏病。AA沉澱也產生於慢性的微生物感染，例如麻瘋病、肺結核、支氣管擴張、褥瘡、慢性腎盂腎炎、骨髓炎和惠普爾病。某些惡性腫瘤也會導致AA原纖維澱粉樣沉澱。其中包括如霍奇金淋巴瘤、腎癌、腸癌、肺癌和泌尿生殖道癌、皮膚基底細胞癌和毛細胞白血病。
b.AL澱粉樣變性AL澱粉樣的沉澱通常與幾乎所有B淋巴細胞血統的體液不調有聯繫，從漿細胞惡性腫瘤(多發性骨髓瘤)到良性的單株丙種球蛋白病。有時，澱粉樣沉澱的存在可能是原發性體液不調的主要指標。
AL澱粉樣沉澱的原纖維由單克隆免疫球蛋白輕鏈或其片段組成。更具體地說，該片段源自於輕鏈(κ或λ)的N-末端區域並包含全部或一部分可變的(V1)範圍。沉澱通常出現於間葉組織，導致周圍和自發神經病、腕管綜合症、舌肥大、限制性心肌病、大關節關節病、免疫的體液不調、骨髓瘤以及隱性體液不調。可是，應當注意到可能包括幾乎所有組織，特別是臟器，例如心臟。
C.遺傳性的系統性澱粉樣變性有許多形式的遺傳性系統性澱粉樣變性。雖然它們相對較少，但是由於症狀從成人開始以及它們的遺傳圖譜(通常染色體佔優勢)，導致這樣的病症在總人口中持久存在。通常，該綜合症可歸因於導致產生變體澱粉樣變性肽或蛋白質的前體蛋白中的點突變。表2概括了這些病症的示例形式的原纖維組合物。
表2
表2提供的數據是示範性的，並不打算限制本發明的範圍。例如，已經描述了超過40個運甲狀腺素蛋白基因的獨立的點突變，都引起了臨床上相似形式的家族性澱粉樣多發性神經病。
運甲狀腺素蛋白(TTR)是14千道爾頓蛋白質，有時也稱為前清蛋白。它是通過肝臟和脈絡叢產生的，它的功能為運輸甲狀腺激素和維生素A。至少有50種蛋白質變體形式，各以單一胺基酸變化為特徵，是各種形式的家族澱粉樣多發性神經病的原因。例如，在丹麥病人中，將位置55的亮氨酸置換為脯氨酸導致特別的進行性神經病形式；將位置111的亮氨酸置換為甲硫氨酸導致嚴重的心臟病。從系統性澱粉樣變性病人心臟組織分離的澱粉樣的沉澱顯示該沉澱由TTR和其片段的非均勻混合物組成，總起來稱為ATTR，其全長序列已經被鑑定。ATTR原纖維組分可以從這樣的斑點中提取，可按照本領域已知的方法例如，Gustavsson，A.等，Laboratory Invest.73703-708，1995；Kametani，F.等，「生物化學、生物物理研究通訊」(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，125622-628，1984；Pras，M.等，PNAS 80539-42，1983)測定它們的結構和序列。
在分子脫脂蛋白AI中具有點突變(例如，Gly→Arg6；Trp→Arg50；Leu→Arg60)的人顯示以蛋白質脫脂蛋白AI或其片段(AApoAI)沉澱為特徵的澱粉樣變性(「奧斯特塔格型」)。這些病人具有低水平的高密度脂蛋白(DHL)，並存在周圍神經病或腎衰竭。
在溶菌酶的α鏈中的突變(例如，Ile→Thr56或Asp→His57)是在英國家庭中報導的奧斯特塔格型非神經性的遺傳性澱粉樣變性的另一個形式。這裡，突變株溶菌酶蛋白質(Alys)的原纖維沉澱，病人通常顯示削弱的腎功能。這種蛋白質不同於本申請描述的大多數形成原纖維的蛋白質，通常以整體形式(非片段)存在(Benson，M.D.等，CIBA Fdn.Symp.199104-131，1996)。
β-澱粉樣的肽(Aβ)是通過解朊作用從稱為β澱粉樣的前體蛋白(βAPP)的大蛋白質衍生而來的39-43胺基酸肽。βAPP中的突變導致阿爾茨海默氏病、唐氏綜合症和/或老年性痴呆的家族形式，其特徵為由Aβ原纖維及其他組分組成的大腦斑點沉澱，這將在以下更詳細地描述。與阿爾茨海默氏病有關的已知的APP中的突變發生於β或γ分泌酶切割位點的附近，或Aβ內部。例如，位置717距APPγ-分泌酶切割轉化為Aβ的位置很近，而位置670/671距β分泌酶切割的位置最近。通過增加從APP產生的Aβ形式的42/43胺基酸的數量，在任何殘基上的突變都可能導致阿爾茨海默氏病。各種長度的Aβ肽的結構和序列在本領域為大家所熟知。可按照本領域已知的方法(例如Glenner和Wong，Biochem Biophys.Res.Comm.129885-890，1984；Glenner和Wong，Biochem Biophys.Res.Comm.1221131-1135，1984)製備這樣的肽。另外，各種形式的肽可以購得。
合成核素是與脂蛋白類似的與突觸有關的蛋白質，有很多神經元細胞溶質和突觸前的末端。源自α-合成核素的肽片段，稱為NAC，也是阿爾茨海默氏病澱粉樣斑點的組分。(Clayton，等，1998)。如下文詳細描述，這些組分也是本發明免疫治療的目標。
凝溶膠蛋白是鈣結合蛋白，與肌動蛋白微絲結合併將其打斷。在蛋白質位置187的突變(例如，Asp→Asn；Asp→Tyr)導致遺傳性的系統性澱粉樣變性的形成，通常發現於芬蘭，以及荷蘭或日本患者。在患病的個體中，由凝溶膠蛋白片段(Agel)形成的原纖維，通常由胺基酸173-243(68kDa羧基末端片段)組成，在血管和基底膜沉澱，導致角膜營養不良和頭蓋神經病，並發展為周圍神經病、皮膚營養不良以及在其他器官的沉澱。(Kangas，H.等，人類分子遺傳學(Human Mol.Genet.)5(9)1237-1243，1996)。
其他突變的蛋白質例如纖維蛋白原的突變株α鏈(AfibA)和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C突變株(Acys)也形成原纖維，並產生特有的遺傳性的病症。AfibA原纖維形成特徵為並發腎病的非神經性遺傳性澱粉樣沉澱；Acys沉澱的特徵為冰島報導的遺傳性大腦澱粉樣血管病。(Isselbacher，等，Harrison′s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，San Francisco，1995；Benson，等，同上)。在至少某些情況下，具有大腦澱粉樣血管病(CAA)的病人已經顯示具有包含與β蛋白質結合的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C非突變株的澱粉樣的原纖維(Nagal，A.等，Molec.Chem.Neuropathol.3363-78，1998)。
蛋白感染素疾病的某些形式現在被認為是可遺傳的，這解釋了至多15％的情況，它們以前被認為主要是傳染性的。(Baldwin等，《阿爾茨海默氏病及相關疾病的研究進展》(Research Advances in Alzheimer’s Disease and Related Disorders)，JoIm Wiley and Sons，New York，1995)。在這樣的蛋白感染素病症中，病人生長了由正常蛋白感染素蛋白質(PrPc)的反常的異構體組成的斑點。一種主要的突變株異構體PrPSc，也稱為AScr，與正常細胞的蛋白質的不同之處在於它對抗蛋白酶退化，在抽出溶劑後不溶解，在次級溶酶體中沉澱，平移後接合以及具有高β-摺疊片含量。遺傳連鎖發展了至少五種突變，導致克雅氏症(CJD)，格-施-沙綜合症(GSS)和致命家族性失眠(FFI)。Baldwin從癢病原纖維提取原纖維肽，測定序列以及製備這樣的肽的方法在本領域是已知的。(例如Beekes，M.等，J.Gen.Virol.762567-76，1995)。
例如，一種GSS形式與遺傳密碼102位置的PrP突變有關係，而終腦(telencephalic)GSS與遺傳密碼117位置的突變隔離。在遺傳密碼198和217位的突變導致的GSS形式中，作為阿爾茨海默氏病特徵的神經炎斑點包含PrP代替了Aβ肽。家族性CJD的某些形式與遺傳密碼200和210位的突變有聯繫；已經在家族性CJD和FFI找到遺傳密碼129和178位的突變(Baldwin，同上)。
d.老年系統性澱粉樣變系統的或局部的澱粉樣沉澱隨著年齡增加而增加。例如，野生型運甲狀腺素蛋白(TTR)原纖維通常發現於年長個體的心臟組織中。它們可能無症狀，臨床上無反應，或可以導致心力衰竭。無症狀的原纖維局部的沉澱也可能出現在腦部(Aβ)、前列腺的全部澱粉樣蛋白(Aβ2微球蛋白)、關節和精囊腺中。
e.大腦的澱粉樣變性澱粉樣的局部沉澱常見於腦，尤其是年長的個體。腦部最常見類型的澱粉樣蛋白主要由Aβ肽原纖維組成，導致痴呆或突發性(非遺傳性的)阿爾茨海默氏病。事實上，突發性阿爾茨海默氏病的發生率大大地超過遺傳性的形式。關於阿爾茨海默氏病的遺傳性類型(AD)，形成這些斑點的原纖維肽非常類似於上面的描述。
f.與透析有關的澱粉樣變性由β2微球蛋白(Aβ2M)原纖維組成的斑點通常發生在長期接受血液透析或腹膜透析的病人中。β2微球蛋白是11.8千道爾頓多肽，存在於所有的有核細胞中的Class I MHC抗原的輕鏈。在正常的環境下，它連續地從細胞膜脫落並通常被腎過濾。間隙破壞，例如腎功能損傷，導致在腎及其他位置(主要是關節的富含膠原的組織)沉澱。與其他的原纖維蛋白質不同，Aβ2M分子通常以非片段形式存在於原纖維中(Benson，同上)。
g.激素衍生的澱粉樣變性內分泌器官可以藏匿澱粉樣的沉澱，尤其是在老化的個體中。分泌激素的腫塊可能同時包含激素衍生的澱粉樣的斑點，其中原纖維由多肽激素例如降血鈣素(甲狀腺髓樣癌)、胰島澱粉樣多肽(糊精；出現在大多數II型糖尿病患者中)和心鈉素(分離的前房澱粉樣變性)組成。這些蛋白質的序列和結構在本領域為大家所熟知。
h.混雜的澱粉樣變性有多種其他澱粉樣蛋白病的形式，通常表現為澱粉樣蛋白的局部化沉澱。通常來講，這些疾病可能源自特定的原纖維前體的局部化產生和/或分解代謝的缺少或特定的組織(例如關節)形成原纖維沉澱的傾向性。這樣的自發沉澱的例子包括小節的AL澱粉樣變性、皮膚的澱粉樣變性、內分泌的澱粉樣變性和與腫瘤有關的澱粉樣變性。
C.藥物組合物本發明發現能夠誘導或提供針對澱粉樣斑點的某些組分的免疫反應的組合物可有效地治療或預防澱粉樣的疾病的發展。特別是，按照本申請提供的發明，當給予患者免疫刺激劑量的抗澱粉樣變性藥劑，或相應的抗澱粉樣的免疫試劑時，可預防症狀的發展，改善症狀和/或減少患者澱粉樣的斑點負荷。本節描述產生主動的以及被動的對澱粉樣的斑點的免疫反應的抗澱粉樣變性藥劑的例子，並提供顯示在澱粉樣的斑點負荷上使用這樣的組合物的治療效果的示例數據。
通常，如上述章節所述和下面的例證，本發明抗澱粉樣蛋白的藥劑由特定的斑點組分，優選原纖維形成組分，通常是特有的蛋白質，肽或其片段組成。更一般來說，本發明使用的治療劑產生或誘導針對斑點，或更特別地，其原纖維組分的免疫反應。因此這樣的藥劑包括，但是不局限於誘導抗體和/或與抗體交叉反應的組分本身和其變體，類似物和模擬物，以及與澱粉樣組分特異反應的抗體或T細胞。按照本發明一個重要的特徵，藥物組合物不選自非特異性的組分，即通常循環於體內或遍及體內的組分。例如，血清澱粉樣蛋白(SAP)是在肝臟產生的循環血漿糖蛋白，它與大多數已知形式的澱粉樣沉澱結合。治療組合物優選涉及這些組分。
當給用免疫原誘導抗體或T細胞與患者組分反應時，免疫反應可以是主動的，當給用本身與患者組分結合起來的抗體時，免疫反應可以是被動的。誘導或產生針對澱粉樣的斑點的免疫反應的藥劑的例子在以下章節描述。
除致免疫的藥劑之外，本發明藥物組合物可以包括有效量的輔劑和/或賦形劑。藥學上有效的有用的輔劑和賦形劑在本領域為大家所熟知，在下述的章節將更詳細地描述。
I.免疫刺激藥劑(主動免疫反應)a.抗原纖維組合物普通類優選的抗澱粉樣變性藥劑由源自澱粉樣的原纖維蛋白質的藥劑組成。如上所述，澱粉樣的疾病的標誌是主要由原纖維組成的在器官或澱粉樣的斑點的器官中的沉澱，該原纖維又由特定的原纖維蛋白質或肽組成。按照本發明，這樣的原纖維或肽組分是誘導抗澱粉樣免疫反應的有用藥劑。
表1和2概括了作為各種澱粉樣的疾病特徵的形成原纖維的蛋白質的例子。按照本發明的這個方面，對患者或易受影響的個體給用免疫刺激組合物，該組合物包括適當的原纖維蛋白質或肽，包括其類似物或片段，可治療或預防澱粉樣蛋白病。
例如，Aβ，亦稱β-澱粉樣的肽，或A4肽(見美國專利4,666,829；Glenner Wong，Biochem.Biophys.Res.Commun.120，1131(1984))，是39-43個胺基酸的肽，是阿爾茨海默氏病特有的斑點的主要成分。Aβ是通過兩個酶，β和γ分泌酶處理較大的蛋白質APP而產生的(見Hardy，TINS 20，154(1997))。
實施例I描述了支持本發明的實驗結果，其中對過量表達在位置717具有突變的人類APP的雜合子轉基因小鼠給用Aβ42肽。這些被稱為「PDAPP小鼠」的小鼠顯示阿爾茨海默氏病樣的病狀，被認為是阿爾茨海默氏病的動物模型(Games，等，《自然》(Nature)373523-7，1995。如在本例中的詳細描述，這些小鼠從約6月齡開始可在腦內檢測到神經病理學斑點，斑點沉澱隨時間而發展。本申請描述的該實驗中，將集合的Aβ2(AN1792)給予小鼠。在大多數被處理的13月齡小鼠(7/9)的腦中沒有檢測到澱粉樣變性，與此相反，在此年齡段對照小鼠(鹽水注射或未經處理的)都顯示顯著的腦澱粉樣蛋白的負荷(圖2)。這些差異在海馬體更明顯(圖3)。處理過的小鼠也顯示顯著的針對Aβ的血清抗體滴定度(全部大於1∶1000，8/9大於1/10,000；圖1，表3A)。通常，在1∶100稀釋試驗中，鹽水-處理小鼠一直顯示小於4-5倍針對Aβ的抗體的本底水平，因此認為相對於對照組沒有明顯應答(表3B)。這些研究證明注射形成肽Aβ的特定的原纖維可防止Aβ澱粉樣的斑點沉澱。
血清澱粉樣蛋白(SAP)是產生於肝臟的循環血漿糖蛋白，以依賴鈣的方式與所有形式的澱粉樣的原纖維結合，包括阿爾茨海默氏病中的大腦澱粉樣斑點的原纖維。作為上述實驗的一部分，對一組小鼠注射SAP；這些小鼠對SAP產生了顯著的血清滴定度(1∶1000-1∶30000)，但是對Aβ肽沒有產生可檢測的血清滴定度，產生大腦斑點神經病理學機制(圖2)。
在實施例II詳細描述的另一些實驗證明在5周到約8月齡之間的被處理小鼠中，注射Aβ的致免疫的效果依賴於劑量。在這些小鼠中，抗Aβ肽抗體的平均血清滴定度隨免疫接種數目和劑量增加而增加；可是，四次免疫接種後，測量免疫接種後五天的滴定度高於高劑量(1-300μg)免疫接種，穩定在約1∶10000的水平(圖5)。
實施例III描述支持本發明的另外的試驗，其中在澱粉樣的斑點已經存在於PDAPP模型小鼠(約11月齡)的腦中之後，在一個時間點用Aβ42處理它們。在這些研究中，用Aβ42或鹽水使動物免疫，該動物在15或18月齡時為進行澱粉樣的負荷試驗被殺死。圖7說明，在18月齡，用Aβ42處理的小鼠表現出比PBS處理的18個月大對照動物(斑點負荷，4.7％)或者12月大的未經處理的動物(0.28％)明顯低的平均澱粉樣的斑點負荷(斑點負荷，0.01％)，如部分8的實施例XIII詳細描述，其中斑點負荷通過圖像分析測量。這些實驗證明本發明治療方法在減少患病個體的斑點負荷和預防斑點負荷發展很有效果。
按照本發明的這個方面，治療劑源自於包含作為所研究疾病特徵的斑點的原纖維肽或蛋白質。作為選擇，從抗原的角度看，這樣的藥劑與這樣的組分足夠相似，可以誘導與原纖維組分交叉反應的免疫反應。表1和2提供了這樣的原纖維肽和蛋白質的例子，其中組合物和序列在該領域是已知的，或可以按照本領域已知的方法方便地測定(見下面引用的參考文獻和特別地講授各種原纖維肽組分的提取方法和/或組合物的章節B2；另外的原纖維組分的例子描述如下)。
因此，按照本發明，以臨床檢查和/或活組織檢查為基準，進行澱粉樣蛋白病的診斷時，熟練的專業人員能夠確定澱粉樣沉澱的原纖維組成，並提供誘導針對原纖維肽或蛋白質的免疫反應的藥劑。
例如，如上所述，用於治療阿爾茨海默氏病或其他的以Aβ沉澱為特徵的澱粉樣疾病的治療劑可以是任何天然存在的Aβ肽形式，特別是人類形式(即，Aβ39，Aβ40，Aβ41，Aβ42或Aβ43)。這些肽的序列及它們與APP前體的關係在本領域是已知的，並且在本領域為大家所熟知(例如，Hardy等，TINS 20，155-158(1997))。例如，Aβ42具有如下序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.(SEQ ID NO1)Aβ41，Aβ40和Aβ39不同於Aβ42，它們分別在該肽C末端缺失Ala，Ala-Ile和AlaIle-Val。Aβ43不同於Aβ42，其在C末端存在蘇氨酸殘基。按照本發明優選方案，治療劑會誘導針對所研究疾病的全部的或一部分原纖維組分的免疫反應。例如，優選的Aβ致免疫的組合物是誘導Aβ的游離N-末端的特異抗體的藥劑。這樣的組合物的優點是不能識別前體蛋白β-APP，從而較少可能產生自體免疫。
作為另外的例子，可以適當地用AA肽，血清澱粉樣蛋白質(ApoSSA)的一種已知的8千道爾頓的片段，治療如上所述的以AA原纖維沉澱為特徵的疾病，例如，某些慢性炎症、慢性的局部或全身的微生物感染和惡性腫瘤。AA澱粉樣疾病的例子包括，但是不局限於，炎症性的疾病例如類風溼性關節炎、少年慢性關節炎、僵硬性脊椎炎、牛皮癬、牛皮癬性關節病、瑞特氏症候群、成人斯蒂爾病、貝切特氏綜合、克羅恩氏病，慢性微生物的感染例如麻瘋病、肺結核、支氣管擴張、褥瘡、慢性腎盂腎炎、骨髓炎和惠普爾病，以及惡性腫瘤例如霍奇金氏淋巴瘤、腎癌、腸癌、肺癌、泌尿生殖道癌、皮膚基底細胞癌和毛細胞白血病。
AA肽指一個或多個源自澱粉樣A血清前體蛋白(ApoSSA)的N-末端的肽，開始於前體蛋白的1，2或3殘基，終止於殘基58和84之間的任一點；通常AA原纖維由ApoSSA的1-76殘基組成。按照在本領域眾所周知的方法，可以測定精確的結構和組成，併合成適當的肽(Liepnieks，J.J.，Biochem.Biophys Acta 127081-86，1995)。
作為另外的例子，源自其中包含免疫球蛋白輕鏈(κ或λ鏈)的全部或一部分可變(V1)區域的N-末端區域的片段通常包含間葉組織中的澱粉樣的沉澱，導致周圍的和自發的神經病、腕管症候群、舌肥大、限制性心肌病、大關節關節病、免疫體液不調、骨髓瘤以及隱蔽的體液不調。本發明組合物優選地誘導針對一部分輕鏈的免疫反應，優選針對「新表位」減少可能的自身免疫作用，「新表位」是由於母體分子形成片段而形成的。
可使用本發明方法治療各種遺傳性澱粉樣疾病。這樣的疾病描述於上述章節B.2。例如，各種形式的家族性澱粉樣多發性神經病起源於運甲狀腺素蛋白(TTR)的至少五十種突變株形式，各自的特徵為單一胺基酸變化，TTR是一種通過肝臟產生的14千道爾頓蛋白質。雖然許多這類疾病可根據它們特定的病狀和/或人口統計起源區別，但是治療組合物也可由誘導針對超過一個的TTR形式，如兩個或更多包括野生型TTR的ATTR形式的混合物形式的免疫反應的藥劑組成，以提供通用的治療組合物。
含AapoAI的澱粉樣沉澱在分子脫脂蛋白AI中具有點突變的人中發現。具有這種疾病形式的病人通常存在周圍神經病或腎衰竭。按照本發明，治療組合物由一個或多個本申請描述的或本領域已知的不同AapoAI形式組成。
某些家族形式的阿爾茨海默氏病，以及唐氏綜合症，是β澱粉樣的前體蛋白突變，導致具有主要由β澱粉樣肽(Aβ)組成的原纖維斑點的沉澱的結果。如上文和本申請實施例所述，本發明治療組合物中使用Aβ肽。
治療上述遺傳性類型的澱粉樣變性的其他的劑型包括產生針對凝溶膠蛋白片段的免疫反應，以治療遺傳性的系統性澱粉樣變性的組合物，產生針對溶菌酶蛋白質突變株(Alys)的免疫反應以治療遺傳性神經病，產生針對纖維蛋白原(AfibA)的突變株α鏈的免疫反應以治療非神經形式的澱粉樣變性如腎病，產生針對突變株抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(Acys)的免疫反應以治療冰島報導的遺傳性大腦血管病。另外，某些遺傳性類型的蛋白感染素疾病(例如克雅氏症(CJD)、格-施-沙綜合症(GSS)和致命性家族失眠(FFI))的特徵為蛋白感染素蛋白質的突變株異構體，PrPSc。按照本發明，這種蛋白質可被用於治療和預防PrP斑點沉澱的治療組合物中。
如上所述，全身的或局部的澱粉樣沉澱也與年齡增長有聯繫。根據本發明另外的方面，通過對敏感個體給用由與這樣的年齡增長有關的一種或多種蛋白質組成的組合物，可以預防或治療這樣的沉澱。因此，由源自野生型TTR的ATTR組成的斑點經常地在老年人心臟組織中發現。同樣地，某些年長的個體可能在他們的腦中生長無症狀的原纖維局部沉澱；如本申請詳細描述，Aβ肽治療可以應用於這樣的個體。β2微球蛋白是前列腺全部澱粉樣蛋白的常見的組分，因此是本發明另外一種候選藥劑。
作為另外的例子然而並非限制，本發明治療方法可選擇另一些非遺傳性類型的澱粉樣蛋白病。β2微球蛋白原纖維斑點通常生長於長期接受血液透析或腹膜透析的病人中。按照本發明，這樣的病人可通過針對β2微球蛋白，或更優選針對其致免疫的表位的組合物治療。
分泌激素的腫瘤可能也包含激素衍生的澱粉樣的斑點，其組成通常為特別的內分泌器官的特徵。因此這樣的原纖維可能由多肽激素如降血鈣素(甲狀腺髓樣癌)、胰島澱粉樣多肽(出現於大多數II型糖尿病患者中)和心鈉素(分離的前房澱粉樣變性)組成。本發明也設計了針對在主動脈內膜動脈粥樣硬化中形成澱粉樣沉澱的組合物。例如，Westermark等描述了一種形成這樣的斑點的69個胺基酸的脫脂蛋白A的N-末端片段(Westermark等Am.J.Path.1471186-92，1995)；本發明治療組合物包括針對這樣的片段的免疫學的試劑以及該片段本身。
上述討論集中在可以用作治療或預防各種形式的澱粉樣蛋白病的治療藥劑的原纖維組分上。該治療劑也可以是包含誘導使用藥物的人的相似的保護或治療的免疫反應的表位的天然存在的或突變株原纖維肽或蛋白質的活性片段或類似物。致免疫的片段典型地具有至少3，5，6，10或20個鄰近的來自天然肽的胺基酸的序列。示例性的Aβ肽致免疫的片段包括Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，3-7，1-3，1-4，1-12，13-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42。缺乏至少一種，以及有時至少5或10種存在於天然形式的原纖維組分中的C末端胺基酸片段用於某些方法中。例如，缺乏從Aβ43的C末端起的5個胺基酸的片段包括從AB的N-末端起的前38個胺基酸。在某些方法中優選從Aβ的N-末端一半起的片段。類似物包括等位的，特定的和誘導的變體。類似物經常由於存性置換，典型地在一個或一些位置不同於天然存在的肽。類似物典型地顯示至少80或90％與天然肽相同的序列。某些類似物也包括非天然的胺基酸或N或C末端胺基酸修飾物。非天然的胺基酸的例子為α，α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸、4-羥脯氨酸、γ-羧基穀氨酸、γ-N，N，N-三甲基賴氨酸、γ-N-乙醯基賴氨酸、O-磷酸基絲氨酸、N-乙醯絲氨酸、N-甲醯甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸和ω-N-甲基精氨酸。
通常，本領域的專業人員能夠理解可以按照如下所述的與天然存在的原纖維組分的交叉活性和/或在轉基因動物中的預防或治療效能，篩選按照本發明該方面的片段和類似物。如果它們的免疫活性和動物模型效果大致相當於或大於澱粉樣的原纖維組分相應的參數，這樣的片段或類似物可用於本發明的治療組合物。
這樣的肽，蛋白質或片段，類似物及其他澱粉樣變性肽，可以按照本領域眾所周知的標準方法，通過固相肽合成或重組體表達合成，或可以從天然源中獲得。通過引用許多參考文獻並結合對特定的原纖維組分的描述，提供了典型的原纖維組合物、原纖維提取方法及原纖維肽或蛋白質組分的序列。另外，其他的組合物、序列提取和測定的方法在本領域是已知的，需要製造和使用這樣的組合物的人可以採用它們。肽自動合成儀可用來製造這樣的組合物，它可在市場上從許多製造商，如Applied Biosystems(Perkin Elmer；Foster City，California)買到，製備合成肽的方法在本領域是已知的。可以在細菌如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞內進行重組體表達；作為選擇，可以在本領域已知的體外轉譯系統中用自由細胞製造蛋白質。重組體表達方法描述於Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)A LaboratoryManual(C.S.H.P.Press，NY 2d ed.，1989)。某些肽和蛋白質也是可以買到的；例如，從供應商如美國肽公司(American Peptides Company，Inc.)，Sunnyvale，California，和Califomia Peptide Research，Inc.Napa，California可買到某種形式的Aβ肽。
治療劑也可以由更長的多肽組成，多肽包括例如，活性肽原纖維片段或類似物，和其他的胺基酸。例如，Aβ肽可以是完整的APP蛋白質或其部分，如從Aβ的N-末端開始延伸至APP末端的C-100片段。這樣的多肽可以在如下所述動物模型中篩選預防或治療效能。Aβ肽、類似物、活性的片段或其他的多肽可以協作方式給藥(即，作為一種澱粉樣的肽)或以分離形成給藥。治療劑也可以包括單體致免疫藥劑或結合體或載體蛋白質的多聚體，和/或如上所述，可以被加到其他的原纖維組分中，以提供大範圍的抗澱粉樣斑點的活性。
在進一步的變化中，致免疫的肽，如Aβ片段，可以作為致免疫的組合物的一部分被病毒或細菌表達。一個編碼致免疫肽的核酸被合入到病毒或細菌的基因組或游離基因中。選擇性地，核酸以一種方式合入，使得致免疫的肽表達為分泌性蛋白質或具有病毒外表面蛋白質的融合蛋白或細菌跨膜蛋白質，以便顯示肽。此類方法使用的病毒或細菌應該是非病源性的或被稀釋的。適當的病毒包括腺病毒、HSV、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒及其他α病毒，水泡性口膜炎病毒及其他棒狀病毒，牛痘和雞痘。適當的細菌包括沙門氏菌和志賀氏菌屬。致免疫的肽與HBV的HBsAg融合是特別適當的。治療劑也包括未必具有與Aβ顯著類似的胺基酸序列但可充當Aβ模擬物並誘導相似的免疫反應的肽和其他化合物。例如，任何形成β-摺疊片的肽和蛋白質都可以用來篩選適用性。也可使用針對Aβ或其他澱粉樣變性肽的單克隆抗體的抗特應抗體。這樣的抗特應抗體摹擬抗原並產生對它的免疫反應(見《基礎免疫學》(Essential Immunology)(Roit著，Blackwell ScientificPublications，Palo Alto，第6版)，p.181)。除Aβ肽以外的藥劑應當誘導針對一個或多個上列的Aβ的優選的部分(例如，1-10，1-7，1-3，和3-7)的致免疫反應。優選地，此類藥劑誘導特別針對特定片段而不針對Aβ的其他的部分的致免疫反應。
也可使用肽或其他化合物的隨機文庫來篩選適用性。可以製備組合文庫以提供多種可通過逐步合成方式合成的化合物。這樣的化合物包括多肽、β-轉動模擬物、聚糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳族化合物、雜環化合物、苯並二氮雜、寡聚N-取代的甘氨酸和寡氨基甲酸酯。按Affymax，WO 95/12608，Affymax，WO 93/06121，哥倫比亞大學，WO 94/08051，藥典(Pharmacopeia)，WO 95/35503和Scripps，WO 95/30642(各自引作參考文獻)描述的方法，化合物的大組合庫可以通過編碼合成庫方法(ESL)構造。通過噬菌體展示方法也可產生肽庫。請參見，例如，Deylin，WO 91/18980。
通過測定與已知特異於Aβ或其他澱粉樣變性肽如ATTR的抗體或淋巴細胞(B或T)結合的能力，開始篩選組合庫和其他化合物的適用性。例如，最初的篩選可以用任何Aβ或其他所關心的澱粉樣變性肽的多克隆的血清或單克隆抗體進行。然後將這樣篩選後鑑定的化合物進行誘導Aβ或其他澱粉樣變性肽抗體或反應性淋巴細胞能力的進一步分析。例如，可以在已經預塗原纖維肽的微量滴定板上試驗血清的多倍稀釋物，可以進行對Aβ的反應性抗體的標準ELISA試驗。然後按實施例所述，用預先具有澱粉樣變性疾病傾向的轉基因動物試驗化合物的預防和治療效能。這樣的動物包括，例如，Games等，同上中描述的具有APP的717突變的小鼠，Mc Conlogue等，US5,612,486和Hsiao等，Science 274，99(1996)；Staufenbiel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，13287-13292(1997)；Sturchler-Pierrat等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 94，13287-13292(1997)；Borchelt等，Neuron 19，939-945(1997)中描述的具有APP的670/671 Swedish突變的小鼠。相同篩選方法可以應用於其他的潛在的藥劑如上面描述的Aβ片段，Aβ類似物和包括Aβ在內的比較長的肽。
b.其他的斑點組分能夠理解針對其他澱粉樣的斑點組分的免疫反應也可有效預防、延遲或減少澱粉樣的疾病中的斑點沉澱。這樣的組分可能是斑點中原纖維的或與原纖維有關的或形成原纖維的較少的組分，值得說明的一點是，那些組分遍及體內，或對澱粉樣的沉澱相對非特異性，通常不太適用於治療的目標。
因此本發明進一步發現，那些誘導特異斑點組分的免疫反應的藥劑可應用於治療或預防澱粉樣疾病的發展。本部分提供若干典型的與澱粉樣的斑點有關的分子的背景。按照本發明，誘導針對所有這些分子的免疫反應獨自或與針對上述的原纖維組分或針對下述的所有不形成原纖維的組分的藥物組合物結合，就提供了另一種抗澱粉樣變性的治療方案。如此處所述，依據這樣的斑點組分的被動免疫方案也是本發明的組成部分。
例如，合成核素是在結構上類似於脫脂蛋白，但是是在神經元細胞溶質，特別是在突觸前末端附近發現的蛋白質。至少有三種形式的該蛋白質，稱為α，β和γ合成核素。最近已經發現α和β合成核素包含於某些澱粉樣疾病，特別是阿爾茨海默氏病中的澱粉樣沉澱的核中(Clayton，D.F.等，TINS 21(6)249-255，1998)。更具體地說，α和β合成核素的NAC區域的片段(殘基61-95)已經從阿爾茨海默氏病人的澱粉樣斑點中分離得到；事實上這些片段組成約10％該斑點，其在用十二烷基硫酸鈉(SDS)增溶之後仍不能溶解(George，J.M.等Neurosci.News 112-17，1995)。此外，已經報導全長α合成核素和其NAC片段在體外促進β澱粉樣肽集合體變成不能溶解的澱粉樣蛋白(Clayton，同上)。
與澱粉樣斑點有關的其他組分包括非肽組分。例如，基底膜聚糖和基底膜聚糖衍生的氨基多糖是存在於包含Aβ的阿爾茨海默氏病及其他CNS和全身澱粉樣變性中的澱粉樣斑點，包括與糖尿病有關的糊精斑點中的大型硫酸肝素含蛋白多糖。這些化合物已經顯示增強Aβ原纖維的形成。核心蛋白質和基底膜聚糖的氨基多糖鏈已經顯示參與與Aβ的結合。另外的氨基多糖，特別是硫酸皮膚素、軟骨素-4-硫酸酯和戊聚糖多硫酸酯通常發現於各種型式的澱粉樣斑點中，也顯示增強原纖維的形成。葡聚糖硫酸酯也具有這些性質。當這些分子脫硫酸酯後，增強顯著減少。針對硫酸酯形式的氨基葡聚糖，包括氨基葡聚糖本身的致免疫治療形成本發明的另一個實施方案，作為初級或二級處理。本領域普通的技術人員完全可以製備這樣的分子以及包含這樣的分子的適當的治療組合物。
2.誘導被動免疫反應的藥劑本發明治療劑也包括免疫的試劑，如抗體，特別是與原纖維肽或澱粉樣的斑點的其他的組分結合的抗體。這樣的抗體可以是單克隆的或多克隆的，以及具有結合專一性的，即與目標澱粉樣蛋白病種類一致。治療組合物和治療方案可以包括針對斑點特定的原纖維或非原纖維組分上的單一結合區域或表位的抗體，或可以包括針對兩個或更多相同組分上的表位或斑點的多個組分上的表位的抗體。
例如，在支持本發明進行的實驗中，對81/2至101/2個月大的PDAPP小鼠腹膜內(i.p.)注射針對Aβ肽特異的表位製備的抗Aβ42多克隆抗體或抗Aβ單克隆抗體或鹽水，詳見本申請實施例XI。在這些實驗中，監視循環抗體濃度，按需要加強注射以維持製備抗體的特異的抗原的循環抗體濃度大於1∶1000。與對照組相比，抗體治療的小鼠的皮質、海馬體和小腦區域總的Aβ水平減少；減少最高的出現在用多克隆抗體處理的小鼠中。
在進行的支持本發明進行的另外的實驗中，一種預測性的體內試驗(實施例XIV)用來試驗針對稱為NAC的合成核素片段的抗體的清除。已經證明合成核素為與澱粉樣的斑點有關的蛋白質。NAC抗體與包含澱粉樣的斑點和小神經膠質的細胞的腦組織樣品接觸。兔血清用作對照。隨後的監視顯示斑點的數目和大小顯著地下降，表現出清除抗體的活性。
數據顯示，通過使用有效減少澱粉樣的斑點負荷的針對Aβ肽表位或針對合成核素NAC片段的免疫試劑可以大大地減少與阿爾茨海默氏病及其他澱粉樣的疾病有關的澱粉樣的斑點負荷。顯然各式各樣的抗體可被用於這樣的組合物中。那些與集合形式的Aβ特異結合而不與分離形式結合的抗體及那些與分離形式特異結合而不與集合形式結合的抗體都適用於本發明。其他適當的抗體為與集合和分離形式都結合的抗體。某些這樣的抗體與短形式的天然存在的Aβ(即，Aβ39，40或41)結合，而不與長形式的天然存在的Aβ(即，Aβ42和Aβ43)結合。某些抗體與長形式結合而不與短形式結合。某些抗體與Aβ結合而不與全長的澱粉樣前體蛋白結合。某些抗體與Aβ結合的親合力大於或等於約106，107，108，109或1010M-1。
多克隆的血清典型地包含沿Aβ長度與若干表位結合起來的混合抗體群。單克隆抗體與Aβ中的特定的表位結合，這些表位可以是構象的或非構象的表位。某些單克隆抗體與Aβ殘基1-28中的表位結合(將天然的Aβ的第一個N末端殘基指定為1)。其他的單克隆抗體與具有Aβ的殘基1-10的表位結合。還有單克隆抗體與具有Aβ的殘基1-16的表位結合。其他的單克隆抗體與Aβ的殘基1-25的表位結合。某些單克隆抗體與Aβ的胺基酸1-5，5-10，10-15，15-20，25-30，10-20，20，30或10-25中的表位結合。抗體預防和治療效能的試驗可以使用實施例描述的轉基因動物模型方法。
更一般來說，從本申請提供的信息，專業人員可以可使用本申請描述的組合物設計，生產和試驗針對原纖維蛋白質或其他的澱粉樣的疾病的特性肽，以及針對其他的澱粉樣組分的抗體，其中疾病如本申請章節2描述。
a.免疫球蛋白的一般特性已知鹼性的抗體結構單元包含子單元的四聚體。各四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，每對均具有一個「輕鏈」(約25kDa)和一個「重鏈」(約5-70kDa)。各鏈氨基末端部分包括主要擔負抗原識別的約100到110或更多胺基酸的可變區。各鏈羧基末端部分為主要擔負效應子功能的恆定區。
輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ，μ，α，6或者ξ，分別地定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗體的同種型。輕鏈和重鏈中，可變區和恆定區通過約12或更多胺基酸的「J」區相連，重鏈也包括約10或更多胺基酸的「D」區。(通常參見，《基礎免疫學》(Fundamental Immunology)(Paul，W.等，第2版。Raven Press，N.Y.，1989)，第7章(全部作為參考文獻)。
各輕/重鏈對的可變區形成抗體結合部位。因此，一個完整的抗體具有兩個結合部位。除了雙官能的或雙特異的抗體，兩個結合部位是相同的。所有鍊表現出相同的通用結構的相對穩定的構架區(FR)，它通過三個高變區連接，也被叫作互補性測定區或CDRs。各對的兩個鏈的CDRs通過構架區定位，啟動與特定的表位的結合。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包含區域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。各區域胺基酸的分配與Kabat的免疫有義的蛋白序列(Sequences OfProteins of lmmunological Interest)(國家健康研究院National Institutesof Health，Bethesda，MD，1987和1991)，或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等，Nature 342878-883的定義一致。
b.非人類抗體的製備非人類，例如，鼠科動物、豚鼠、兔或大鼠的單克隆抗體的生產可以通過，例如，用斑點組分，如Aβ或其他原纖維組分使動物免疫來完成。也可使用包括Aβ或Aβ的致免疫的片段或Aβ抗體的抗特應抗體的更長的多肽。參見例如，Harlow和Lane，抗體(Antibodies)，實驗手冊(A Laboratory Manual)(CSHP NY，1988)(均引作參考)。這樣的免疫原可以通過肽合成或通過重組體表達從天然來源中獲得。如下所述，該免疫原可以選擇性地與載體蛋白融合或者複合給藥。選擇性地，該免疫原可以用輔劑給藥。如可使用幾種類型的輔劑。對於免疫接種實驗動物，優選完全弗氏佐劑，然後是不完全佐劑。兔或豚鼠典型地被用來製造多克隆的抗體。小鼠典型地被用來製造單克隆抗體。篩選與該免疫原特異性結合的抗體。選擇性地，進一步篩選抗體以與該抗原的特定區域結合。例如，當Aβ肽作為免疫原時，通過測定抗體與Aβ肽缺失突變體的集合的結合和測定與該抗體結合的缺失突變體可完成篩選。結合可以通過例如蛋白質印跡或ELISA評定。顯示與該抗體特異結合的最小的片段限定該抗體的表位。選擇性地，通過競爭試驗可以測定表位的專一性，該試驗中試驗抗體與基準抗體競爭性地與組分結合。如果試驗和基準抗體競爭，則它們與相同表位或十分近接的表位結合，兩種表位十分接近的情況是，結合一種抗體會干擾與另一個抗體的結合。
c.嵌合抗體和人源化抗體嵌合的和人源化的抗體與為其提供原料的小鼠或其他的非人類的抗體具有相同或相似的結合專一性和親合力。嵌合抗體是其輕鏈或重鏈基因典型地通過遺傳工程從屬於不同種類的免疫球蛋白基因構造的抗體。例如，小鼠單克隆抗體基因的可變的(V)片段可以結合到人類常量(C)片段，如IgG1和IgG4上。因此，典型的嵌合抗體為由小鼠抗體的V或抗原結合區域組成的雜化蛋白或從人類抗體來的C或效應子區域。
人源化的抗體具有實質上來自人類抗體(稱為受體抗體)的可變區骨架殘基和實質上來自小鼠抗體(稱為受體免疫球蛋白)的互補性測定區。見Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1989)和WO 90/07861，US 5,693,762，US 5,693,761，US 5,585,089，US 5,530,101和Winter，US 5,225,539(均引作參考)。如果恆定區(s)存在，它實質上或完全來自人免疫球蛋白。人類可變區域通常選自其骨架序列與衍生CDRs的鼠科動物可變區域高度相同的人類抗體。重鏈和輕鏈可變區骨架殘基源自於相同或不同的人類抗體序列。人類抗體序列可以是天然存在的人類抗體的序列也可以是若干人類抗體的共有序列。參見Carter等，WO 92/22653。基於他們對CDR構象和/或與抗原的結合的可能的影響，選擇某些人類可變區骨架殘基的胺基酸用於替換。通過建立模型、檢測該胺基酸在具體地點的特徵或特殊的胺基酸的替代效應或誘變的經驗觀測，研究這些可能的影響。
例如，當鼠科動物可變區骨架殘基和選擇的人類可變區骨架殘基的胺基酸不同時，該人類骨架胺基酸通常由相當於來自小鼠抗體的骨架胺基酸代替，該胺基酸適當地(1)直接地與抗原非共價結合，(2)與CDR區鄰接，(3)否則與CDR區相互作用(如在CDR區約6A範圍之內)，或(4)參與VL-VH界面。
其他候選替換試驗對象是受體人類骨架胺基酸，該胺基酸在該位置對於人類免疫球蛋白是異常的。這些胺基酸可以用來自小鼠供體抗體等效位置的胺基酸或來自更典型的人免疫球蛋白的等效位置的胺基酸代替。其他的替換試驗對象是受體人類骨架胺基酸，該胺基酸在該位置對於人免疫球蛋白是異常的。人源化的免疫球蛋白的可變區骨架通常顯示最小85％與人類可變區骨架序列或這樣的序列的共有序列一致。
d.人類抗體通過如下所述的各種技術提供針對Aβ的人類抗體。某些人類抗體通過競爭性結合實驗選擇，或者相反，通過與特殊的小鼠抗體，如實施例XI描述的小鼠單克隆抗體具有相同的表位專一性選擇。通過使用Aβ作為唯一的免疫原片段，和/或通過篩選針對Aβ缺失突變體集合的抗體，篩選對於特殊的表位具有專一性的人類抗體。
(1)Trioma方法該方法使用的基本途經和典型的細胞融合配對，SPAZ-4已被公開在Oestberg等，Hybridoma 2361-367(1983)；Oestberg，美國專利No.4,634,664；和Engleman等，美國專利4,634,666(均引作參考)中。該方法得到的產生抗體的細胞系稱為triomas，因為它們來自三個細胞-兩個人類細胞和一個小鼠細胞。開始，將小鼠骨髓瘤細胞系與人類B淋巴細胞融合，得到非產生抗體的異種雜化細胞，如上述Oestberg描述的SPAZA細胞系。然後將該異種細胞與免疫的人類B淋巴細胞融合，得到產生抗體的trioma細胞系。已經發現Triomas產生比由人類細胞製造的普通雜交瘤更堅固的抗體。
該免疫的B淋巴細胞從人類供體的血、脾、淋巴結或骨髓中獲得。如果需要針對特定的抗原或表位的抗體，優選使用用於免疫接種的抗原或其表位。免疫接種可以在體內或體外進行。對於體內免疫接種，從用Aβ、其片段、包含Aβ或其片段的較大的多肽免疫的人體，或Aβ抗體的抗特應性抗體中分離B細胞。在某些方法中，B細胞從最終使用抗體治療的相同患者分離。對於在體外免疫接種，B-淋巴細胞典型地在媒介如補充有10％人血漿的RPMI 1640(見Engleman同上)中暴露於抗原7-14天。
該免疫的B淋巴細胞與異種的雜交細胞如SPAZ-4通過眾所周知的方法融合。例如，將該細胞在大約37攝氏度下，用40-50％的分子量為1000-4000的聚乙二醇處理約5-10分鐘。細胞從融合混合物中分離，並在對所需要的雜化(例如，HAT或AH)具有選擇性的介質中繁殖。通過化驗能夠與Aβ或其片段結合的trioma培養基，辨認所需要的結合專一性的分泌抗體的克隆。通過有限稀釋技術亞克隆具有所需要的專一性的產生人類抗體的Triomas並在體外培養基中生長。然後試驗得到的trioma細胞系與Aβ或其片段的結合能力。
雖然triomas是遺傳穩定的，但它們並不產生很高水平的抗體。通過克隆抗體基因從trioma變成一種或多種表達載體，可以增加表達水平，按照該領域眾所周知的方法將該載體變換變成標準哺乳動物、細菌或酵母細胞系列。
(2)轉基因的非人類哺乳動物針對Aβ的人類抗體也可由具有編碼至少一段人免疫球蛋白基因座的轉基因的非人類轉基因的哺乳動物產生。通常，這樣的轉基因哺乳動物的內生的免疫球蛋白基因座在功能上是非活性的。優選人免疫球蛋白基因座的片段包括重鏈和輕鏈組分的未重排序列。鈍化內生的免疫球蛋白和引入外生的免疫球蛋白基因可以通過目標源重組或通過引導YAC染色體完成。通過這些處理所得的轉基因哺乳動物能夠在功能上重排免疫球蛋白組分序列，表達通過人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型的全部抗體，而不表達內生的免疫球蛋白基因。具有這些性質的哺乳動物的生產和性質詳見，例如，Lonberg等，WO93/12227(1993)；US 5,877,397，US 5,874,299，US 5,814,318，US 5,789,650，US 5,770,429，US 5,661,016，US 5,633,425，US 5,625,126，US 5,569,825，US 5,545,806，Nature 148，1547-1553(1994)，Nature Biotechnology 14，826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)(均引作參考)。轉基因小鼠特別適於上述目的。如Lonberg或Kucherlapati，同上中的描述，用Aβ或其片段，通過轉基因的非人類的哺乳動物免疫得到抗Aβ抗體。通過，例如，使用傳統的KohlerMilstein技術從這樣的哺乳動物得到的細胞與合適的骨髓瘤細胞系列融合，製備單克隆抗體。可以以從通過致免疫的藥劑進行免疫的人獲得的血清形式提供人類多克隆的抗體。選擇性地，可以通過使用A β或其他的免疫原澱粉樣的肽作為親合試劑進行的親合純化濃縮這樣的多克隆抗體。
(3)噬菌體展示方法按照Huse等，Science 2461275-1281(1989)提出的總的方案，可用另一種獲得人類抗Aβ抗體的方法篩選人類B細胞DNA庫。例如，如trioma方法所述，這樣的B細胞可以用以Aβ，片段，包含Aβ或片段的比較長的多肽免疫的人或抗特應性抗體中得到。選擇性地，可以從最終接受抗體治療的患者得到這樣的B細胞。選擇與感興趣的澱粉樣的組分如Aβ或其片段的表位結合的抗體。然後克隆和放大編碼這樣的抗體(或結合的片段)的序列。Huse描述的方案在與噬菌體展示技術結合方面更有效率。參見，例如，Dower等，WO 91/17271和McCafferty等，WO 92/01047，US 5,877,218，US 5,871,907，US 5,858,657，US 5,837,242，US 5,733,743和US 5,565,332(均引作參考)。在這些方法中，產生的噬菌體庫中的成分在其外表面顯示不同的抗體。抗體通常顯示為Fv或Fab片段。通過Aβ或其片段的親合富集，選擇具有所需要的專一性的噬菌體展示抗體。
在噬菌體展示的改進方法中，可以產生具有選定的鼠科動物抗體結合專一性的人類抗體。見Winter，WO92/20791。在該方法中，選擇的鼠科動物抗體的重鏈或輕鏈可變區用作原料。如果，例如，輕鏈可變區被選為原料，所構造的噬菌體基因庫中的單元顯示相同的輕鏈可變區(即，該鼠科動物原料)和不同的重鏈可變區。重鏈可變區從人類重鏈可變區重排的基因庫中獲得。選擇對感興趣的組分顯示強的特異結合(例如，至少108，優選至少109M-1)的噬菌體。由此噬菌體得到的人類重鏈可變區充當進一步構造噬菌體基因庫的原料。在這些基因庫中，各噬菌體展示相同重鏈可變區(即，該區等同於原來顯示的基因庫)和不同的輕鏈可變區。輕鏈可變區從人類輕鏈可變區重排的基因庫中獲得。再一次選擇對澱粉樣的肽組分顯示強的特異結合的噬菌體。這些噬菌體展示與人類抗澱粉樣的肽抗體完全相同的可變區。這些抗體通常具有與鼠科動物原料相同或相似的表位。
e.恆定區的選擇嵌合的、人源化的或人類抗體的重鏈和輕鏈可變區可以與至少一部分人類恆定區有關。恆定區的選擇部分地信賴於是否要求抗體依賴的補充和/或細胞介導毒性。例如，同種型IgG1和IgG3具有補體活性，同種型IgG2和IgG4沒有。同種型的選擇將會影響抗體進入腦的通道。輕鏈恆定區可以是λ或κ。可以表達為包含兩個輕鏈和兩個重鏈的四聚體、單獨的重鏈、輕鏈、Fab、Fab′F(ab′)2和Fv，或其中重鏈和輕鏈可變區通過隔離物連接的單鏈抗體。
f.重組體抗體的表達嵌合的、人源化的和人類抗體典型地通過重組體表達產生。重組體多核苷酸構造典型地包括切實與編碼抗體鏈序列有關的表達控制序列，包括天然關聯的或異種的啟動子區。優選表達控制序列為能夠變換或轉染真核生物的寄主細胞的載體中的啟動子系統。一旦載體併入適當的宿主中後，該寄主維持在適於核苷酸序列的高水平表達，以及交叉反應抗體的收集和提純的條件下。
這些表達載體作為游離基因或作為該寄主染色體的DNA不可分割的部分，一般在寄主有機體中是可複製的。
大腸桿菌是一個對克隆本發明DNA序列特別有用的原核生物寄主。微生物，如酵母也對表達有用。酵母屬是優選的酵母寄主，按照需要帶有具有表達控制序列合適的載體、複製起點、終止序列等等。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶及其他糖解酶。可歸納的酵母啟動子包括，尤其是，來自乙醇脫氫酶的啟動子，異細胞色素C和應用於麥芽糖和半乳糖的酶。
哺乳動物細胞對於表達編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸片段是優選的寄主。見Winnacker，《從基因到克隆》(From Genes to Clones)，(出片商VCH，NY，1987)。一些能夠分泌完整的異種蛋白質的合適的寄主細胞系列已經在本領域得到發展，包括CHO細胞系、各種COS細胞系列、HeLa細胞、L細胞和骨髓瘤細胞系列。這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，如複製起點、啟動子、增強劑(Queen等，Immunol.Rev.8949(1986))和必要的信息處理位置，如核糖體結合位點、核糖核酸剪接位點、聚腺苷酸化位置和轉錄終止劑序列。優選的表達控制序列是源自內生基因、巨細胞病毒、SV40、腺苷病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動子。見Co等，J.Immunol.1481149(1992)。
抗體編碼序列可以選擇性地合入轉基因，以引入轉基因動物的基因組，隨後在轉基因動物乳中表達(例如，按照US 5,741,957，US5,304,489，US 5,849,992描述的方法，這些文獻均引作參考)。合適的轉基因包括對於與來自乳腺特異基因，如酪蛋白或β乳球蛋白的啟動子和增強子適當連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。
通過眾所周知的方法，包含感興趣的DNA片段的載體可以轉移進入寄主細胞，這取決於細胞的寄主的種類。例如，對於原核細胞通常使用氯化鈣轉染，而磷酸鈣治療、電穿孔、脂轉染、biolistics或基於病毒的轉染能用於其他的細胞寄主。用於變換哺乳動物細胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生質體融合、脂質體、電穿孔法和顯微注射(通常參見，Sambrook等，同上)。對於轉基因動物的生產，可以將轉基因微量注射進入受精的卵母細胞中，或可以合入胚胎幹細胞的基因組中，這樣的細胞的細胞核轉移進入去核的卵母細胞中。
表達後，抗體可以按照本領域的標準程序純化，包括HPLC提純，柱色譜法，凝膠電泳等等(通常見，Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，NY，1982))。
4.其他的治療劑本發明方法使用的治療劑也包括與斑點組分，如Aβ肽結合的T細胞。例如，通過從昆蟲細胞系表達人類MHC類I基因和人類β-2微球蛋白基因，藉此在細胞表面上形成空的可以與Aβ肽結合的複合體，T細胞可以針對Aβ肽被激活。與細胞繫結合的T細胞針對該肽特別地被激活。見Peterson等，US 5,314,813。表達MHC類II抗原的昆蟲細胞系同樣可以用於激活CD4細胞5.載體蛋白質某些誘導免疫反應的藥劑包含誘導針對澱粉樣沉澱的免疫反應的適當的表位，但是該免疫反應很小不足以致免疫。這時，可以將肽免疫原連接到合適的載體上幫助啟發免疫反應。合適的載體包括血清清蛋白、鑰孔血藍素、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風類毒素或來自其他病原菌，如白喉、大腸桿菌、霍亂或H.pylori的類毒素，或稀釋的毒素衍生物。其他的載體包括與多MHC等位基因，例如，至少75％人類MHC等位基因結合的T細胞表位。這樣的載體有時作為「通用的T細胞表位」在本領域是已知的。通用的T細胞表位的例子包括流感性紅血球凝聚素HA307-319PKYVKQNTLKLAT(SEQ IDNO1)PADRE(common residues bolded)AKXVAAWTLKAAA(SEQ IDNO2)瘧疾CST3表位EKKIAKMEKASSVFNV(SEQ ID NO3)肝炎B表面抗原HBsAg19-28FFLLTRILTI(SEQ ID NO4)熱休克蛋白65hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG(SEQ IDNO5)卡介苗QVHFQPLPPAVVKL(SEQ ID NO6)破傷風類毒素TT830-844QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO7)破傷風類毒素TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO8)HIV gp120TlKQIINMWQEVGKAMYA(SEQ ID NO9)其他刺激或增強免疫反應的載體包括細胞因子如IL-1，IL-1α和β肽，IL-2，γINF，IL-10，GM-CSF，和趨化因子，如MIP1α和β和RANTES。致免疫劑也可與如O』Mahony，WO 97/17613和WO 97/17614描述的增強組織間轉運的肽連接。
致免疫的藥劑可以通過化學交聯與載體連接。將免疫原與載體連接的技術包括使用N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶硫基)丙酸鹽(SPDP)和琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)形成二硫鍵(如果肽缺乏巰基，可以通過添加半胱氨酸殘基得到)。這些試劑在它們本身和蛋白質上的肽半胱氨酸殘基之間產生二硫鍵和通過賴氨酸上的ε-氨基，或其他胺基酸中的其他自由氨基形成醯胺鍵。許多這樣的二硫化物/醯胺形成試劑描述於Immun.Rev.62，185(1982)。其他雙官能的偶聯劑形成硫醚而不是二硫鍵。這些硫醚形成試劑中有許多是市場上可買到的，包括6-馬來醯亞胺基己酸，2-溴乙酸，和2-碘乙酸的反應性酯，4-(N-馬來醯亞胺基-甲基)環己烷-1-羧酸。羧基可以通過使其與琥珀醯亞胺或1-羥基-2-硝基-4-磺酸，鈉鹽結合而激活。
致免疫的肽也可表達為與載體的融合蛋白(即，異種的肽)。致免疫的肽可以在其氨基的末端，羧基末端，或二者與載體連接。選擇性地，多重複制的致免疫的肽可以存在於融合蛋白。選擇性地，致免疫的肽可以在肽的N和C末端與異種肽的複製體連接。某些載體肽用來誘導針對載體肽的輔助T細胞反應。誘導的輔助T細胞接著誘導針對與載體肽連接的致免疫的肽的B細胞反應。
本發明的某些試劑包含融合蛋白，其中Aβ的N-末端片段在其C末端連接到載體肽上。在此類試劑中，Aβ片段的N-末端殘基構成融合蛋白的N-末端殘基。因此，這樣的融合蛋白質有效地誘導與需要自由形式的AβN-末端殘基的表位結合的抗體。本發明某些試劑包括在C末端與一種或多種載體肽複製體連接的AβN-末端片段的多次複製。合入這樣的融合蛋白質的Aβ片段的N-末端，有時從Aβ1-3開始，到Aβ7-11結束。Aβ1-7，Aβ1-3，1-4，1-5，和3-7是優選的AβN-末端片段。某些融合蛋白質包含不同的串接的AβN-末端片段。例如，融合蛋白可以包含Aβ1-7，接著為Aβ1-3接著為異種的肽。
在某些融合蛋白質中，Aβ的N-末端片段在其N-末端與異種的載體肽融合。可使用相同種類的AβN-末端片段用於與C-末端融合。某些融合蛋白質包含與AβN-末端片段的N-末端連接的異種肽，該末端依次與一種或多種另外的AβN-末端片段串接。
適用於本發明的某些融合蛋白質的例子顯示如下。一些融合蛋白質包含與破傷風類毒素表位相連接的Aβ片段，如US5,196,512，EP378,881和EP 427,347所述。一些融合蛋白質包含與US 5,736,142所述的載體肽相連接的Aβ片段。某些異種肽是通用的T細胞表位。在某些方法中，用於給藥的試劑只不過是具有與直線結構的異種的片段相連接的Aβ片斷的單一的融合蛋白。在某些方法中，該試劑是式2x表示的融合蛋白的多聚體，其中x是1-5的整數。優選的x是1，2或3，最優選2。當x為2時，這樣的多聚體具有連接在稱為MAP4的優選構型上的四個融合蛋白質(見US 5,229,490)。將Aβ表位下劃線。
MAP4構型顯示如下，其中通過在N末端和賴氨酸的側鏈胺開始肽合成產生支鏈結構。依賴於合入該序列和允許分支的賴氨酸的數目，所得結構存在多個N末端。在本例子中，在包含賴氨酸的分支核心上已經產生了四個相同的N末端。這樣的多重性大大地增強了同源的B細胞的響應度。
AN90549(Aβ1-7/破傷風類毒素830-844 MAP4構型)DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO10)AN90550(Aβ1-7/破傷風類毒素947-967 MAP4構型)
DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO11)AN90542(Aβ1-7/破傷風類毒素830-844+947-967線性構型)DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO12)AN90576(Aβ3-9/破傷風類毒素830-844 MAP4構型)EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO13)美國專利5,736,142中描述的肽(全部是線性構型)AN90562(Aβ1-7/肽)AKXVAAWTLKAAADAEFRHD(SEQ IDNO14)AN90543(Aβ1-7x3/肽)DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO15)融合蛋白的其他例子(黑體的Aβ致免疫的表位)包括AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ ID NO16)DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO17)DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO18)FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO19)EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO20)PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ ID NO21)DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD(SEQ ID NO22)DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO23)DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO24)DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKLAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO25)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO26)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ ID NO27)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO28)在2位上帶有支鏈的樹脂上。
EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR(合成核素融合蛋白MAP-4構型；SEQ ID NO29)可使用相同或相似的載體蛋白質和連接方法製備免疫原，該免疫原產生針對在被動免疫中所使用的Aβ的抗體。例如，可以給予實驗動物與載體連接的Aβ或片段，使其產生Aβ的單克隆抗體。
6.治療劑核酸編碼也可通過給予編碼所選擇的用於被動免疫的肽免疫原或抗體及其組分鏈的核酸誘導針對澱粉樣沉澱的免疫反應。這樣的核酸可以是DNA或RNA。編碼免疫原的核酸片段一般與調控元件，如啟動子和增強子相連接，調控元件允許在預期的患者目標細胞中表達DNA片段。對於在血細胞中所需要的誘導免疫反應的表達，來自輕鏈或重鏈免疫球蛋白基因或CMV主要中間體早期啟動子和增強子的啟動子和增強子元件適於直接表達。連接的調控元件和編碼序列經常克隆至一個載體中。對於雙鏈抗體的給藥，兩個鏈可以克隆在相同或分離的載體中。
可以利用一些病毒載體體系，包括逆轉錄病毒的體系(見，例如，Lawrie和Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3，102-109，1993)；腺病毒載體(見，例如Belt等，J.Virol.67，5911，1993)；腺病毒相關病毒載體(見，例如，Zhou等，J.Exp.Med.179，1867，1994)，來自包括牛痘病毒和雞痘病毒的痘族病毒載體，來自α病毒屬，如源自Sindbis和Semliki Forest Viruses的病毒的病毒載體(見，例如，Dubensky等，J.Virol.70，508-519，1996)，委內瑞拉(Venezuelan)馬腦炎病毒(見US5,643,576)和彈狀病毒，如水泡性口膜炎病毒(見WO 96/34625)和乳頭狀瘤病毒(Ohe等，Human Gene Therapy 6，325-333，1995)；Woo等，WO 94/12629和Xiao和Brandsma，Nucleic Acids.Res.24，2630-2622，1996)。
DNA編碼免疫原，或含有該免疫原的載體可以被包裝成脂質體。合適的脂類和有關類似物描述於US 5,208,036，5,264,618，5,279,833和5,283,185。載體和DNA編碼免疫原也可被吸附到顆粒載體或與顆粒載體相伴，該例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合體和聚交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)，見，例如，McGee等，J.Micro Encap.(1996)。
基因治療載體或裸DNA可以通過向個體患者給藥在活體內傳遞，一般通過全身給藥(例如，靜脈內的，腹膜內的，鼻腔內的，胃的，皮內的，肌肉的，皮下的或顱內的注入)或局部施用(見例如，US5,399,346)。這樣的載體可以進一步包括促進試劑如丁哌卡因(US5,593,970)。DNA也可使用基因槍給藥。見Xiao和Brandsma同上。DNA編碼免疫原沉澱在顯微鏡的金屬珠的表面上。將該微粒用衝擊波或膨脹氦氣加速，穿透組織達到若干細胞層的深度。例如，Agracetus，Inc.，(Middleton，WI)製造的AccelTMGene Delivery Device是合適的。選擇性地，裸DNA可以簡單地通過化學的或機械的刺激在皮膚上DNA點樣透過皮膚進入血流(見WO 95/05853)。
在進一步的變化中，載體編碼免疫原可以被傳遞到體外的細胞，如從個體患者移植的細胞(例如，淋巴細胞，骨髓抽出物，活檢組織)或萬能供血者造血幹細胞，然後將該細胞重新移植至病人體內，這通常在選定編入載體的細胞後進行。
7.篩選具有清除活性的抗體實施例XIV描述了篩選清除澱粉樣的沉澱的抗體的方法。為篩選針對澱粉樣的沉澱的活性，在體外培養基中將來自澱粉樣變性患者的組織樣品，如阿爾茨海默氏病的腦組織，具有澱粉樣的病狀的動物模型與負載Fc受體的吞噬細胞，如小神經膠質的細胞，和抗體接觸。該吞噬細胞可以是原始培養物或細胞系，如BV-2，C8-B4或THP-1。這些組分結合在載玻片上便於顯微鏡監視，或在微量滴定碟的孔中同時進行多個反應。在這樣的形式中，獨立的微型載玻片可以裝在分離的孔上，或可使用非微量探測形式，如Aβ的ELISA探測。優選地，多次測量在體外反應混合物中澱粉樣的沉澱的量，從反應進行以前的基準值開始，以及反應期間的一種或多種測試值。可以通過染色，例如，用Aβ或澱粉樣的斑點的其他組分的放射性標記的抗體，檢測抗原。在檢驗抗體的清除活性中，被用來染色的抗體可能是相同或不同的。澱粉樣沉澱反應期間相對於基準線的減少顯示在試驗中的該抗體具有清除活性。這樣的抗體可用於預防或治療阿爾茨海默病及其他澱粉樣變性疾病。如上所述，支持本發明的實驗顯示，合成核素的NAC片段的抗體有效清除阿爾茨海默氏病典型的澱粉樣斑點。
D.可接受抗澱粉樣變性治療方案的病人可接受治療的病人包括未顯示症狀但處於疾病危險中的病人，以及目前顯示澱粉樣變性症狀的病人。至於阿爾茨海默氏病，如果他或她一生足夠長的話，事實上任何人都有患阿爾茨海默氏病的危險。因此，本方法可適用於不需要任何患病風險評估的一般群體的預防性給藥。本方法尤其對已知具有阿爾茨海默氏病或任何其他的遺傳性的澱粉樣疾病遺傳危險的個體有用。這樣的個體包括經歷這些疾病的患者的親屬，以及通過遺傳的或生物化學的標識物分析測定具有風險的人。阿爾茨海默氏病的風險的遺傳標誌物包括APP基因的突變，特別是被分別稱為Hardy和Swedish突變的位置717和位置670和671的突變(見Hardy，TINS，同上)。其他的風險標識物是早衰(presenilin)基因，PS1和PS2，ApoE4，AD家族史，高膽甾醇血或動脈粥樣硬化中的突變。目前患有阿爾茨海默氏病個體可以通過特有的痴呆，以及上面描述的危險因素的存在而確定。另外，一些診斷性試驗有助於鑑定AD個體。其中包括CSF tau和Aβ42水平的測量。Tau水平提升和Aβ42水平降低是AD存在的信號。阿爾茨海默氏病的患病個體也可通過實施例章節論述的MMSE或ADRDA標準診斷。
對於無症狀的病人，治療可以從任何年齡開始(例如，10，20，30歲)。但通常直到患者到達40，50，60或70歲才需要開始治療。治療一般需要在某一周期內使用多倍劑量。按照本申請實施例I和II描述，可以通過測試抗體或活化的T細胞或B細胞對治療劑(如Aβ肽)隨時間的反應監視治療。如果該反應下降，顯示需要支持劑量。對於潛在的唐氏先天愚症患者，可以通過對其母親給藥進行出生前治療或在出生之後不久給藥。
其他形式的澱粉樣變性往往誤診，除非懷疑對於該疾病具有特殊的傾向。一個最初的症狀是中年到老年患者存在的心臟病或腎病，該患者也具有其他的器官疾病的信號。心電圖低壓或極端的軸偏斜和心室組織變厚可能是心臟疾病的表現。蛋白尿是腎疾病的症狀。如果患者體格檢查中檢測出肝腫大可能是肝臟的疾病。周圍神經病也常在某些形式的澱粉樣變性中發生；同時可能發現以體位性低血壓為特徵的自發性神經病。任何不確定起因的進行性神經病患者可被懷疑為澱粉樣變性。該疾病的確定的診斷可使用感染器官的組織活檢方法。對於全身的澱粉樣變性，可使用脂墊抽出物或直腸活檢樣品。活檢材料用剛果紅染色，陽性樣品在偏振光顯微術中顯示蘋果綠雙折射。
E.治療方法在預防應用中，給予易被特定疾病感染的，或者處於特定疾病危險中的患者，足夠消除或減少該危險或延遲該疾病發生的劑量的藥物組合物或藥劑。在治療應用中，給予懷疑或已經患有這樣的疾病的患者足夠治療，或至少部分地抑制該疾病的症狀及其併發症的劑量的組合物或藥物。能夠完成所述任務的劑量被稱為治療有效劑量或藥學有效劑量。在預防和治療的療法中，藥劑通常以不同的劑量給予直到免疫反應已經充分完成。一般地，該免疫反應被監視，如果免疫反應開始變小，就給予重複的劑量。
用於治療以上所述疾病的本發明組合物的有效劑量因許多不同的因素，包括給藥方式，目標區域，患者的生理狀態，患者是否是人類或動物，使用的其他藥物，治療是預防性的或治療性的而變化。通常患者是人類，但是某些疾病如朊病毒蛋白質關聯的狂牛症，患者可以是非人類的哺乳動物，如牛。治療劑量需要滴定以使安全性和有效性最優化。免疫原的量取決於是否使用輔劑，在沒有輔劑的情況下通常需要高劑量。使用的免疫原的量取決於特定劑型的免疫原性，對於人類給藥每位患者每次注射1μg-500μg，更優選5-500μg。偶而使用每次注射0.5-5毫克的高劑量。一般地，每人每次注射至少約10，20，50或100μg。注射次數可以從一天一次到一年一次，到十年一次明顯不同，有時優選連續地「增加」免疫原。通常，按照本申請提供的學說，通過從患者得到液體樣品，通常是血清樣品，並使用本領域眾所周知的適合於特異抗原測量的方法，測定針對免疫原的抗體的滴定度，可以監控有效劑量。理想地，在最初的劑量之前獲得樣品；在每次免疫接種之後獲得後來的樣品並滴定。通常，提供至少大於對照物或1∶100血清稀釋物的「背景」水平四倍的可檢測的滴定度的劑量或劑量表是合乎需要的，其中背景定義為相對於對照血清或相對於ELISA測定中的空白背景。按照本發明，優選至少為1∶1000或1∶5000的滴定度。
在給予免疫原劑量的任何一天，如果同時使用輔劑，通常劑量大於約1μg/患者，優選大於10μg/患者，如果沒有使用輔劑，劑量至少大於10μg/患者。通常大於100μg/患者。按照本發明選擇的個體免疫原劑量取決於符合本申請提供的學說的標準劑量和滴定方法。典型的療法包括在免疫接種後一定時間間隔，如6周後，加強注射。另一個療法包括在免疫接種後1，2和12月加強注射。另一個療法需要兩月一次終身注射。選擇性地，按照免疫反應的監控不規則地進行加強注射。
對於用抗體被動免疫接種，劑量範圍從約0.0001到100毫克/千克，優選0.01到5毫克/千克寄主體重。例如劑量可以是1毫克/千克或10毫克/千克體重。典型的治療方法需要每兩周一次或一月一次或每3到6月一次給藥，在某些方法中，兩個或更多具有不同結合專一性的單克隆抗體同時地給藥，在這情況下，每種抗體的給藥劑量都在指出的範圍內。抗體通常多次給藥。單劑量之間的間隔可以是每周，每月或每年。按照針對Aβ的抗體在患者血液中的水平，間隔還可以是不規則的。選擇性地，抗體可以作為持續釋放劑型給藥，在這種情況下需要的給藥次數減少。劑量和頻率的變化取決於抗體在患者體內的半衰期。通常，人類抗體顯示最長的半衰期，後面是人源化的抗體，嵌合的抗體和非人類的抗體。給藥的劑量和頻率的變化還取決於是治療還是預防。在預防應用中，給藥劑量相對低，頻率相對低，間隔時期長。某些病人的治療時間延續至他們生命的剩餘部分。在治療的應用中，有時需要劑量相對高，間隔相對短，給藥需要維持到疾病的進展被減緩或終止，優選直到患者的病症表現出部分的或完全的改善。此後，可以給予患者預防治療。
核酸編碼免疫原的劑量為每位患者約10ng到1克，100ng到100mg，1μg到10mg，或30-300μg DNA。傳染性的病毒載體劑量為每劑量10-100或更多病毒粒子。
用於預防和/或治療的誘導免疫反應的藥劑的給藥方式可為腸胃外的，局部的，靜脈內的，口服的，皮下的，腹膜內的，鼻腔內的或肌肉的。致免疫的藥劑典型的給藥途徑是肌肉的(i.m.)，靜脈內的(i.v.)或皮下的(s.c.)，雖然其他途徑可以同樣地有效。最典型的肌肉注射在臂或腿肌肉內進行。在某些方法中，藥劑直接注射進入具有沉澱積聚的特定組織，例如顱內的注射。對於抗體給藥，優選肌肉注射或靜脈內的注入。在某些方法中，特殊的治療抗體直接地注射進入顱內。在某些方法中，抗體以持續釋放組合物或裝置，如MedipadTM裝置給藥。
本發明藥劑可以選擇性地與其他的藥劑結合給藥，其他的藥劑在澱粉樣變性病的治療中至少部分地有效。對於澱粉樣的沉澱出現在腦中的阿爾茨海默病和唐氏先天愚症，本發明藥劑還可以與可增加本發明藥劑越過血腦屏障的其他的藥劑結合給藥。此外，如同針對一個斑點組分的抗體和針對不同的斑點組分的一種免疫原的組合，包含用來引起針對超過一個澱粉樣組分免疫反應的免疫原的治療混合劑也屬於本發明的範圍。
本發明致免疫的藥劑，如肽，有時與輔劑結合給藥。許多輔劑可被用於與肽如Aβ結合，引發免疫反應。優選的輔劑放大免疫原固有的反應，而不導致影響反應性質的免疫原構象的變化。優選的輔劑包括氫氧化鋁和磷酸鋁，3De-O-醯化的單磷醯基脂A(MPLTM)(見GB2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，Montana，now partof Corixa)。StimulonTMQS-21是從在南美洲發現的皂樹皮(QuillajaSaponaria Molina)中分離的三萜烯苷或皂草苷(見Kensil等人，inVaccine DesignThe Subunitt and Adjuvant Approach(eds.Powell Newman，Plenum Press，NY，1995)US專利No.5,057,540)，(AquilaBioPharmaceuticals，Framingham，MA)。其他的輔劑是水包油乳化液(如角鯊烯或花生油)，選擇性地與免疫刺激劑結合，如單磷醯脂A(見Stoute等，N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一個輔劑是CpG(WO98/40100)。選擇性地，Aβ可以與輔劑偶聯。但是，這樣的偶聯不應該實質上轉變Aβ的構象以致影響其免疫反應的性質。輔劑可以作為治療組合物的組分與活性劑一起給藥，或可以分別地給藥，可在治療劑給藥之前，同時，或之後給藥。
輔劑的優選類別是鋁鹽，如氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁。這樣的輔劑使用時可以有或者沒有其他特定的免疫刺激藥劑如MPL或3-DMP，QS-21聚合的或單體的胺基酸如聚穀氨酸或聚賴氨酸。另一類輔劑是水包油型乳液製劑。使用這樣的輔劑時可以有或者沒有其他的特定的免疫刺激劑如胞壁醯肽(例如，N-乙醯胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)，N-乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙氨醯-D異穀氨醯胺(nor-MDP)，N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕櫚醯-sn-甘油基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(MTP-PE)，N-乙醯葡糖胺基-N-乙醯胞壁醯-L-Al-D-異穀氨醯-L-Ala-二棕櫚醯氧丙醯胺(DTP-DPP)theramideTM，或其他的細菌細胞壁組分。水包油乳化劑包括(a)MF59(WO 90/14837)，含有5％角鯊烯，0.5％吐溫80和0.5％斯潘85(選擇性地含各種量的MTP-PE)使用如Model 110Y(Microfluidics，Newton MA)的微流化器配製成亞微細粒，(b)SAF，含10％角鯊烯，0.4％吐溫80，5％普盧蘭尼克-嵌段聚合物L121，和thr-MDP，既可微流體化成亞微細粒乳劑或渦流產生較大粒子尺寸的乳劑，和(c)RibiTM輔劑體系(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)含2％角鯊烯，0.2％吐溫80，和一種或多種選自單磷醯脂A，trehalose dimycolate(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的細菌細胞組分，優選MPL+CWS(DetoxTM)。另一類優選的輔劑是皂草苷輔劑，如StimulonTM(OS 21；Aquila，Framingham，MA)或由如ISCOMs(免疫刺激複合物)和ISCOMATRIX產生的顆粒。其他的輔劑包括弗氏不完全佐劑(IFA)，細胞因子，如白細胞間介素(IL-1，IL-2和IL12)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF)。這樣的輔劑通常可以從市場中獲得。
輔劑可以與免疫原作為單一的組合物給藥，或可以在免疫原給藥之前，同時或之後給藥。免疫原和輔劑可以在同一個小瓶包裝和供給，或可以在分離的小瓶包裝，在使用之前混合。免疫原和輔劑通常用一個標明想要治療的應用的標籤包裝。如果免疫原和輔劑分別包裝，該包裝通常包括使用之前混合的指導。輔劑和/或載體的選擇取決於以下因素包含輔劑的劑型的穩定性，給藥途徑，劑量日程表，和輔劑對被接種物種的效果。對於人類，優選的藥學上可接受的輔劑是由相關的管理機構批准供人類使用的輔劑。這樣的優選供人類使用的輔劑的例子包括明礬，MPL和QS-21。選擇性地，可同時使用兩種或多種不同的輔劑。優選的組合包括明礬與MPL，明礬與QS-21，MPL與QS-21，和明礬、QS-21和MPL共同使用。此外，可使用弗氏不完全佐劑(Chang等，Advanced Drug Delivery Reviews 32，173-186(1998))，並可以選擇性地與明礬，QS-21和MPL以及它們的所有組合結合。
本發明藥劑經常作為含有活性治療劑和許多其他藥學上可接受的組分的藥物組合物給藥。見Remington′s Pharmaceutical Science(19thed.，1995)。優選的形式取決於預定的給藥方式和治療的應用。該組合物還可以包括，根據所要求的製劑，藥學上可接受的，無毒的載體或稀釋劑，它們被稱為賦形劑，通常用於配製供動物或人類使用的藥物組合物。需要選擇該稀釋劑，以便不影響該組合的生物活性。這樣的稀釋劑的例子是蒸餾水，生理磷酸緩衝鹽水，林格氏溶液，葡萄糖溶液和漢克(Hank)溶液。另外，該藥物組合物或製劑還可能包括其他載體，輔劑，或無毒的，非治療的，非免疫的穩定劑等等。
藥物組合物還可以包括大的，新陳代謝慢的高分子物質如蛋白質，多糖如脫乙醯殼多糖，聚乙酸，聚乙醇酸和共聚物(如乳膠功能化的瓊脂糖凝膠，瓊脂糖，纖維素等等)，聚合的胺基酸，胺基酸共聚物和脂質集合體(如油珠或脂質體)。另外，載體可以起免疫刺激藥劑的作用(即，輔劑)。
對於腸胃外給藥，本發明藥劑可以作為可注射的溶液或懸浮液劑給藥，其中活性物質分散於生理學可接受的稀釋劑與藥物載體，它們可以是無菌的液體如水、油類、鹽水、甘油或乙醇。另外，組合物還可以存在輔助的物質，如潤溼劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩衝物質等等。藥物組合物的其他組分為石油產品、動物、植物或人造物質例如，花生油、豆油和礦物油中的成分。通常，二醇如丙二醇或聚乙二醇是優選的液體載體，特別是可注射的溶液。抗體可以以儲留注射劑或注射製劑形式給藥，注射製劑的配製方式應保證活性成分持續釋放。典型的組合物包含5毫克/毫升單克隆抗體，配製於由50mM L-組氨酸，150mM NaCl組成的含水緩衝液中，用HCl調節pH為6.0。
典型地，可注射的組合物製劑既可作為液體溶液也可作為懸浮液；也可以製成適於在注射前在液體賦形劑中形成溶液或懸浮液的固體形式。如上所述，此外該製劑還可以在脂質體或微顆粒如聚交酯，聚乙交酯或共聚物中乳化或形成膠囊，以增強輔劑作用，(見Langer，Science249，1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-119(1997)。本發明藥劑可以以儲留注射劑或注射製劑的形成給藥，注射製劑的配製方式應保證活性成分持續或脈衝釋放。
適於以其他的方式給藥的其他製劑包括口服的，鼻腔內的和肺吸入製劑，栓劑和透皮製劑。
對於栓劑，粘合劑和載體包括，例如，聚亞烷二醇或甘油三酯；這樣的栓劑由含0.5％到10％，優選1％-2％活性成分的混合物組成。口服製劑包括賦形劑，如藥物品級的甘露糖醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素和碳酸鎂。這些組合物的形式可為溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，持續釋放製劑或粉末，含有10％-95％，優選25％-70％的活性成分。
局部施用可以導致透皮或皮內釋放。局部的給藥可以通過與其他藥物，包括霍亂菌毒素或其解毒衍生物或亞單位或其他相似的細菌毒素共同給藥而便利(見Glenn等，Nature 391，851(1998))。共同給藥可以通過使用作為混合物或作為化學交聯得到的連接分子或作為融合蛋白的表達實現。
選擇性地，使用皮膚斑貼或使用轉移體(transferosomes)可以完成透皮釋放(Paul等，Eur.J.Immunol.25，3521-24(1995)；Cevc等，Biochem.Biophys.Acta 1368，201-15(1998))。
F.診斷方法本發明提供檢測針對阿爾茨海默氏病患者或易患阿爾茨海默氏病患者的Aβ肽的免疫反應的方法。該方法對監控患者使用藥物的治療過程特別有用。該方法可用於監控對有症狀病人的治療和對無症狀的病人的預防性治療。該方法可用於監控自動免疫法(例如，在對免疫原給藥作出響應而產生抗體)和被動免疫接種(例如，測量抗體給藥的水平)。
1.自動免疫法某些方法需要測定給藥之前患者的免疫反應基準值，並與治療後的免疫反應比較。該免疫反應值顯著增加(即，大於重複測量同一樣品時的實驗誤差的一般的差額，該差額表示為該測量的一個標準偏差)為正性治療結果的信號(即，該藥劑給藥實現或放大了免疫反應)。如果免疫反應值沒有明顯的變化或降低，表明為負性治療結果。通常，經歷過使用免疫原劑治療的最初過程的患者預計顯示隨連續的劑量增加的免疫反應，最後到達平穩狀態。儘管免疫反應增加，通常繼續給藥。達到平穩狀態表示可以中止或降低給藥劑量或頻率。
在另外的方法中，免疫反應的對照值(即，平均加標準偏差)由對照群體決定。典型地，對照群體中的個體先前未接受治療。然後將患者治療劑給藥後的免疫反應測定值與對照值相比較。相對於對照值的顯著增加(例如，大於平均值的一個標準偏差)顯示正性治療結果。無顯著的增加或降低顯示負性治療結果。儘管免疫反應相對於對照值增加，通常繼續給藥。如前所述，達到相對於對照值的平穩狀態顯示可以中止或降低給藥劑量或頻率。
在另外的方法中，免疫反應的對照值(例如，平均值加標準偏差)由具有使用治療劑治療的經歷並且其對治療的免疫反應達到平穩狀態的個體的對照群體決定。患者免疫反應測定值與該對照值比較。如果患者的測量水平與對照值無明顯的不同(例如超過一個標準偏差)，治療可以停止。如果該水平顯著地低於該對照值，藥劑給藥可以繼續。如果患者的該水平持續在該對照值以下，應該改變治療方法，例如，可能表示需要使用不同輔劑。
在另外的方法中，監控目前不接受治療但是具有上述治療經歷的患者的免疫反應，以確定是否需要恢復治療。可以將該患者的免疫反應測定值與患者以前療程後實現的免疫反應值比較。相對於早先的測量值的顯著降低(即，大於相同樣品重複測量時的一般的誤差界限)顯示治療可以重新開始。或者，患者的上述測量值可以與經歷一個療程後的病人群體的對照值(平均值加標準偏差)比較。或者，患者的該測定值可以與無病症的預防治療病人的群體，或顯示疾病特徵改善的治療病人的群體的對照值比較。在所有這些情況中，相對於對照水平顯著的降低(即，超過一個標準偏差)顯示患者的治療應該重新開始。
用於分析的組織樣品通常是來自患者的血液，血漿，血清，粘液或腦脊髓液。分析樣品以指示對感興趣的澱粉樣組分，如任何形式的Aβ肽的免疫反應。可以從，例如，與感興趣的組分，如Aβ肽結合的抗體或T細胞的存在測定免疫反應。檢測對Aβ特異性的抗體的ELISA方法描述於實施例章節，並可以被用於另外的肽抗原。檢測活性T細胞的方法在本領域為大家所熟知。
2.被動免疫接種通常，用於監控被動免疫接種的方法類似於上面描述的監控自動免疫法的方法。可是，被動免疫接種後的抗體分布圖通常顯示抗體濃度快速的頂點，後面是指數式衰減。不加另外的劑量，在數天到數月的一段時期下降到接近處理前的水平，這取決於給藥抗體的半衰期。例如某些人類抗體的半衰期為20多天。
在某些方法中，給藥之前測量患者對Aβ抗體的基準值，給藥後，很快進行第二次測量，確定抗體水平的峰值，以一定的間隔進行一次或多次另外的測量以監控抗體水平的下降。當抗體水平降至基線或到達預定的頂點減基準值的百分比(例如，50％，25％或10％)時，應給予另外劑量的抗體。在某些方法中，將峰值頂點或隨後的測量值減去背景值與先前對其他病人測定的、具有有益的預防或治療效果的參考值比較。如果該測量抗體水平顯著地小於參考水平(例如，小於受益於治療的病人群體的參考值的平均值減去一個標準偏差)，表明應該給予另外劑量的抗體。
3.診斷的試劑盒本發明還進一步提供了實施上述診斷方法的診斷試劑盒。典型地，這樣的試劑盒包含特別地與澱粉樣的斑點組分，如Aβ結合的抗體，或與對該組分特異的T細胞反應的藥劑。該試劑盒還可以包括標記物。對於Aβ抗體的探測，該標記物通常是標記的抗個體基因型抗體的形式。對於抗體的探測，藥劑可以預先結合到固相，如微量滴定碟的孔中。對於活性T細胞的探測，該標記物可以作為3H-胸腺嘧啶脫氧核苷測量增殖反應。試劑盒也典型地包含該試劑盒用法說明的標記。該標記可能同時包括與具有Aβ抗體或與Aβ反應的T細胞的水平的測量標記有關的圖表或其他相應的體系。術語標記指在試劑盒的製造，轉運，銷售或使用的任何時候附著於或以其他方式伴隨試劑盒的任何書寫或記錄材料。例如，術語標記包括散頁廣告和小冊子，包裝原料，指導，錄音帶或錄像帶盒，電腦磁碟以及直接在試劑盒上的書寫印記。
實施例
I.針對阿爾茨海默氏病(AD)Aβ的預防效果這些實施例描述對在位置717突變(APP717V-F)而過度表達APP，使其產生阿爾茨海默病樣的神經病理的轉基因小鼠使用Aβ42肽。這些小鼠(PDAPP小鼠)的準備和特徵描述於Games等，Nature，同上。這些雜合子形式的動物在六月齡前開始沉澱Aβ。到十五月齡，它們顯示相當於阿爾茨海默氏病的Aβ沉澱水平。對PDAPP小鼠注射聚集的Aβ42(聚集的Aβ42)或磷酸鹽緩衝鹽水。選擇聚集的Aβ42是因為它具有誘導針對Aβ多表位的抗體的能力。
A.方法1.小鼠的來源將三十隻PDAPP異種的雌性小鼠隨機地分成下列的組10隻小鼠用於注射聚集的Aβ42(一隻死於運輸)，5隻小鼠注射PBS/輔劑或PBS，10隻為未注射對照組。五隻小鼠注射從血清澱粉樣蛋白(SAP)序列衍生的肽。
2.免疫原的製備聚集的Aβ42的製備將二毫克Aβ42(US Peptides Inc，lot K-42-12)溶於0.9毫升水，通過添加0.1毫升10x PBS達到1毫升。將其渦流並在37℃溫育過夜，以此條件下肽發生聚集。不用的Aβ以凍乾粉末在-20℃保存直到下次注射。
應當注意的是，當使用市場上可買到的肽時，乾重可能包括鹽的重量；除非另有說明，本申請全部的實施例所述的重量包括鹽的重量。可使用該製劑的標準測定法，如氮測定，與已知的組合物結合，測定肽的精確質量。
3.注射製劑每次給小鼠注射處於PBS中的100μg聚合的Aβ42，用完全弗氏佐劑(CFA)乳化使乳劑最終體積為400μl，用於第一次免疫接種。2周內接著增加同樣量的弗氏不完全佐劑(IFA)中的免疫原。以每月的間隔給予兩次附加劑量(IFA中的)。隨後按每月間隔以500μl PBS免疫接種。腹膜下注射(i.p.)。
按照相同的日程表注射PBS，每隻小鼠注射400μl PBS/輔劑1∶1混合物，或每隻小鼠注射500μl PBS。SAP注射同樣遵循相同的日程表，每次注射的劑量為100μg。
4.小鼠血液的滴定，組織製備和免疫組織化學上述方法在下文的「一般原料和方法」中描述。
B.結果對PDAPP小鼠注射聚集的Aβ42(聚集的Aβ42)，SAP肽，或磷酸鹽緩衝鹽水。一組PDAPP小鼠剩下作為未注射的，陽性的對照。隔月監控小鼠對聚集的Aβ42的滴定度，從第四個月直到該小鼠一歲。小鼠在13月齡死亡。在所有測試點中，九分之八的聚集Aβ42的小鼠產生高抗體滴度，在全部一系列注射中持續很高(滴定度大於1/10000)。九分之一小鼠具有低的，但是可測量的滴定度，大約1/1000(圖1，表3)。對於這個免疫原，SAPP注射小鼠具有1∶1,000到1∶30,000的滴定度，只有唯一的小鼠超過1∶10,0000。
表3A注射聚集Aβ的小鼠在50％最高O.D.的滴度
表3B注射1/100免疫原的PBS的小鼠在50％最高O.D.的滴度
在六，十和十二月將來自PBS處理的小鼠的血清進行針對聚集的Aβ42滴定。以PBS1/100稀釋物注射小鼠，針對聚集的Aβ42滴定，只有一個數據點超過背景4倍，而在所有其他時間點都小於背景的4倍(表3)。SAP特定反應在這些時間點可以忽略，滴定度都小於300。
聚集的Aβ1-42處理組九隻小鼠中的七隻的腦中沒有檢測到澱粉樣變性。相反，SAP和PBS組小鼠大腦的海馬體，以及額側和扣帶皮層的腦組織包含許多的澱粉樣的沉澱。沉澱圖譜類似於未經處理的對照組，特徵為包括有弱點的亞區，如海馬體齒狀腦回的外分子層。Aβ1-42注射組的一隻小鼠大大地減少澱粉樣的負荷，限於海馬體內。分離的斑點與另一隻Aβ1-42處理組小鼠等同。
海馬體澱粉樣的負荷的定量圖像分析證實了Aβ42(AN1792)處理動物實現極大的減少(圖2)。PBS組(2.22％)和未經處理的控制組(2.65％)的澱粉樣的負荷的平均值顯著地大於AN1792免疫組(0.00％，p＝0.0005)。相反，SAP肽(SAPP)免疫組平均值是5.74％。未經處理的對照組小鼠海馬體，以及脾後皮層腦組織包含許多的Aβ澱粉樣的沉澱，將其用Aβ特異的單克隆抗體(mAb)3D6檢驗。在SAPP或PBS免疫的小鼠中也可見澱粉樣的沉澱的相似圖譜(圖2)。另外，後面的三個組的特徵為包括有弱點的腦亞區，一般在AD可見，如海馬齒狀回的外分子層，三個組都可發現。
不包含Aβ沉澱的腦也沒有在具有人類APP抗體8E5的PDAPP小鼠中檢驗的神經炎的斑點。來自其他組的所有腦(SAP-注射，PBS和未注射小鼠)具有許多的未經處理的PDAPP小鼠的一般的神經炎的斑點。少數神經炎斑點存在於用AN1792處理的一隻小鼠中，在用AN1792處理的第二隻小鼠中發現營養不良的軸突的單一的簇。海馬體的圖像分析顯示於圖3，證明AN1792處理小鼠(平均值0.00％)比PBS處理小鼠(平均值0.28％，p＝0.0005)更有效消除營養不良的軸突。
Aβ1-42注射組腦中也沒有星形細胞增生斑點有關的炎症。其他組小鼠的大腦包含大量的和成簇的GFAP-陽性的星形細胞，典型的Aβ斑點有關的神經膠質增生。將GFAP起作用的載玻片用硫代吖黃素S復染定位Aβ沉澱。在SAP，PBS和未經處理的對照組中GFAP陽性的星形細胞與Aβ斑點有關。在負性斑點Aβ1-42處理的小鼠中沒有發現此種相關性，而在一隻用AN1792處理的小鼠中識別出了最低與斑點相關的神經膠質增生。
顯示於圖4的脾後皮層的圖像分析證實，用AN1792處理組顯著地減少星形細胞增生，平均值為1.56％，比SAP肽、PBS免疫組或未經處理的組平均值大6％(p＝0.0017)。
來自Aβ1-42和PBS注射小鼠的子集的證據顯示Aβ1-42注射的小鼠未產生與斑點相關的MHCII免疫活性，與缺少Aβ有關的炎症性反應一致。
該小鼠腦切片也與MAC-1，一種細胞表面蛋白，特異的單克隆抗體mAb起反應。MAC-1(CD11b)是整聯蛋白族單元，與CD18形成雜二聚物存在。CD11b/CD18複合體存在於單核細胞，巨噬細胞，嗜中性白細胞和天然殺傷細胞(Mak和Simard)。腦中MAC-1-反應細胞型可能是以MAC-1免疫反應中的相似表型的形態學為基準的小神經膠質。用AN1792處理小鼠的腦中的與斑點相關的MAC-1標記物小於PBS對照組，與缺乏Aβ誘導炎症性的反應一致。
C.結論Aβ1-42注射小鼠腦中的Aβ斑點，反應性二乙基溴乙醯胺和神經膠質增生變化的缺乏顯示它們的腦中沒有或僅有很少的澱粉樣的沉澱，不存在如神經膠質增生和神經炎病狀的病理的結果。用Aβ1-42處理的PDAPP小鼠基本上與對照組非轉基因小鼠相同，無病理反常。因此，Aβ1-42注射在防止人類腦組織Aβ沉澱或間隙，消除隨後的二乙基溴乙醯胺和炎症性的退行性病變方面卓有成效。因此，使用Aβ肽可以預防和治療AD。
II.劑量反應研究用300，100，33，11，3.7，1.2，0.4，或0.13μg配製於CFA/IFA中的Aβ腹膜下給藥，使五周齡雌性Swiss Webster小鼠組(N＝6每組)免疫。以雙周間隔給藥三次，一個月以後第四次給藥。首次給藥用CFA乳化，其餘用IFA乳化。第二次給藥後，免疫接種後4-7天給動物放血，測量抗體滴度。用11，33，300μg抗原免疫的動物以大約每月一次的間隔另外放血四個月，接著第四次免疫接種，監控大範圍劑量致免疫製劑抗體反應的下降。開始研究後七個月動物接受最後的第五次免疫接種。一周以後將其殺死，測量對AN1792的抗體反應，進行毒理學分析。
觀察從300到3.7μg的下降劑量反應，在兩個最低的劑量沒有反應。11-300μg抗原3個劑量後的平均抗體滴度約1∶1000，4個劑量後約1∶10,000(見圖5)。
儘管抗體滴度顯著地增長，第三次免疫接種之後最低的劑量組使GMTs在從5到25倍範圍內增加。甚至0.4μg時也可檢測到低抗體反應。1.2和3.7μg組具有與約1000的GMTs可比較的滴定度，最高的四個劑量與約25000GMTs接近，只有33μg劑量組具有降低的3000GMT。第四次免疫接種後，對於大多數組滴定度增加更加緩慢。清晰的劑量反應跨越從0.14μg到11μg的抗原劑量組，0.14μg時沒有可檢測出的抗體，11μg時GMT為36000。此外，11到300μg四個最高的劑量組的滴定度擁擠在一起。因此，兩次免疫接種後，抗體滴度取決於抗原劑量，該劑量跨越0.4到300μg的範圍。通過第三次免疫接種，最高的四個劑量的滴定度都類似，附加免疫接種後保留在平穩狀態。
第四次免疫接種後一個月，300μg組滴定度比免疫接種後五天取得的血液計算的滴定度高2到3倍(圖6)。這個結果顯示頂點記憶的抗體反應發生於免疫接種後5天。在33μg劑量可觀察到更適度的(50％)增加。最後一次劑量後兩個月，300μg劑量組GMTs急劇地下降約70％。另一個月後，下降幅度減小，為45％(100μg)，33和11μg劑量組約為14％。因此，免疫接種停止後循環抗體滴定度遞減速度好象是雙相的，最大靈敏度後第一個月急劇下降，隨後是適度比率的降低。
Swiss Webster小鼠的抗體滴度和反應動力學類似於以並行方式免疫的年輕的雜合的PDAPP轉基因小鼠。誘導人類免疫反應的有效劑量典型地類似於小鼠的有效劑量。
III.針對形成的AD的治療效能的篩選這個測定用來試驗致免疫的藥劑阻止或換向年長的動物AD的神經病理特徵的活性。42個胺基酸的長鏈Aβ(AN1792)的免疫接種從澱粉樣的斑點已經存在於PDAPP小鼠的腦中開始。
在這個用於本研究的時間過程中，未經處理的PDAPP小鼠產生一些神經變性的變化，類似於AD中發現的變化(Games等，同上和Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，1550-1555(1997))。Aβ沉澱變成澱粉樣的斑點與由稱為營養不良的軸突異常的軸突和樹突成份組成變性的二乙基溴乙醯胺反應有關。被營養不良的軸突包圍並包含營養不良的軸突的澱粉樣的沉澱被稱為神經炎斑點。AD和PDAPP小鼠的具有與眾不同的球狀組織的營養不良的軸突是免疫活性的，具有辨認APP和細胞骨架組分的抗體的嵌板，並顯示超微結構水平的複合體亞細胞退行性病變。這個特徵對應於PDAPP腦中的神經炎的蝕斑形成的疾病，選擇的和可重構的測量。用對於人類APP(單克隆抗體8E5)特定的抗體容易地檢驗PDAPP神經炎的斑點的營養不良的二乙基溴乙醯胺組分，也可通過計算機輔助的圖像分析容易地測量。因此，除測量AN1792關於澱粉樣的蝕斑形成的作用之外，我們監控這個治療對於神經炎的營養不良的發展的作用。
星形細胞和小神經膠質是響應和反射二乙基溴乙醯胺傷害度的非二乙基溴乙醯胺細胞。GFAP-陽性的星形細胞和MHCII-陽性的小神經膠質常見於AD，隨著疾病的嚴重，它們的活性提高。因此，我們也監控AN1792-處理小鼠的活性的星形細胞和小神經膠質細胞的發展。
A.原料和方法將四十八隻從Charles River得到的11到11.5月齡的雜合的雌性PDAPP小鼠隨機地分成兩個組24隻小鼠用100μg AN1792免疫，24隻小鼠用PBS免疫，均與弗氏佐劑相結合。到達～15月齡時AN1792和PBS組再一次分組。在15月齡各將AN1792-和PBS-處理組大約一半的動物安樂死(n＝10和9，分別地)，其餘的繼續接受免疫接種直到在18月時結束(n＝9和12，分別地)。總共8隻動物(5隻AN1792，3隻PBS)死於研究期間。除免疫動物之外，將一歲(n＝10)，15個月大(n＝10)和18個月大(n＝10)未經處理的PDAPP小鼠進行ELISAs對比，測量腦中Aβ和APP水平；一歲動物也將包括在免疫組織化學的分析內。
除非另有說明，方法如同實施例I。AN1792的US肽lot 12和加利福尼亞肽lot ME0339用來製備抗原，用於在15個月時點之前的六種免疫接種給藥。加利福尼亞肽lots ME0339和ME0439用於在15和18月之間的三次附加免疫接種給藥。
為了免疫接種，將200μl PBS中的100μg AN1792或單獨的PBS用完全弗氏佐劑(CFA)或弗氏不完全佐劑(IFA)1∶1(vol∶vol)乳化或PBS的最終體積為400μl。第一次免疫接種用CFA作為輔劑進行，接下來四個劑量用IFA進行，最後的四個劑量用不添加輔劑的PBS進行。總共九次免疫接種經歷七個月周期，前三個劑量預定兩周內完成，後面剩餘的注射的間隔為四周。四個月試驗組，安樂死在15月齡進行，只接收到第一個6次免疫接種。
B.結果1.Aβ42(AN1792)對於澱粉樣的負荷的治療效果通過顯示於圖7的定量的圖像分析測定AN1792治療治療皮層的澱粉樣負荷的結果。未經處理的12個月大的PDAPP小鼠組的皮層的澱粉樣負荷的平均值是0.28％，表示研究開始時小鼠產生斑點。在18個月，在PBS處理組澱粉樣的負荷增加17倍達到4.87％，而AN1792處理小鼠大大地減少了澱粉樣的負荷，僅為0.01％，明顯小於12月齡未經處理的和15和18月齡PBS處理組。接受AN1792組在15月(96％減少；p＝0.003)和18月(＞99％減少；p＝0.0002)顯著地降低了澱粉樣的負荷。
典型地，PDAPP小鼠皮層的澱粉樣沉澱開始在額側和脾後皮層(RSC)，在腹側橫向發展，到達顳部和內鼻部皮層(EC)。在12月齡小鼠EC中很少或沒有發現澱粉樣變性，這接近AN1792第一次給藥的年齡。AN1792治療4個月後，RSC中澱粉樣的沉澱大大地減少，通過AN1792治療，EC的進行性介入完全消除。後面的觀測顯示AN1792完全停止了一般侵入顳的和腹側的皮層的澱粉樣變性的發展，而且阻止或可能反轉了RSC中的沉澱。
通過已經處理七個月的18月組可以進一步證明AN1792治療PDAPP對小鼠生長的皮層澱粉樣負荷的優良效果。AN1792處理小鼠中發現皮層的澱粉樣變性接近完全消失，分散斑點總數減少，緻密的沉澱也在減少。
2.Aβ42(AN1792)治療有關的細胞和形態變異
Aβ陽性細胞群體發現於典型地包含澱粉樣沉澱的腦區。明顯地，接受AN1792的幾例中，極少或沒有發現細胞外的皮層澱粉樣斑點。大多數Aβ免疫活性似乎包含在具有大量小葉片的細胞或塊狀體細胞內部。顯形地，這些細胞類似激活的小神經膠質或單核細胞。它們是免疫活性的，具有辨認通過激活單核細胞和小神經膠質(MHC II和CD11b)表達的配位體的抗體，偶而與血管的壁或腔有關。比較用有Aβ和MHCII特異的抗體標記的鄰近的切片，顯示這些細胞的放射性物質通過兩類抗體辨認。詳細檢查AN1792處理的腦，顯示MHCII陽性的細胞只限於這些動物保留的澱粉樣變性的鄰近位置。在使用的固定條件下，該細胞對於辨認T細胞(CD3，CD3e)或B細胞(CD45RA，CD45RB)配位體或白血球共同抗原(CD45)的抗體沒有免疫活性，但是對於辨認與單核細胞交叉反應的白涎(leukosialin)(CD43)是有活性的。在任何PBS處理小鼠中未發現這樣的細胞。
PDAPP小鼠在海馬體齒狀回外分子層恆定地生長大量澱粉樣沉澱。沉澱在穿通(perforant)通道內部形成明顯的條紋，AD中傳統地包含澱粉樣的斑點的亞區。PBS處理小鼠特徵性地出現這些沉澱，類似於未經處理的PDAPP小鼠先前的特性。由分散和緻密的斑點組成的澱粉樣的沉澱為連續帶狀形式。相反，一些來自AN1792處理小鼠大腦的圖譜徹底改變了這種形式。海馬體澱粉樣的沉澱不再包含擴散的澱粉樣變性，該帶狀的圖譜完全分裂。反而，存在一些異常的疹殼構造，它們與抗Aβ抗體反應，有些好象是包含澱粉樣變性的細胞。
MHC II陽性細胞經常在AN1792處理動物的細胞外的澱粉樣變性附近觀察到。與具有澱粉樣變性的Aβ陽性細胞有關的圖譜與某些來自AN1792處理小鼠的大腦非常相似。這些單核細胞的分布只限於澱粉樣的沉澱的附近，缺少Aβ斑點的其他大腦區域完全不存在。
MHC II和MAC I標記的切片的定量圖像分析顯示AN1792處理小鼠的RSC和海馬體免疫活性比PBS組趨向增加，這對於海馬體MAC 1活性的測量具有意義。
這些結果顯示大腦區域斑點中的澱粉樣變性可用活性的細胞調解的方法除去。
3.AN1792對Aβ水平的影響ELISA測定(a)皮層水平在未經處理的PDAPP小鼠中，12月齡皮層中總的Aβ水平的平均值是1,600ng/g，15月時增加到8,700ng/g(表4)。在18月該值為22,000ng/g，在實驗的時間過程期間增加超過10倍。PBS處理動物15月時總的Aβ為8,600ng/g，在18月增加到19,000ng/g。相反，AN1792處理動物在15月時總的Aβ比PBS免疫組減少81％(1,600ng/g)。18月時AN1792組總的Aβ(5,200ng/g)比PBS組顯著地減少(p＝0.0001)(表4)，換句話說Aβ的存在減少72％。比較皮層的Aβ42水平得到相似的結果，即AN1792處理組包含少得多的Aβ42，但在這種情況下，在15月(p＝0.04)和18月(p＝0.0001，表4)時，AN1792和PBS組的差異是顯著的。
表4皮層中平均Aβ值(ng/g)
*p＝0.0412**p＝0.0001(b)海馬體水平在未經處理的PDAPP小鼠中，十二月齡組海馬體中總的Aβ水平的平均值是15,000ng/g，15月時增加到51,000ng/g，18月時增加到81,000ng/g(表5)。同樣地，PBS免疫小鼠在15月和18月分別地顯示40,000ng/g和65,000ng/g。
AN1792免疫動物顯示較少的總的Aβ，在15月和18月各自為25000ng/g和51000ng/g。AN1792處理組18月時的值比PBS處理組顯著地降低(p＝0.0105；表5)。Aβ42的測量給出相同的結果圖譜，即在18月時評價的AN1792處理組水平比PBS組顯著地降低(分別為39,000ng/g對57,000ng/g，p＝0.002)(表3)。
表5海馬體中平均Aβ值(ng/g)
*p＝0.0105**p＝0.0022(c)小腦的水平12月時，未經處理的PDAPP小鼠小腦的總的Aβ水平的平均值是15ng/g(表6)。在15月，這些平均值增加到28ng/g，18月增加到35ng/g。PBS處理動物15月時總的Aβ的平均值為21ng/g，在18月增加到43ng/g。AN1792處理動物15月時總的Aβ為22ng/g，18月時的總的Aβ(25ng/g)明顯少於(p＝0.002)PBS組的相應值(表6)。
表6小腦中平均Aβ值(ng/g)
*p＝0.00184.AN1792治療對APP水平的效果APP-α和全長的APP分子都包含全部的或部分的Aβ序列，因此可能通過AN1792引導的免疫反應影響。在研究數據中，APP水平輕微的增加顯示PDAPP小鼠神經病理學的增加。在皮層中，通過治療該皮層的APP-α/FL(全長)或者APP-α的水平基本上無變化，但是AN1792處理組比PBS處理組的APP-α在18月時減少了19％。AN1792處理組18月時的APP值與未經處理組的12月和15月時和PBS組15月時的值沒有顯著的不同。
在所有情況下，APP值仍然處於通常在PDAPP小鼠中所發現的範圍。
5.AN1792治療神經變性的和神經膠質增生反常的效果AN1792處理小鼠比PBS組在15(84％；p＝0.03)和18(55％；p＝0.01)月齡額側的皮層神經炎的斑點負荷顯著地降低(圖8)。PBS組15到18月齡時的神經炎的斑點負荷的平均值從0.32％增加到0.49％。與此形成對照，ANI792組神經炎的斑點的發展大大地減少，在15和18月組神經炎的斑點負荷平均值分別地為0.05％和0.22％。
ANI792免疫接種似乎具有良好的相容性，AN1792處理小鼠比PBS組在15(56％；p＝0.011)和18(39％；p＝0.028)月齡時在RSC中的反應性的星形細胞增生顯著地降低(圖9)。PBS組15和18月時的星形細胞增生百分率的平均值從4.26％增加到5.21％。AN1792處理組在同一時間星形細胞增生分別地降低到1.89％和3.2％。這顯示神經纖維網沒有被間隙處理損害。
6.抗體反應如上所述，使十一個月大的，雜合的PDAPP小鼠(N＝24)接受100μg被弗氏佐劑乳化的ANI792系列5次免疫接種，在0，2，4，8，和12周腹膜下給藥，在16周用PBS單獨進行(沒有弗氏佐劑)第六次免疫接種。作為陰性對照，使24隻相配轉基因小鼠在並行位置接受用相同輔劑乳化的PBS的免疫接種，日程表相同。從第二次接種開始，在每次接種的三到七天內給動物放血。通過ELISA測定針對ANI792的抗體反應。第二，第三和最後(第六)給藥後，用ANI792免疫的動物的幾何平均滴定度(GMT)大約分別為1900，7600，和45000。第六次免疫接種後沒有測量到對照動物的Aβ特異性抗體。
大約一半的動物又處理另外的三個月，在大約20，24和27周接受免疫接種。這些劑量在沒有弗氏佐劑的單獨的PBS賦形劑給藥。在此周期內平均抗體滴度無變化。事實上，從第四到第八次放血，抗體滴度看起來保持穩定，這相當於第五到第九次注射的周期。
為了測定免疫接種是否誘導Aβ特異的抗體，即AN1792處理小鼠的血清是否與大腦澱粉樣的沉澱有關，將AN1792和PBS處理小鼠切片的子集與抗體特異的小鼠IgG起反應。與PBS相反，AN1792處理大腦中的Aβ斑點被內源的IgG包裹。兩組之間的這些差異可見於15和18月組。特別驚人的是PBS組缺乏標記，儘管這些小鼠中存在大量的澱粉樣的負荷。這些結果表明用合成的Aβ蛋白質免疫接種產生可辨認並且在體內與澱粉樣的斑點中的Aβ結合的抗體。
7.細胞介導的免疫反應第九次免疫接種7天後，從九隻AN1792免疫和12隻PBS免疫的18個月大的PDAPP小鼠除掉脾。將脾細胞分離並且在Aβ40，Aβ42，或Aβ40-1(倒序蛋白質)存在下培養72小時。促細胞分裂劑ConA充當陽性對照。最優的反應由＞1.7μM蛋白質得到。全部的九隻AN1792處理動物的細胞響應Aβ1-40或者Aβ1-42蛋白質增殖，具有與兩個蛋白質結合相等的水平(圖10，上圖)。對Aβ40-1反轉蛋白質未反應。對照動物細胞與任何Aβ蛋白質沒有反應(圖10，下圖)。
C.結論這些研究結果表明PDAPP小鼠AN1792免疫接種使已有的澱粉樣的沉澱發展減緩，阻止進行性的澱粉樣的沉澱，延遲年長的PDAPP小鼠大腦繼發性的神經病理改變。用AN1792免疫接種基本上停止一般屬於澱粉樣變性的結構的澱粉樣的生長。因此，Aβ肽給藥可以治療AD。
IV.Aβ片段的篩選用9個不同的區域的APP和Aβ使100隻9-11月齡PDAPP小鼠免疫，確定有效傳達反應的表位。如上所述，將9種不同的免疫原和一種對照物腹膜內注射。免疫原包括四種人類Aβ肽共軛體1-12、13-28、32-42、1-5，全部通過胱氨酸連接與羊抗小鼠IgG偶聯；APP多肽胺基酸592-695，聚集的人類Aβ1-40，聚集的人類Aβ25-35，和聚集的齧齒動物Aβ42。聚集的Aβ42和PBS分別用作正反對照。每試驗組使用十隻小鼠。滴定度監控如上，注射4個月後處死小鼠。死後測定組織化學，Aβ水平和毒理學分析。
A.材料和方法1.免疫原的製備偶聯的Aβ肽的製備通過使用交聯試劑硫代EMCS將加入Aβ肽的人造的半胱氨酸偶聯，製備四種人類Aβ肽共軛體(胺基酸殘基1-5、1-12、13-28和33-42，各自與羊抗小鼠IgG共軛)。該Aβ肽衍生物可用下列最終的胺基酸序列合成。在所有情況下，嵌入半胱氨酸殘基的位置通過下劃線顯示。如下所示，Aβ13-28肽衍生物也具有兩個加在羧基末端半胱氨酸之前的甘氨酸殘基。
Aβ1-12肽 NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH(SEQ ID NO30)Aβ1-5肽 NH2-DAEFRC-COOH(SEQ ID NO31)Aβ33-42肽NH2-C-氨基庚酸-GLMVGGVVIA-COOH(SEQ ID NO32)Aβ13-28肽Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH(SEQ ID NO33)為了進行偶聯反應，將十毫克羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)用10mM硼酸鈉緩衝液，pH8.5，透析過夜。然後使用Amicon Centriprep管將透析的抗體濃縮到2毫升體積。十毫克硫代-EMCS[N(γ-馬來醯亞胺基己醯氧基)琥珀醯亞胺](Molecular SciencesCo.)溶於一毫升去離子水。攪拌下在羊抗小鼠IgG中滴加40倍摩爾過量的硫代-EMCS，然後將該溶液再攪拌十分鐘。使激活的羊抗小鼠IgG通過10毫升用0.1M NaPO4，5mM EDTA，pH6.5平衡的凝膠過濾柱(PiercePresto Column，得自Pierce Chemicals)純化並且更換緩衝液。通過280nm的吸收率測定包含片斷的抗體，將其匯合併且稀釋到大約1毫克/毫升的濃度，使用1.4毫克/OD作為消光係數。將40倍摩爾過量的Aβ肽溶於20毫升10mM NaPO4，pH8.0的緩衝液，其中10毫克Aβ33-42肽首先溶於0.5毫升DMSO，然後用10mM NaPO4緩衝液稀釋到20毫升。肽溶液分別被加到10毫升激活羊抗小鼠IgG，並且在室溫下搖動4小時。使用AmiconCentriprep管將所得共軛體濃縮到小於10毫升，然後針對PBS透析，更換緩衝液，並且除去游離的肽。將該共軛體通過0.22μm孔徑大小過濾器滅菌，然後等分成1毫克的部分並且在-20℃冷凍存儲。使用BCA蛋白質方法(Pierce Chemicals)，使用馬IgG標準曲線，測定該共軛體濃度。根據相對於激活羊抗小鼠IgG的共軛的肽的分子量增加證明共軛作用。Aβ1-5羊抗小鼠共軛是兩個共軛作用的結合，其餘來自於單一製劑。
2.聚集的Aβ肽的製備將已經在-20℃存儲乾燥的人類1-40(AN1528；California PeptidesInc.，Lot ME0541)，人類1-42(AN1792；California Peptides Inc..LotsME0339和ME0439)，人類25-35和齧齒動物1-42(California PeptidesInc.，Lot ME0218)肽的冷凍乾燥粉末新鮮溶液化，製備各類注射劑。為了這個目的，將兩毫克肽加入0.9毫升去離子水，將該混合物渦旋產生相對均勻的溶液或懸浮液。在四個肽中，AN1528是唯一在此步驟溶解的肽。然後在AN1528開始沉澱時添加100μl 10X PBS等分試樣(IXPBS0.15 NaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.5)。將該懸浮液再渦旋一次在37℃培養過夜，以備第二天使用。
pBx6蛋白質的製備按照Oltersdorf等，J.Biol.Chem.265，4492-4497(1990)所述，製備表達質粒編碼pBx6，一種由100胺基酸噬菌體MS-2聚合酶氨基末端前導序列，後面是胺基酸592-695的APP(βapp)組成的融合蛋白。將該質粒轉入大腸桿菌，並在引入啟動子後表達蛋白質。該細菌在8M尿素中溶解，製備SDS PAGE部分地純化pBx6。通過使用兔抗pBx6多克隆抗體通過蛋白質印跡法測定包含pBx6的片段，合併，使用Amicon Centriprep管濃縮並針對PBS透析。通過考馬斯藍染色的SDS PAGE判斷該製劑的純度大約是5到10％。
B.結果與討論1.研究設計一百隻雌或雄的九到十一個月齡雜合的PDAPP轉基因小鼠由Charles River實驗室和Taconic實驗室得到。將這些小鼠分成十組，使用與弗氏佐劑相結合的不同區域的Aβ或APP免疫。動物分配的原則是每組動物的性別、年齡、血統和來源儘可能接近。免疫原包括四個源自人類序列的Aβ肽1-5、1-12、13-28和33-42，各與羊抗小鼠IgG共軛；四個集合的Aβ肽人類1-40(AN1528)、人類1-42(AN1792)、人類25-35和齧齒動物1-42；以及融合的多肽，指定為pBx6，包含APP胺基酸殘基592-695。第十組是同輔劑相結合的PBS免疫對照組。
對於各免疫接種組，將200μl PBS中的100μg各種Aβ肽或在相同量的PBS中的200μg APP衍生物或單獨的PBS用完全弗氏佐劑(CFA)1∶1乳化(體積∶體積)以400μl的最終容積進行第一次免疫接種，隨後增加同樣量的弗氏不完全佐劑(IFA)中的免疫原進行隨後的四個劑量以及以PBS為最終的劑量。
前三個劑量兩周一次，然後每月一次的免疫接種在腹膜下進行。第二次接種後，在每次免疫接種後4-7天給動物放血，測量抗體滴度。最終的劑量後約一周將動物處死。
2.腦中的Aβ和APP水平以各種Aβ肽或APP衍生物免疫接種約四個月後，除掉鹽水灌注動物的大腦。一個大腦半球用於免疫組織化學的分析，第二個用於Aβ和APP水平的定量分析。為了測量各種形式β澱粉樣的肽和澱粉樣的前體蛋白的濃度，將該大腦半球解剖，在5M胍中製備海馬體、皮層和小腦區域的勻漿。將其稀釋，通過與一系列已知濃度的Aβ肽或APP的標準樣品的稀釋物相比以ELISA形式用數量表示澱粉樣變性或APP的水平。
以PBS免疫的轉基因對照組的海馬體中的總的Aβ的平均濃度比皮層高5.8倍(海馬體組織平均值24，318ng/g，皮層4，221ng/g)。對照組小腦的平均水平(23.4ng/g組織)比海馬體低約1000倍。這些水平類似於我們先前報導的該年齡組雜合的PDAPP轉基因小鼠的水平(Johnson-Woods等，1997，同上)。
對於皮層，試驗組總的Aβ和Aβ1-42水平的平均值與對照組有很大的差別(p＜0.05)，接受AN1792，齧齒動物Aβ1-42或Aβ1-5肽共軛體的試驗組動物示於圖11。這些試驗組與對照組相比，總的Aβ水平的平均值分別減少了75％，79％和61％。在任何組的腦的皮層的區域中的Aβ特異性抗體滴定度和Aβ水平之間具有很難辯別的相互關係。
在海馬體中，與AN1792治療有關的總Aβ的平均減少值(46％，p＝0.0543)不如在皮層中觀察到的(75％，p＝0.0021)大。可是，海馬體中減少的數量卻遠大於皮層，海馬體組織中的淨減少為11,186ng/g，皮層組織為3,171ng/g。對於接受齧齒動物Aβ1-42或Aβ1-5組的動物，總的Aβ水平的平均值分別減少了36％和26％。可是，考慮到該組規模較小且兩組內部動物之間澱粉樣的肽水平的高變異性，這些減少並不顯著。在海馬體中測量Aβ1-42的水平，未到達有意義的治療誘導的減少。因此，由於皮層Aβ負荷較小，這一區域的變化是治療效果更有意義的提示。通過ELISA測量的皮層Aβ水平的變化與免疫組織化學分析的結果相似，但並不相同(見下文)。
同時測量小腦中，通常受AD病理學影響最小的區域，總的Aβ。在所有的以各種的Aβ肽或APP衍生物免疫的組當中，Aβ濃度平均值在該腦區域均與對照組沒有差別。這些結果表明非病理的Aβ水平不受治療影響。
此外通過ELISA測定處理和對照小鼠皮層和小腦中的APP濃度。使用兩種不同的APP測定方法。第一次，指定APP-α/FL，識別APP-α(α，劈開內部Aβ序列的APP隱藏形式)，和APP的全長形式，而第二次僅僅識別APP-α。與試驗組子集中的治療有關的減少相反，所有處理組APP水平與對照動物相比無變化。這些結果顯示Aβ肽免疫接種沒有耗盡APP；處理效應相當地特定於Aβ。
總之，通過用AN1792，齧齒動物Aβ1-42或Aβ1-5共軛體治療，皮層中總的Aβ和Aβ1-42水平顯著地降低。在海馬體中，只有使用AN1792治療實現總的Aβ顯著地減少。在海馬體，皮層或小腦區域，不存在與治療相關的Aβ或APP水平的明顯變化。
2.組織化學的分析對來自六組子集的大腦進行免疫組織化學的分析，三個組用Aβ肽共軛體Aβ1-5，Aβ1-12，和Aβ13-28免疫；兩個組用全長Aβ集合體AN1792和AN1528免疫，對照組用PBS處理。這些組大腦切片澱粉樣的負荷的圖像分析的結果示於圖12。三個治療組的皮層區域的澱粉樣的負荷比對照動物有明顯減少。在AN1792組觀察到最大的澱粉樣的負荷的減少，其平均值減少了97％(p＝0.001)。用AN1528(95％，p＝0.005)和Aβ1-5肽共軛體(67％，p＝0.02)處理的動物也觀察到明顯減少。
通過ELISA定量的總的Aβ或Aβ1-42的結果在某種程度上不同於圖像分析結果。定量的圖像分析測量時，用AN1528治療顯著地影響皮層的澱粉樣的負荷的水平，而ELISA測量的相同區域中的總的Aβ濃度沒有同樣的影響。在兩個結果之間的差異可能應歸於測定的專一性。圖像分析測量僅限於斑點中的不能溶解的Aβ集合體。相反，ELISA可測量Aβ的全部形式，溶解的和不能溶解的，單體的和集合的。因為該疾病通常被認為與不能溶解的Aβ斑點有關，所以圖像分析技術也許更靈敏地顯示處理效果。可是，ELISA是更迅速的和更容易的測定方法，它對篩選非常有用。它可以顯示與斑點的治療相關的Aβ的減少比總的Aβ減少更大。
為了確定處理動物免疫接種引導的Aβ特異的抗體是否與大腦澱粉樣沉澱起反應，使處理動物和對照小鼠切片的子集與抗體特異的小鼠IgG起反應。與PBS組相反，在用Aβ肽共軛體Aβ1-5，Aβ1-12，和Aβ13-28和全長Aβ集合體AN1792和AN1528免疫的動物中，包含Aβ的斑點被內源的IgG包裹。沒有對來自用其它Aβ肽或APP肽pBx6免疫的動物的大腦進行此項分析。
3.抗體滴度的測量從第二次接種後，在每次免疫接種後4-7天給小鼠放血，總共五次放血。使用塗有Aβ1-42塑料多孔盤通過夾心式ELISA測量Aβ1-42結合抗體形式的抗體滴度。如圖13所示，在第四劑量誘發抗體滴度峰值，引導AN1792特定的抗體的滴定度峰值的四個免疫接種劑型為AN1792(頂點GMT94647)，AN1528(頂點GMT88231)，Aβ1-12共軛體(頂點GMT47216)和齧齒動物Aβ1-42(頂點GMT10766)。在第五和第六劑量組後這些組的滴度有些下降。對於其餘的五個免疫原，在第五或第六劑量時達到峰值滴度，其數值比四個最高的滴定度組低得多Aβ1-5共軛體(頂點GMT2356，pBx6(頂點GMT1986)，Aβ13-28共軛體(頂點GMT1183)，Aβ33-42共軛體(頂點GMT658)，Aβ25-35(頂點GMT125)。
抗體滴度以用於該免疫原子集的相同ELISA夾心形式的相應的肽為標準作評價，這些組用Aβ1-5，Aβ13-28，Aβ25-35，Aβ33-42或齧齒動物Aβ1-42免疫。除齧齒動物Aβ1-42免疫原外，滴定度與針對Aβ1-42測量的滴定度大致相同，使用齧齒動物Aβ1-42免疫原時，針對相應的免疫原的抗體滴度大約高兩倍。個體動物的AN1792特異性抗體的數值或試驗組的平均值與所測量的皮層中Aβ減少的效果不相關。
4.淋巴組織增生的反應使用最終的，第六次免疫接種後大約一周收穫的脾細胞測量與Aβ相關的淋巴增生反應。在Aβ1-40存在下，在5μM的刺激濃度下，將每孔105個剛得到的細胞培養5天。在反轉肽，Aβ40-1存在下，將來自十組中七組的細胞培養。作為陽性對照，另外加入T細胞促細胞分裂劑，PHA培養另外的細胞，以及，作為陰性對照，在沒有添加肽的情況下培養細胞。
來自大多數動物的淋巴細胞響應PHA增殖。對Aβ40-1反轉肽沒有顯著的反應。用Aβ1-40刺激時來自用較大的集合體Aβ肽，AN1792，齧齒動物Aβ1-42和AN1528免疫的動物的細胞強健地增殖，接受AN1792時每分鐘計數值(cpm)最高。用Aβ1-12共軛體，Aβ1328共軛體和Aβ25-35免疫的各組中的一隻動物響應Aβ1-40增殖。接受Aβ1-5共軛體，Aβ33-42共軛體，pBx6或PBS的其餘組中，沒有動物對Aβ刺激反應。結果概括於下面的表7。
表7
這些結果顯示AN1792和AN1528刺激強T細胞反應，很可能為CD4+表型。用Aβ1-5免疫的動物沒有Aβ特定的T細胞反應並不奇怪，因為CD4+T細胞辨認的肽表位通常約15個胺基酸長度，但有時也對更短的肽產生低效的功能。因此四個共軛肽的大多數輔助性T細胞表位可能存在於IgG共軛配體中，而不在Aβ區域裡。這些試驗組中的動物極低的增殖反應發生率支持這些假設。因為Aβ1-5共軛體可顯著地減少腦中Aβ的水平，在明顯缺少Aβ特異的T細胞時，通過使用這些肽誘導的免疫反應的效應子似乎是抗體。
融合肽pBx6，包括包含所有Aβ殘基的APP胺基酸592-695缺少T細胞和低抗體反應可能是由於這些特殊的製劑缺乏免疫原性。Aβ25-35集合體缺乏免疫原性可能是由於該肽太小不可能包含好的幫助誘導抗體反應的T細胞表位。可以預料這些肽與載體蛋白的共軛作用可使它產生更高的免疫性。
V.用於被動防護的多克隆抗體的製備用Aβ，加輔劑使125隻非轉基因小鼠免疫並在4-5月處死。收集免疫小鼠血液。從其他的血液組分分離IgG。通過親和色譜法部分地純化對於該免疫原特異的抗體。從每隻小鼠平均得到約0.5-1毫克免疫原特異性抗體，總共60-120毫克。
VI.用對Aβ的抗體被動免疫接種如下所示，給7-9個月大PDAPP小鼠各注射0.5毫克在PBS中的多克隆抗Aβ或特異的抗Aβ單克隆抗體。全部抗體製劑純化至具有低內毒素水平。通過對小鼠注射Aβ片段或更長的形式製備針對該片段的單克隆抗體，製備和篩選雜交瘤能夠獲得該抗體，該抗體特異地與要求的Aβ片段結合而不與其他的不相重疊的Aβ片段結合。
表8
小鼠需要腹膜內注射4個月，維持循環抗體濃度，該濃度通過ELISA滴度測定，ELISA滴度大於1/1000，ELISA限定Aβ42或其他的免疫原。滴定度監控如上，注射6個月後處死小鼠。死後進行組織化學，Aβ水平和毒理學分析。每試驗組使用十隻小鼠。另外的被動免疫接種的研究描述於下面的實施例XI和XII。
VII.不同的輔劑的比較這個實施例比較CFA、明礬、水包油型乳劑和MPL的刺激免疫反應的載量。
A.材料和方法1.研究設計將一百隻由Elm Hill Breeding Laboratories，Chelmsford，MA得到的雌性Hartley系六周齡豚鼠分成十組用同各種助劑相結合的AN1792或其十六碳酸鹽衍生物免疫。七組接受同a)PBS，b)弗氏助劑，c)MPL，d)角鯊烯，e)MPL/角鯊烯，f)小劑量明礬，或g)高劑量明礬(300μgAN1792)相結合的AN1792(33μg，除非另作說明)的注射。兩組接受同a)PBS或b)角鯊烯相結合的AN1792(33μg)的十六碳酸鹽衍生物的注射。最後的第十組接受沒有抗原或另外的助劑的單獨的PBS。對於接受弗氏佐劑的組，第一個劑量用CFA乳化，其餘的四個劑量用IFA乳化。除高劑量明礬組之外給藥的抗原的劑量為33μg，後者為300μgAN1792。對於CFA/IFA為腹膜下注射給藥，其他的組在下肢四頭肌左側和右側交替地肌內注射。前三個劑量兩周一次的給藥，後面兩次劑量每月一次。第二次給藥後開始免疫的6-7天，放血，測量抗體滴度。
2.免疫原的製備兩毫克Aβ42(加利福尼亞肽，Lot ME0339)加入0.9毫升去離子水，將該混合物渦旋產生相對均勻的懸浮液。添加100μl 10X PBS等分試樣(IX PBS，0.15 NaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.5)。將該懸浮液再渦旋一次並在37℃培養過夜，以備第二天使用。不用的Aβ1-42作為冷凍乾燥粉末與乾燥劑在20℃存儲。
在用氫氟酸處理從該樹脂上除去新生肽之前，通過溶於二甲基甲醯胺的棕櫚酸酐與AN1792氨基末端殘基偶聯製備AN1792十六碳酸鹽衍生物。
對於第一次免疫接種，為了製備具有完全弗氏佐劑(CFA)的產生免疫性的劑型(CFA)(組2)，將33μg200μl PBS中的AN1792用CFA乳化1∶1(體積∶體積)，最終體積為400μl。對於隨後的免疫接種，同樣地用弗氏不完全佐劑(IFA)乳化抗原。
對於5和8組，為了製備具有MPL的劑型，將冷凍乾燥粉末(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)加入0.2％含水的三乙胺，最後濃度為1毫克/毫升，渦旋。將該混合物從65到70℃加熱30秒，產生稍微不透明的均勻的膠粒懸浮液。每次注射前重新製備溶液。對於5組注射，使用前立即將16.5μl PBS中的33μg AN1792，50μg MPL(50μl)和162μl PBS在矽酸硼鹽管中混合。
為了製備具有低水包油型乳液的劑型，向PBS中的AN1792加入PBS中的5％角鯊烯，0.5％吐溫80，0.5％斯潘85，達到250μl中的33μgAN1792的最終的單劑量濃度。將該混合物通過兩室處理裝置進行15到20次乳化直到顯微鏡下觀察乳液滴直徑等於標準乳膠粒子的1.0μm的直徑。所得懸浮液是乳白色的。每個系列注射前重新製備乳劑。對於8組，將0.2％三乙胺中的MPL以每劑量50μg的濃度添加到上述乳化的角鯊烯和去垢劑的混合物。對於棕櫚醯衍生物(7組)，將每劑量33μg棕櫚醯NH-Aβ1-42加入角鯊烯並渦旋。然後在渦旋下加入吐溫80和斯潘85。將該混合物加入PBS達到5％角鯊烯，0.5％吐溫80，0.5％斯潘85的最後濃度，並按如上所述，乳化該混合物。
對於製備具有明礬的劑型(9和10組)，將PBS中的AN1792加入Alhydrogel(氫氧化鋁凝膠，Accurate，Westbury，NY)，達到每5毫克明礬33μg(小劑量，9組)或300μg(高劑量，10組)AN1792的濃度，最終的劑量的體積為250μl。將該懸浮液在室溫下溫和地混合4小時。
3.抗體滴度的測量第二次免疫接種後開始免疫的六到七天給豚鼠放血，總共四個次放血。按照General Materials and Methods描述測量針對Aβ42的抗體滴度。
4.組織製備約14周後，通過二氧化碳給藥處死全部豚鼠。收集腦脊髓液，除去大腦，解剖三個大腦區域(海馬體，皮層和小腦)，使用ELISA測量總的Aβ蛋白的濃度。
B.結果1.抗體反應免疫接種後測量抗體AN1792的反應時各種輔劑的效力範圍很廣。如圖14所示，當PBS中的AN1792給藥時，兩或三次免疫接種後沒有檢測到抗體，第四和第五次劑量後檢測到可以忽略的反應，幾何平均滴度(GMTs)僅僅約45。第三劑量水包油乳劑誘導適度的滴度(GMT255)，第四劑量(GMT301)繼續維持，隨後落入最終的劑量(GMT54)。AN1792與300μg明礬結合總是比33μg時更易產生清楚的抗原劑量反應。第四免疫接種後達到抗體反應的頂點，兩次劑量之間的差異為43％，GMTs約1940(33μg)和3400(300μg)。加入MPL的33μg AN1792的抗體反應比抗原(300μg)與明礬結合的劑量所產生的抗體反應的幾乎高十倍。MPL加入水包油乳劑相對於MPL作為唯一的輔劑的劑型的效力差不多低75％。當AN1792的十六碳酸鹽衍生物在PBS中給藥時，完全不產生免疫性，當存在於水包油乳劑時得到適度的滴度，其第三和第四次放血的GMTs分別為340和105。弗氏佐劑產生最高的抗體滴度，頂點GMT約87,000，幾乎比下兩個最有效劑型，MPL和高劑量AN1792/明礬的GMT大30倍。
這個研究中最有前途的輔劑是MPL和明礬。其中，MPL更為可取，因為它產生相同抗體反應的抗原劑量比明礬低10倍。通過增加抗原和/或輔劑劑量以及優化免疫接種程序可以增加免疫反應。對於AN1792來說，水包油乳劑是非常弱的輔劑，將水包油乳劑加入MPL輔劑可減弱單獨的MPL固有的輔劑活性。
2.腦中的Aβ水平在大約14周，將豚鼠深度麻醉，取出腦脊髓液(CSF)，切除大腦，該豚鼠被弗氏佐劑(2組)，MPL(5組)，具有300μg高劑量AN1792的明礬(10組)以及PBS(免疫對照組)(3組)免疫。為了測量Aβ肽水平，將一大腦半球解剖，在5M胍中製備海馬體、皮層和小腦區域的勻漿。將其稀釋並且通過與ELISA形式中的已知濃度的Aβ標準蛋白質的系列稀釋物比較測定。對於所有四個組，Aβ蛋白質在海馬體皮層和小腦中的水平非常相似，儘管由這些劑型引起的抗體對Aβ反應的範圍很廣。海馬體中平均Aβ水平約25ng/g，皮層為21ng/g，小腦為12ng/g。因此，在一些動物中幾乎三個月的Aβ高循環抗體滴度的存在不改變大腦中總的Aβ水平。各組的CSF中的Aβ水平也相當相似。AN1792免疫接種對內生的Aβ缺乏大的作用，顯示免疫反應集中在Aβ病理形成過程。
VIII.小鼠中對不同的輔劑的免疫反應每組10-13隻六周齡雌性Swiss Webster小鼠用於這個研究。在0，14，28，60，90和20天，以200μl的劑量皮下給藥，實現免疫接種。PBS用作所有劑型的緩衝液。在第二個劑量後開始免疫接種的7天給動物放血，通過ELISA分析抗體滴度。每組的處理方案概括於表9。
表9
腳註a開始實驗時小鼠在各組中的只數。
b輔劑註解。所有這些劑型的緩衝液是PBS。對於8組，沒有輔劑，沒有抗原。
各組針對Aβ42的抗體的ELISA滴度示於表10。
表10
該表顯示最高滴度在4，5和18組提供，其中輔劑是125μg MPL，50μg MPL和QS-21加MPL。
IX.不同輔劑的治療效能治療效能研究在PDAPP轉基因小鼠中進行，使用適用於人類的一組輔劑，測定它們對Aβ免疫反應的加強能力，以及誘導大腦中的澱粉樣沉澱的免疫介導的清除能力。
一百八十隻雌或雄的，7.5到8.5個月大的，雜合的PDAPP轉基因小鼠由Charles River實驗室得到。將小鼠分成九組，每組包含15到23隻動物，用AN1792或同各種輔劑相結合的AN1528免疫。將動物按性別、年齡以及血統分配，組內部儘可能接近。輔劑包括明礬，MPL，以及QS-21，各自同兩抗原相結合，弗氏佐劑(FA)僅僅同AN1792相結合。一個額外的組為用在PBS緩衝液中配製的AN1792，加上防腐劑乙基汞硫代水楊酸鈉，沒有輔劑的免疫組。第九組是用單獨的PBS免疫的陰性對照組。
集合的Aβ肽的製備人類Aβ1-40(AN1528；California PeptidesInc.，Napa，CA；Lot ME0541)和人類Aβ1-42(AN1792；CaliforniaPeptides Inc.，Lot ME0439)肽被重新溶解用於從已經在-2℃存儲乾燥的冷凍乾燥粉末製備各組注射製劑。為了這個目的，將兩毫克肽加入0.9毫升去離子水，將該混合物渦旋產生相對均勻的溶液或懸浮液。在這個步驟AN1528是可溶解的，AN1792正好相反。然後在AN1528開始沉澱時添加100μl 10X PBS等分試樣(IX PBS0.15 NaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.5)。將該懸浮液再渦旋一次並在37℃培養過夜，以備第二天使用。
為了用明礬製備製劑(1和5組)，將PBS中的Aβ肽加入Alhydrogel(百分之二含水的氫氧化鋁凝膠，Sargeant，Inc.，Clifton，NJ)，達到每1毫克明礬100μg Aβ肽的濃度。加入10X PBS，1X PBS中的最終的製劑的體積為200μl。在注射之前將該懸浮液在室溫下溫和地混合大約4小時。
對於2和6組，為了製備具有MPL的劑型，將冷凍乾燥粉末(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT；Lot 67039-E0896B)加入0.2％含水的三乙胺至最後濃度為1毫克/毫升，並渦旋。將該混合物在65到70℃加熱30秒，產生稍微不透明的均勻的膠粒懸浮液。該溶液在4℃存儲。對於各組注射劑，使用前立即將每劑量50μl PBS中的100μg肽，50μg MPL(50μl)和100μl PBS在矽酸硼鹽管中混合。
為了製備具有QS-21(3和7組)的劑型，將冷凍乾燥粉末(Aquila，Framingham MA；Lot A7018R)加入PBS，pH6.6-6.7，最後濃度為1毫克/毫升，並渦旋。該溶液在-20℃存儲。對於各組注射劑，使用前立即將每劑量50μl PBS中的100μg肽，25μl PBS中的25μg QS-21和125μ1 PBS在矽酸硼鹽管中混合。
對於第一次免疫接種，為了製備具有完全弗氏佐劑(CFA)的劑型(4組)，將100μg 200μl PBS中的AN1792用完全弗氏佐劑(CFA)乳化1∶1(體積∶體積)，最終體積為400μl。對於隨後的免疫接種，同樣地用弗氏不完全佐劑(IFA)乳化抗原。對於包含輔劑明礬，MPL或QS-21的劑型，將每劑量100μg AN1792或AN1528與明礬(每劑量1毫克)或MPL(每劑量50μg)或QS-21(每劑量25μg)在最終容積為200μl的PBS中混合，後背在肩胛間皮下接種給藥。對於接受FA組，將100μg AN1792用完全弗氏佐劑(CFA)乳化1∶1(體積∶體積)使最終體積為400μl，並用於第一次免疫接種腹膜下給藥，接著對於隨後的五個劑量，增加同樣量的弗氏不完全佐劑(IFA)中的免疫原。對於接受沒有輔劑的組，使10μgAN1792與5μg乙基汞硫代水楊酸鈉在最終容積為50μl的PBS中混合，並皮下給藥。第九對照組只接收200μl PBS皮下給藥。免疫接種的方案為前三個劑量兩周一次，在此以後每月一次，也就是0，16，28，56，85和112天給藥。第二劑量後開始免疫接種六到七天給動物放血，測量抗體滴度。最終的劑量後一周將動物處死。通過大腦中的Aβ和APP水平的ELISA測定和大腦切片中的澱粉樣的斑點的免疫組織化學的評價得到結果。另外，測定Aβ特異性抗體滴度和Aβ有關的增殖的和細胞激動素反應。
表10顯示FA和AN1792引導最高的Aβ1-42抗體滴度，第四次免疫接種後為滴度頂點(頂點GMT75386)，並且在最終的第六次免疫接種後下降59％。由MPL與AN1792引導的頂點平均滴度比FA(頂點GMT28867)產生的平均滴度低62％，3個劑量後也在最初免疫接種方案中達到，接著第六次免疫接種後降至頂點值的28％。QS-21同AN1792相結合產生的頂點平均滴度(GMT1511)比由MPL得到的低5倍。另外該反應的動力學減慢，因為另外的免疫接種要求達到頂點反應。由明礬結合AN1792產生的滴度或多或少地大於QS-21得到的滴度，該反應動力學更加迅速。對於在PBS中用乙基汞硫代水楊酸鈉給藥的AN1792，滴度的頻率和大小僅僅大於單獨的PBS。MPL和AN1528(頂點GMT3099)產生的頂點滴度比AN1792產生的低大約9倍。明礬結合的AN1528非常貧乏地產生免疫性，僅僅在一些動物中產生低滴度。在用單獨的PBS免疫的對照動物中沒有觀察到抗體反應。
表11
腳註a針對Aβ1-42測量的幾何平均抗體滴度數b每組反應物數由ELISA測定的用各種輔劑或乙基汞硫代水楊酸鈉處理12個月大小鼠皮層澱粉樣負荷的AN1792或AN1528的結果示於圖15。在PBS對照PDAPP小鼠中，12月齡小鼠皮層中總的Aβ的平均水平是1,817ng/g。特別地觀察用AN1792加CFA/IFA，AN1792加明礬，AN1792加MPL和QS-21加AN1792處理的小鼠的Aβ降低水平。只有AN1792加CFA/IFA組的降低達到統計上明顯的水平(p＜0.05)。如實施例I和III所示，在15月和18月齡小鼠中減少Aβ水平的免疫接種作用實質上更大。因此，可以預料另外的劑型，特別是AN1792加上明礬，AN1792加MPL和AN1792加QS-21組合物在年長的小鼠的處理中將提供更大的陽性結果。相反，AN1792加防腐劑乙基汞硫代水楊酸鈉顯示的Aβ平均水平與PBS處理小鼠幾乎相同。比較皮層的Aβ42水平時得到相似的結果。PBS對照組的Aβ42的平均水平是1624ng/g。特別地，在分別用AN1792加CFA/IFA，AN1792加明礬，AN1792加MPL和AN1792加QS-21處理的小鼠中觀察到平均水平降低值為403，1149，620和714。AN1792 CFA/IFA試驗組實現了統計學上顯著的減少(p＝0.05)。AN1792乙基汞硫代水楊酸鈉處理小鼠中的平均水平是1619ng/g Aβ42。
X.毒性分析實施例II，III和VII描述的研究結束時收集組織用於病理組織學檢查。另外，來自實施例III和VI的末端血樣用於血液學和臨床化學研究。評價大多數主要的器官，包括大腦，肺，淋巴，胃腸，肝臟，腎，腎上腺和生殖腺。儘管研究動物時偶爾發生傷害，但在AN1792處理和未經處理的動物之間沒有明顯的組織或嚴重傷害差異，與PBS處理或未經處理的動物相比較AN-1528免疫動物沒有獨特的組織病理學損傷。實施例VI中在輔劑組和PBS處理動物之間的臨床化學剖面圖沒有差異。儘管在AN1792處理的動物和實施例VI中的弗氏佐劑相對於PBS處理的動物之間的一些血液學參數之間有顯著的增加，但弗氏佐劑處理中的這類作用是預期的並且伴隨腹膜炎，但不顯示來自AN1792處理的任何副作用。雖然不屬於毒性評價部分，但是作為端點效果的部分，PDAPP小鼠腦病理學被廣泛地考核。在任何研究中沒有發現關於大腦形態學副作用的處理的信息。這個結果表明AN1792處理具有良好的相容性，至少實質上無副作用。
XI.用抗Aβ抗體治療本節描述的試驗是為了測試各種針對Aβ的單克隆和多克隆抗體抑制Aβ在雜合的轉基因小鼠的大腦中的累積的能力。
A.研究11.研究設計六十隻8.5到10.5月齡雌性和雄性雜合的PDAPP轉基因小鼠從Charles River Laboratory獲得。將小鼠分成六組，用針對Aβ的各種的抗體處理。動物分配的原則是每組動物的性別、年齡、血統和來源儘可能接近。如表12所示，抗體包括四個鼠科動物Aβ特定的單克隆抗體，2H3(針對Aβ殘基1-12)，10D5(針對Aβ殘基1-16)，266(針對Aβ殘基13-28並且與單體的而不是集合的AN1792結合)，21F12(針對Aβ殘基33-42)。第五組用Aβ特定的多克隆抗體部分處理(由集合的AN1792免疫接種進行)。陰性對照組接受稀釋劑，單獨的PBS，沒有抗體。
單克隆抗體注射劑量約10毫克/千克(假定小鼠重50g)。平均每七天腹膜下注射給藥，維持抗Aβ滴度超過1000。儘管測量到mAb 266的較低的滴度，這是因為它不與測定中用作捕捉抗原的集合的AN1792很好地結合，為這個組提供了相同的劑量日程表。接受單克隆抗體2H3的組在第一個三周內被中止，因為該抗體在體內被清除得太快。在各劑量之前將動物放血測量抗體滴度。處理延續六個月總共196天。最終的劑量後一周將動物處死。
表12
腳註a.實驗結束時各組小鼠數。全部組開始時每組10隻動物。
b.NA不適用的c.mAb單克隆抗體2.材料和方法a.抗體的製備抗Aβ多克隆抗體用二組動物收集的血液製備。第一個組由100隻6到8周齡的雌性Swiss Webster小鼠組成。它們在0，15和29天用100μg同CFA/IFA相結合的AN1792免疫。第36天用一半劑量的AN1792進行第四次注射。在42天處死動物並抽血，製備血清，合併血清總共得到64毫升。第二組由24隻6到9周齡與PDAPP小鼠同基因未轉人類APP基因的雌性小鼠組成。它們在0，14，28和56天用100μg同CFA/IFA相結合的AN1792免疫。在63天處死動物並抽血，製備血清，合併血清總共得14毫升。合併兩次的血清。使用50％飽和硫酸銨的連續兩次沉澱純化抗體部分。將最終的沉澱針對PBS透析，檢驗內毒素。內毒素水平小於1EU/毫克。
由腹腔積液製備抗Aβ單克隆抗體。通過將濃縮的葡聚糖硫酸鈉加入冰冷的腹腔積液，通過在冰上攪拌，首先使液體脫脂，達到的最後濃度為0.238％。然後攪拌下添加濃縮的CaCl2，至最後濃度為64mM。將該溶液在10000xg離心，丟棄小球。在冰上攪拌上層清液，滴加等量飽和硫酸銨。將該溶液在10000xg離心，丟棄上層清液。將該小球再懸浮，並針對20mM Tris-HCl，0.4M NaCl，pH7.5透析。這部分用PharmaciaFPLC Sepharose Q柱，以從0.4M到0.275M的NaCl 20mM Tris-HCl，pH7.5溶液，反向梯度洗脫。
通過在280nm吸收率辨認抗體峰，合併適當的部分。使用BCA方法測量蛋白質濃度鑑別純化的抗體製劑，純度使用SDS-PAGE。同樣檢驗合併物的內毒素。內毒素水平小於1EU/毫克滴度，小於100的滴度被指定為25的滴定度。
3.腦中的Aβ和APP水平以各種的抗Aβ抗體製劑處理約六月後，除掉鹽水灌注的大腦。一個大腦半球用於免疫組織化學的分析，第二個用於Aβ和APP水平的定量分析。為了測量各種形式β澱粉樣的肽和澱粉樣的前體蛋白(APP)的濃度，將該大腦半球解剖，在5M胍中製備海馬體，皮層，和小腦區域的勻漿。將其系列稀釋，通過與一系列在ELISA中已知濃度的Aβ肽或APP的標準樣品的稀釋物相比測定澱粉樣變性或APP的水平。
通過ELISA測定的皮層和海馬體中的總的Aβ和Aβ1-42的水平和小腦中的總的Aβ的水平分別顯示於表11，12，和13。海馬體中的用PBS免疫的對照組的總的Aβ的平均濃度比皮層高3.6倍(海馬體組織平均值63,389ng/g，皮層為17,818ng/g)。對照組小腦的平均水平(30.6ng/g組織)比海馬體降低約2000倍以上。這些水平類似於我們先前報導的該年齡組雜合的PDAPP轉基因小鼠的水平(Johnson-Woods等，1997)。
對於皮層，一個具有平均Aβ水平的處理組，按Aβ1-42測量，它與對照組有很大的差別(p＜0.05)，多克隆的抗Aβ抗體的動物如表13所示。對於這個處理組與對照組相比，Aβ1-42平均水平降低了65％。與附加處理組的對照組相比，Aβ1-42的平均水平同樣顯著地降低了55％，那些動物用mAb10D5給藥(p＝0.0433)。
表13
腳註a.實驗結束時每組動物數；b.ng/g組織；c.Mann Whitney分析；d.NA不適用的；e.標準偏差在海馬體中，與用多克隆的抗Aβ抗體治療有關的總的Aβ降低率的平均值(50％，p＝0.0055)不如在皮層觀察到的(65％)大(表14)。可是，海馬體中減少的絕對量卻幾乎大於皮層3倍，海馬體組織中的淨減少為31683ng/g，皮層組織為11658ng/g。當測量Aβ，Aβ1-42，而不是總的Aβ形式的多種澱粉樣變性的水平時，用多克隆抗體實現的減少是顯著的(p＝0.0025)。用mAbs10D5和266處理的組的平均水平分別降低了33％和21％。
表14
腳註a.實驗結束時每組動物數b.ng/g組織c.Mann Whitney分析d.NA不適用的e.標準偏差同樣測定小腦中總的Aβ(表15)。多克隆的抗Aβ和266抗體給藥組顯示總的Aβ的水平明顯減少(分別為43％和46％，p＝0.0033和p＝0.0184)，10D5處理組具有相近的明顯減少(29％，p＝0.0675)。
表15
腳註a.實驗結束後每組動物數b.ng/g組織c.Mann Whitney分析d.NA不適用e.標準偏差此外通過ELISA測定抗體處理組和對照組，PBS處理組小鼠皮層和小腦中的APP濃度。使用兩種不同的APP測定。第一次，指定APP-α/FL，識別APP-α(α，Aβ序列分解的APP的分泌形式)，和APP的全長形式(FL)，而第二次僅僅識別APP-α。與處理組子集中的治療有關的減少相反，與對照動物相比在所有處理組中APP水平實際上無變化。這些結果顯示用Aβ抗體免疫接種耗盡Aβ沒有耗盡APP。
總之，用針對AN1792產生的多克隆抗體處理的動物的皮層，海馬體和小腦中的Aβ水平顯著地降低。針對Aβ1-42氨基末端區域，特別是胺基酸1-16和13-28的較小區域的單克隆抗體同樣顯示顯著的處理效果。
4.組織化學的分析將PBS，多克隆的Aβ42，21F12，266和10D5處理組小鼠大腦子集中的Aβ免疫活性的斑點的形態定性地和早先的研究對比，該研究中遵循利用Aβ42的標準免疫接種方法。
用多克隆的Aβ42抗體免疫的動物的澱粉樣斑點的區域和外觀都有最大量的改變。澱粉樣的負荷的減少，斑點形態侵蝕和細胞關聯的Aβ免疫活性，與通過標準免疫接種方法產生的效果非常相似。這些觀察支持了總的Aβ和Aβ42明顯減少的ELISA結果是通過多克隆的Aβ42抗體的給藥實現的。
在相似的定性評價中，10D5組澱粉樣的斑點同樣降低了數目和外觀，具有某些細胞關聯的Aβ免疫活性的證明。21F12和266組與PBS對照組比較時，看不到明顯的差異。
5.抗體滴度的測量各腹腔內接種之前，將三隻隨機地從各組選擇的小鼠的子集放血，總共放血30次。如the General Materials and Methods詳細描寫，使用塗有Aβ1-42塑料多孔盤通過用夾心式ELISA測量Aβ1-42結合抗體的抗體滴度。每次放血的平均滴度示於圖16-18，分別對應多克隆抗體和單克隆抗體10D5和21f12。該時間範圍內多克隆抗體製劑的滴度平均約為1∶1000，並且對於10D5和21F12處理的動物來說稍微超過這個水平。
6.淋巴組織增生的反應使用最終的抗體注入後八天收穫的脾細胞測量與Aβ相關的淋巴增生反應。在Aβ1-40存在下，在SμM的濃度刺激下，將每孔105個新得到的細胞培養5天。作為陽性對照，用T細胞促細胞分裂劑，植物血細胞凝集素培養另外的細胞，以及，作為陰性對照，在沒有添加肽的情況下培養細胞。
用AN1792體外刺激來自用各種的抗Aβ抗體被動免疫的年長的PDAPP小鼠的脾細胞，測量增殖和細胞激動素反應。這個測定的目的是測定被動免疫接種是否便於抗原呈遞，因此引發特定於AN1792的T細胞反應。在用抗Aβ抗體被動免疫的小鼠中沒有觀察到AN1792特異性的增殖或細胞激動素反應。
B.研究2在第二研究中，重複用抗體10D5處理，試驗兩種另外的抗Aβ抗體，單克隆抗體3D6(Aβ1-5)和16C11(Aβ33-42)。對照組接受PBS或無關係的同種異型匹配抗體(TM2a)。該小鼠比早先的研究中的年長(11.5-12個月大的雜合子)；換句話說試驗設計是相同的。再一次，六個月的處理後，10D5降低的斑點負荷比PBS或同種異型匹配抗體對照組大80％(p＝0.003)。另一個針對Aβ的抗體，3D6，同樣有效，產生86％的減少(p＝0.003)。相反，針對該肽的第三種抗體，16C11，對斑點負荷沒有任何影響。由Aβ42 ELISA測量得到相似的發現。這個結果證明在沒有T細胞免疫性的情況下，針對Aβ肽的抗體反應足以降低PDAPP小鼠的澱粉樣的沉澱，但不是所有的抗Aβ抗體都是有效的。針對包含胺基酸1-5或3-7的Aβ的表位的抗體是特別有效的。
這個研究證明針對Aβ抗體的被動給藥降低了小鼠阿爾茨海默氏病模型中的斑點沉澱的區域。血清濃度合適時(25-70μg/毫升)，得到的抗體在水平上接近CNS，足夠修飾β澱粉樣的斑點。抗體進入CNS不是由於血腦屏障反常的滲漏，因為通過EvansBlue測量的PDAPP小鼠的血管通透性沒有增加。另外，成年PDAPP小鼠大腦軟組織中的抗體濃度與非轉基因小鼠相同，血清中抗體濃度為0.1％(無論是否同種異型)。C.研究3抗體結合的監控為了測定針對Aβ的抗體是否可以直接地作用於CNS內部，實施例XII結束時從鹽水灌注的小鼠取出大腦，檢查是否存在被動給藥的抗體。使不穩定低溫保存的大腦切片暴露於針對小鼠免疫球蛋白(山羊抗小鼠IgG Cy3)的螢光試劑。10D5和3D6組大腦內部斑點由抗體強烈地修飾，而16C11組沒有著色。為了顯示斑點沉澱的最大程度，首先用抗Aβ抗體，然後用二級的試劑免疫活化各大腦的系列切片。被動給藥後，10D5和3D6獲得接近CNS內的大多數斑點。與16C11組相比，處理組大大地降低斑點負荷。這些數據顯示抗體被動給藥可以進入CNS，在此直接地引發澱粉樣的清除。16C11同樣可以到達斑點但是不能與斑點結合。
XII.人類患者的預防和治療單一劑量試驗階段I測定對人類的安全性。以增加劑量的治療劑對不同的病人給藥，開始約0.01假定效果的水平，通過三次增加直到達到小鼠有效劑量的約10倍的水平。
試驗的階段II測定治療效能。選擇使用阿爾茲海默式病和有關的疾病(ADRDA)標準對於可能的AD的確定早期到中期阿爾茨海默氏病患者。按照Mini-Mental State Exam(MMSE)，合適的患者得分為12-26。其他的選擇標準為病人可能經受得住研究的持續時間，沒有複雜的問題如可幹擾的伴隨的藥物應用。患者機能的基準評價使用傳統的智力測驗，如MMSE，和ADAS，它們是評價阿爾茨海默氏病患者狀態和機能的全面的尺度。這些智力測驗的尺度提供了阿爾茨海默病發展的測量方法。合適的定性壽命尺度還可以用來監控治療。疾病級數也可以通過MRI監控。病人的血液狀況還可以監控免疫原特異性的抗體和T細胞反應的測定。
按照基準方法，病人開始接受治療。將它們隨機化並且以盲試方式用治療劑或者安慰劑治療。患者監控至少六個月。通過治療組相對於安慰劑組的發展明顯降低測定效果。
試驗第二期II評價患者從非阿爾茨海默氏病的早期的記憶損失，有時稱為年齡有關的記憶損傷(AAMI)或溫和的認知損傷(MCI)，到ADRDA標準定義的可能的阿爾茨海默氏病的轉化。從通過參照人群，對於記憶損失或與前阿爾茨海默氏病症狀學有關的其他的困難的早期信號，阿爾茨海默氏病家族史，遺傳危險性因素，年齡，性別，及其他預言高阿爾茨海默氏病危險的特徵的篩選，從非臨床人群選擇具有轉化為阿爾茨海默氏病高風險的患者。合適的測量學基準得分包括MMSE和ADAS和其他的測量學標準，用來評價多個收集的正態群體。這些患者群體被分成合適的組，有的使用安慰劑，有的使用藥劑。這些患者群體遵循約六個月的間隔，患者的端點為，觀察結束時，他或她是否轉變成ADRDA標準所定義的可能的阿爾茨海默氏病。
XIII.一般的材料和方法1.抗體滴度的測量通過在小鼠尾靜脈作一個小放血，並在微型離心管中收集約200μl血液。首先剃掉豚鼠齒爪背面，然後使用18計量針在蹠骨靜脈刻痕，在微型離心管中收集豚鼠血液。血液在室溫下(RT)凝結一小時，渦旋，然後在14000xg離心10分鐘，從血清中分離凝塊。然後將血清轉入乾淨的微型離心管，在4℃存儲，直到滴定。
抗體滴度通過ELISA測定。96孔微量滴定板(Costar EIA plates)用100μl包含10μg/毫升Aβ42或SAPP或者其他的抗原的溶液，每一個體都是孔塗敷緩衝液(0.1M磷酸鈉，pH8.5，0.1％疊氮化鈉)其他的抗原的溶液塗敷，並在RT下保存過夜。對孔吸氣，加入血清，開始為Specimen稀釋劑(0.014M磷酸鈉，pH7.4，0.15M NaCl，0.6％牛血清清蛋白，0.05％乙基汞硫代水楊酸鈉)中的1/100稀釋物。直接在該板上製備樣品的七個系列稀釋液，三倍稀釋，最終的稀釋物為1/218700。將該稀釋物在塗敷板孔中在RT下培養一小時。然後將該板用包含0.05％吐溫20PBS洗滌四次。第二抗體，與辣根過氧化酶共軛的山羊抗小鼠Ig(從Boehringer Mannheim獲得)，作為100μl Specimen稀釋劑中的1/3000稀釋物加入該孔，並在RT下培養一小時。將該板再用PBS，吐溫20洗滌四次。為了生成色原，將100μlTMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺，從PierceChemicals獲得)緩慢加入各孔，在RT下培養15分鐘。添加25μl 2M H2SO4終止反應。然後在分子裝置上在V最大(450nm-650nm)處讀出顏色強度。
滴度被稱為達到最大OD一半的血清稀釋物的倒數。除滴度很高的情況之外，最大OD通常為最初的1/100稀釋物，在這種情況下較高的最初的稀釋物為形成最大OD所必需。如果50％點落在兩稀釋物之間，可線性外推計算最終的滴度。為計算幾何平均數抗體滴度，小於100的滴度被指定為25的滴定度。
2.淋巴細胞增殖測定用異氟烷小鼠麻醉。除去脾，並用5毫升包含10％熱滅活的胎兒牛血清(PBS-FBS)的PBS漂洗兩次，然後在50℃勻化。在1.5毫升PBS-FBS中在Medimachine(Dako)以100rpm離心10秒的Centricon單位(DakoA/S，Denmark)，接著通過100微米孔徑大小尼龍篩過濾。將脾細胞用15毫升PBS-FBS洗滌一次，然後通過200xg5分鐘的離心作用得到小球，通過將該小球在RT下，在5毫升包含0.15M NH4C1，1M KHCO3，0.1MNaEDTA，pH7.4的緩衝液中，再懸浮五分鐘，溶解紅血球。然後如同上述洗滌白血球。將重新分離的脾細胞(每孔105細胞)一式三份在96孔U型底組織培養處理微量滴定板(Coming，Cambridge，MA)中在補充有2.05mML-穀氨酸鹽，1％青黴素/鏈黴素，和10％熱滅活FBS的RPMI1640介質(JRH Biosciences Lenexa，KS)中，在37℃，培養96小時。各種的Aβ肽，Aβ1-16，Aβ1-40，Aβ1-42或Aβ40-1逆層序蛋白質同樣以從5到0.18微摩爾的劑量四步添加。對照孔細胞用沒有添加蛋白質的刀豆素A(ConA)(Sigma，cat.#_C5275，1微克/毫升)培養。細胞用3H胸苷(1μ Ci/孔，從AmershamCorp.，ArlingtonHeights IL獲得)脈衝最終的24小時。然後在UniFilter板上收穫細胞，用Top Count微量滴定板閃爍計數器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)計算。結果用合入不能溶解的高分子的放射性的每分鐘計數(cpm)來表示。
4.腦組織製劑處死後，除去大腦，一個大腦半球免疫組織化學的分析，三個大腦區域(海馬體，皮層和小腦)從另一個大腦半球解剖，用於按特定的ELISAs測量各種Aβ蛋白質和APP形式的濃度(Johnson Wood等，同上)。
ELISAs所用組織在10體積冰冷卻的胍緩衝液(5.0M胍-HCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)中勻化。通過使用Adams Nutator(Fisher)在RT下和緩攪拌三到四小時混合勻漿，然後在-20℃存儲，直到Aβ和APP定量分析。早先的實驗已經顯示分析物在此儲藏條件之下是穩定的，而且合成的Aβ蛋白質(Bachem)可以定量地恢復阻止進入當來自小鼠同窩仔畜(Johnson-Wood等)的對照腦組織勻漿。
5.Aβ水平的測量將大腦勻漿用冰冷的酪蛋白稀釋劑(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％疊氮化鈉，20μg/毫升抑肽酶，5mM EDTA，pH8.0，10μg/ml亮肽素)1∶10稀釋，然後在4℃，在16000xg離心20分鐘。合成的Aβ蛋白質標準樣品(1-42胺基酸)和APP標準樣品製備於包括0.5M胍和0.1％牛血清蛋白(BSA)的最終組合物中。「總的」Aβ夾層ELISA使用單克隆抗體266，特異於Aβ胺基酸13-28(Seubert等)，作為俘獲抗體，和生物素化的單克隆抗體3D6，特異於Aβ的胺基酸1-5(Johnson-Wood，等)，作為指示器抗體。3D6單克隆抗體不辨認分泌的APP或全長的APP，但是只檢測具有氨基末端天冬氨酸的Aβ。這些測定具有～50ng/毫升(11nM)的下限敏感性，顯示在至多1ng/毫升的濃度下對內生的鼠科動物Aβ蛋白質無交叉活性(Johnson-Wood等，同上)。
Aβ1-42特異的夾層ELISA使用mAβ21 F12，特異於Aβ胺基酸33-42(Johnson-Wood，等)，作為俘獲抗體。生物素化的mAβ 3D6同樣是這些測定中的指示器抗體，具有約125μg/毫升(28μM，Johnson-Wood等)的下限敏感性。對於Aβ ELISAs，100μl mAβ 266(10μg/ml或者mAβ 21F12(5μg/ml)被塗敷進入96孔免疫測定板(Costar)的孔中，在RT下培育過夜。通過吸氣除去溶液，通過添加200μl 0.25％PBS緩衝液中的人血清白蛋白在RT下阻塞該孔至少1小時。除去阻塞溶液，將該板在4℃乾燥存儲直到使用。在使用之前用洗滌緩衝液[Tris-緩衝的鹽水(0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl，pH7.5)，加0 05％吐溫20]將該板再水化。每孔添加100μl樣品和標準樣品的一式三份的等分試樣，然後在4℃培養過夜。各測定步驟之間用洗滌緩衝液將該板至少洗滌三次。在酪蛋白測定緩衝液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％吐溫20，pH7.4)中稀釋到0.5μg/毫升的生物素化的mAβ 3D6被添加，並在RT下，在該孔中培養1小時。1小時內，RT下，在酪蛋白測定緩衝液中稀釋的抗生物素蛋白辣根過氧化酶共軛體(Avidin HRP從Vector，Burlingame，CA獲得)被加入該孔。添加比色酶作用物Slow TMB-ELISA(Pierce)，在室溫下反應15分鐘，通過添加25μl 2N H2SO4終止酶促反應。
使用分子裝置在V最大處測量450nm和650nm的吸收率差定量反應產物。
6.APP水平的測量使用兩種不同的APP測定。第一個，指定APP-α/FL，辨認APP-d(α)和全長的(FL)APP形式。第二測定特異於APP-α。APP-α/FL測定辨認隱藏的APP，包括Aβ的第一個12胺基酸。因為指示器抗體(2H3)不特異於α-回形處，發生在APP695的胺基酸612-613之間(Esch等，Science248，1122-1124(1990))；這些測定同樣辨認全長APP(APP-FL)。使用固定的APP抗體到APP-FL胞質尾區消耗大腦勻漿APP-FL的初步試驗表明大約30-40％APP-α/FLAPP是FL(數據未顯示)。APP-α FL和APP-α測定的俘獲抗體是mAb8E5，針對APP695形式的胺基酸444到592產生的(Games等，同上)。APP-α/測定的指示器mAb是mAb中2H3，特異於APP695的胺基酸597-608(Johnson-Wood等，同上)，用於APP-α測定的指示器抗體是mAb16H9的生物素化的衍生物，產生APP的胺基酸605到611。
APP-α FL測定的敏感性的下限為大約11ng/ml(150 ρM)(JohnsonWood等)，APP-α特定的測定的敏感性的下限是22ng/ml(0.3nM)。對於兩種APP測定，mAb8E5塗敷在96孔EIA板的孔上，如上文mAb266所述。純化的隱藏APP-α的重組體用作APP-α測定和APP-α/FL測定的參考標準(Esch等，同上)。將5M胍中的大腦勻漿樣品在ELISA樣品稀釋劑(0.014M磷酸鹽緩衝液，pH7.4，0.6％牛血清清蛋白，0.05％乙基汞硫代水楊酸鈉，0.5M NaCl，0.1％NP40)中稀釋1∶10。然後在包含0.5M胍的樣品稀釋劑中稀釋1∶4。然後在室溫下將稀釋勻漿以16000xg離心15秒。APP標準樣品和樣品一式兩份的等分試樣加入板中，在室溫下培養1.5小時。將生物素醯化的指示器抗體2H3或16H9用樣品在室溫下培養1小時。抗生蛋白鏈菌素鹼性磷酸酶(BoehringerMannheim)在樣品稀釋劑中稀釋1∶1000，在孔中在室溫下培養1小時。加入螢光酶作用物4-甲基-傘花基-磷酸酯，在室溫下培育30分鐘，使用細胞氟tm 2350螢光計(Millipore)at 365nm激發和450nm發射處讀出該板數據。
7.免疫組織化學將大腦在40℃的含4％仲甲醛的PBS中保存三天，然後在4℃的含1％仲甲醛的PBS中存儲一到七天直到切片。在室溫下用振動切片機切出四十微米厚的冠狀面，在免疫組織化學的處理之前，在-20℃的防凍劑(30％甘油，30％乙二醇，磷酸鹽緩衝液中)中存儲。對於各個大腦，六個海馬體背面的水平切片，各間隔240微米，用下列之一的抗體培養過夜(1)在PBS和1％馬血清中稀釋到2μg/毫升的濃度的生物素醯化的抗Aβ(mAb，3D6，特異於人類Aβ)；或(2)在PBS和1.0％馬血清中稀釋到3ug/毫升的濃度的生物素醯化的特異於人類APP，8E5的mAb；或(3)用0.25％TritonX-100和1％馬血清1∶500稀釋的特定於膠質原纖維酸性蛋白(GFAP；Sigma Chemical Co.)的mAb，在Tris-緩衝的鹽水中，pH7.4(TBS)；或(4)用TBS中的0.25％Triton X-100和1％兔血清1∶100稀釋的特異於CD11b，MAC-1抗原的mAb，(Chemicon International)；或(5)用TBS中的0.25％Triton X-100和1％兔血清1∶100稀釋的特定於MHC II抗原(Pharmingen)的mAb；或(6)用PBS中的1％兔血清1∶100稀釋的特定於CD43(Pharmingen)的大鼠mAb；或(7)用PBS中的1％兔血清1∶100稀釋的特定於CD45RA(Pharmingen)的大鼠mAb；或(8)用PBS中的1％兔血清1∶100稀釋的特定於CD45RB的大鼠單克隆抗體Aβ；或(9)用PBS中的1％兔血清1∶100稀釋的特定於CD45(Pharmingen)的大鼠單克隆抗體Aβ；或(10)用PBS中的1％兔血清1∶100稀釋的特定於CDcd3e(Pharmingen)的生物素醯化的多克隆的倉鼠Aβ；或(11)用PBS中的1％兔血清1∶200稀釋的特定於CD3(Serotec)的大鼠mAb；或(12)包含1％正常的馬血清，缺乏初級抗體的PBS溶液。
在室溫下，將與列在上面1，2和6-12上的抗體溶液起反應的切片用PBS中的1.0％Triton X-100，0.4％過氧化氫預先處理20分鐘阻擋內生的過氧化物酶。接下來將它們在4℃用初級抗體培養過夜。然後在室溫下，將與3D6或8E5或CD3e mAbs起反應的切片與PBS中的用試劑盒的組分「A」和″B」1∶75稀釋的辣根過氧化酶抗生物素蛋白生物素複合體反應一小時(Vector Elite Standard Kit，Vector Labs，Burlingame，CA.)。將與特定於CD 45RA，CD 45RB，CD 45，CD3和PBS溶液的抗體起反應的缺少初級抗體的切片，在室溫下，分別用在PBS中1∶75稀釋的生物素醯化的抗鼠IgG(媒介物)或在PBS中1∶75稀釋的生物素醯化的抗小鼠IgG(媒介物)，培養1小時。然後在室溫下，將切片與PBS中的用試劑盒的組分「A」和″B」1∶75稀釋的辣根過氧化酶抗生物素蛋白生物素複合體反應一小時(Vector Elite Standard Kit，Vector Labs，Burlingame，CA.)。
在室溫下，將切片在0.01％過氧化氫，0.05％3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)中顯色。在室溫下，將指定用GFAP-，MAC1-AND MHCII-特定的抗體培育的切片用0.6％過氧化氫預先處理，以阻擋內生的過氧化物酶，然後在4℃用初級抗體培養過夜。在室溫下，將與GFAP抗體起反應的切片用TBS1∶200稀釋的馬的生物素醯化的抗小鼠IgG(VectorLaboratories；Vectastain Elite ABC Kit)培養1小時。接下來將該切片與用TBS 1∶1000稀釋的抗生物素蛋白-生物素-過氧酶複合物(VectorLaboratories；Vectastain Elite ABC Kit)反應一小時。將MAC-1-或MHCII-特定的單克隆抗體培養的切片作為初級抗體，隨後在室溫下與用TBS1∶200稀釋的幹涉兔的生物素醯化的抗鼠IgG反應1小時，隨後用TBS1∶1000稀釋的抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合體培育一小時。將切片用GFAP-，MAC-1-和MHC II特定的抗體培養，然後通過在室溫下用0.05％DAB，0.01％過氧化氫，0.04％氯化鎳，TBS分別處理4和11分鐘檢驗。
將免疫標記切片安裝在載玻片上(VWR，Superfrost載玻片)，空氣乾燥的過夜，浸在Propar(Anatech)中，使用Permount(Fisher)作為封固劑用蓋片覆蓋。
對於復染色Aβ斑點，將GFAP-陽性的切片的子集安裝在Superfrost載玻片上，在含1％硫黃素S(Sigma)的水中培養7分鐘，接著進行免疫組織化學的處理。然後將切片脫水，在Propar中清除，然後用蓋片覆蓋，用Permount安裝。
8.圖像分析通過CCD攝影機連接Nikon Microphot-FX顯微鏡的Videometric150圖像分析系統(Oncor，Inc.，Gaithersburg，MD)和索尼公司Trinitron監視器用於該免疫活性幻燈片的量化。將切片圖像存入視頻緩衝器，測定顏色和飽和度閾，計算通過免疫標記結構佔據的總的象元面積。對於各切片，手工畫出海馬體輪廓，計算海馬體佔據的總的象元面積。澱粉樣負荷的百分比為(包含與mAb 3D6具有免疫活性的Aβ沉澱的海馬體的部分)×100。同樣地，神經炎負荷的百分比為(包含與單克隆抗體8E5反應性的營養不良的軸突的海馬體的部分)×100。將運行Simple 32軟體應用程式的C-圖像系統(Compix，Inc.，CranberryTownship，PA)通過Optronics照相機連接到Nikon Microphot-FX顯微鏡上，並用於測定GFAP陽性的星形細胞和MAC-1和MHC II-陽性的小神經膠質佔據脾後皮層的百分比。將免疫活化切片圖像存入視頻緩衝器，選擇測定單色的-定位閾，計算通過免疫標記細胞佔據的總的象元面積。對於各切片，手工畫出脾後皮層(RSC)輪廓，計算RSC佔據的總的象元面積。星形細胞增生的百分比限定為(GFAP反應性的星形細胞佔據RSC的部分)×100。同樣地，小神經膠質細胞的百分比定義為(MAC1-或MHC II-反應性小膠質細胞佔據RSC的部分)×100。對於所有的圖像分析，六個海馬體背面的水平切片，各間隔240微米，測定各個動物。在所有情況下，觀測者不知道該動物的處理狀態。
XIV針對澱粉樣沉澱的抗體活性的體外篩選測定為了檢驗抗體清除斑點的效果，建立體外測定，其中用PDAPP小鼠或者人類AD大腦不固定低溫箱切片培養初級小神經膠質的細胞。小神經膠質的細胞從嬰兒DBA/2N小鼠(1-3天)的大腦皮質中獲得。在HBSS-(Hanks平衡鹽溶液，Sigma)中用50μg/毫升脫氧核糖核酸酶I(Sigma)機械地分離皮層。用100μm細胞過濾器(Falcon)過濾分離的細胞，在1000rpm離心5分鐘。將該小球再懸浮於菌種生長培養基(高葡萄糖DMEM，10％FBS，25ng/ml rmGM-CSF)，將該細胞以每T-75塑料培養瓶2隻大腦的密度用板固定。7-9天後，在37℃下，使燒瓶以200rpm的速度在定軌振蕩器上旋轉2小時。將細胞懸浮液在1000rpm離心，再懸浮於測定媒介中。
將PDAPP小鼠或人類AD大腦(死後經過時間＜3小時)的10-μm低溫箱切片解凍，安裝在聚賴氨酸塗敷的玻璃酒杯蓋片上，放入24-孔組織培養板的孔中。用由H-SFM(雜種細胞-無血清介質，Gibco BRL)與1％FBS，穀氨醯胺，青黴素/鏈黴素，和5ng/毫升rmGM-CSF(RD)組成的測定媒介將蓋片洗滌兩次。1小時內以2x濃度(5μg/毫升，最終的)添加對照組或抗Aβ抗體。然後以0.8×106細胞/毫升密度的測定媒介接種小神經膠質的細胞。在溼潤的保溫箱(37℃，5％CO2)培養24小時或更多。培育結束時，將培養物用4％仲甲醛固定和用0.1％Triton-X100滲透。將切片用生物素醯化的3D6，接著用抗生蛋白鏈菌素/Cy3共軛體(Jackson ImmunoResearch)染色。外生的小神經膠質的細胞通過核染劑(DAPI)檢驗。用反轉螢光顯微鏡(Nikon，TE300)觀察培養物，用使用SPOT軟體的SPOT數字式攝象機(Diagnostic instruments)顯微照相。對於蛋白質印跡分析，將培養物提取在8M尿素中，在降低麥黃酮(tricine)樣品緩衝劑中1∶1稀釋，負荷在1 6％麥黃酮凝膠(Novex)上。轉移在止動劑上後，汙點暴露於5μg/毫升的pab Aβ42，後面是HRP共軛的抗小鼠抗體，用ECL展開(Amersham)。
當測定用存在抗體16C11(一種針對Aβ的抗體，也就是說在體內無效)的PDAPP大腦切片進行，β澱粉樣斑點完整無損，未觀察到噬菌作用。相反，當鄰近的切片是存在10D5的培養物時，澱粉樣的沉澱大量地產生，小神經膠質的細胞顯示許多包含Aβ的噬菌細胞泡。相同的結果由AD大腦切片得到；10D5誘發AD斑點吞噬作用，而16C11沒有影響。另外，當用小鼠或人類小神經膠質的細胞，和用小鼠，兔，或者靈長類針對Aβ的抗體時，該測定提供類似的結果。
表16顯示若干針對Aβ的抗體得到的結果，比較它們在體外測定中的誘導噬菌作用和在被動轉移研究中的減少體內斑點負荷的能力。雖然16C11和21F12與集合的合成Aβ肽結合，具有高抗體親抗原性，這些抗體不能在未固定的大腦切片中與β澱粉樣斑點反應，不能在體外測定中觸發噬菌作用，並在體內是無效的。10D5，3D6，和針對Aβ的多克隆抗體在全部三項測量中都具有活性。22C8抗體更強烈地結合到天然的Aβ的模擬形式，其中位置1和7的天冬氨酸被替換為異天冬氨酸。這些結果表明體內效果起因於抗體直接介導的CNS內部斑點的清除，而且體外測定可預示體內效果。
相同的測定已經用於試驗清除針對稱為NAC的合成核素片段的抗體。合成核素已經被證明是與澱粉樣斑點有關的蛋白質。對NAC的抗體與包含澱粉樣的斑點的腦組織樣品，如前所述，小神經膠質的細胞接觸。兔血清用作對照。隨後的監視顯示斑點的數目和大小顯著地減少，表現出清除抗體的活性。
表16體外評價作為體內效果的預測
共焦顯微鏡方法來證實體外測定期間Aβ被內在化。存在對照抗體的情況下，外生的小神經膠質的細胞保留在上面組織的共焦平面中，沒有含Aβ的噬菌細胞的泡，且切片內部斑點完整無損。10D5存在下，幾乎所有的斑點材料均列於外生的小神經膠質的細胞內部的泡內。為了測定內在化肽的走向用8M尿素以各種時間點提取10D5處理的培養物，通過蛋白質印跡分析檢查。在一小時時點，仍無噬菌作用發生，用針對Aβ的多克隆抗體反應顯示強烈的4kD帶(相當於Aβ肽)。Aβ免疫活性在第1天降低，在第3天消失。因此，Aβ抗體介異的噬菌作用導致其退化。
為測定體外評價中噬菌作用是否是Fc介異的，製備抗Aβ抗體3D6的F(ab′)2片段。雖然F(ab′)片段保持它們完全的與斑點反應的能力，但是它們不能通過小神經膠質的細胞觸發噬菌作用。另外，整體抗體的噬菌作用可以被針對鼠科動物Fc受體(抗-CD16/32)的試劑阻塞。這些數據顯示通過Fc受體介導的噬菌作用而發生Aβ的體內清除。
XV抗體通過血腦屏障的通道本申請描述的實驗為提供抗體靜脈注射後進入大腦的能力的信息，提供抗體通過靜脈注射進入正常的或者PDAPP小鼠的外周組織後，傳遞到大腦的抗體的濃度的測量方法。而進行這樣的測量用於預報和測定有效劑量。
用0.9％NaCl灌注PDAPP或對照組正常的小鼠。解剖大腦區域(海馬體或皮層)，並迅速冷凍。大腦在0.1％triton+蛋白酶抑制劑中勻化。通過ELISA提取發現免疫球蛋白。Fab′2山羊抗小鼠IgG被塗敷在作為俘獲試劑的RIA板上。將血清或大腦提取物培養1小時。用抗小鼠IgG1-或IgG2a-HRP或IgG2b-HRP(Caltag)檢測同種異型。抗體，無論是否同種異型，在1∶1000的濃度存在於CNS中，可在血液中發現。例如，IgG1的濃度是血液中IgG2a的三倍時，在大腦中也是IgG2a的三倍，它們各自以血液中水平的0.1％存在。這些結果在轉基因的和非轉基因的小鼠中觀察到，所以PDAPP不是唯一血腦屏障有漏洞的。
雖然為了清楚理解的目的上述發明已經詳細描寫，但是顯然，某些修飾也屬於附加權利要求的範圍內。本申請引用的全部出版物和專利文件各自全部引入作為參考。
權利要求
1.一種抗體或抗體片段在製備用於預防或治療以患者澱粉樣沉澱為特徵的疾病的藥物組合物中的應用，該抗體或抗體片段特異地與存在於所述的沉澱上的澱粉樣組分結合，其中所述的澱粉樣組分源於一種前體蛋白，該前體蛋白選自免疫球蛋白重鏈、載脂蛋白A1的N-末端片段(ApoAI和AapoA1)、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、纖維根α鏈、凝溶膠蛋白、β2微球蛋白、心鈉素、角蛋白、胰島澱粉樣多肽、肽類激素、(Pro)降鈣素、前降鈣素和合成核素。
2.權利要求1的應用，其中所述的澱粉樣組分是原纖維組分。
3.權利要求2的應用，其中所述的抗體或抗體片段與所述的原纖維組分的表位結合。
4.權利要求3的應用，其中抗體或抗體片段特異地與所述的原纖維組分結合，而不與所述的原纖維組分的前體結合。
5.權利要求1的應用，其中抗體是人類對所述原纖維產生的抗體，所述的抗體由來自用原纖維組分表位免疫的人類B細胞製備。
6.權利要求1的應用，其中所述的澱粉樣組分選自AH，ATTR，AapoA1，apoA1，Alys，Agel，AB2M，Acal，AIAPP，AANF，SVEP以及合成核素-NAC片段。
7.權利要求1的應用，其中所述的抗體結合至少兩種澱粉樣原纖維組分。
8.權利要求1的應用，其中所述藥物的有效劑量的特徵為在患者體內有效產生針對所述的澱粉樣組分的血清免疫活性量的水平，該血清水平比在預處理的對照血清樣品中測量的針對所述組分的血清免疫活性水平至少高四倍。
9.權利要求1的應用，其中該抗體或抗體片段連接至一種載體。
10.權利要求1的應用，其中所述的藥物為持續釋放組合物。
11.一種預防或治療以患者澱粉樣沉澱為特徵的疾病的藥物組合物，該組合物含有有效劑量的特異地與存在於所述的沉澱上的澱粉樣組分結合的抗體或抗體片段，其中所述的澱粉樣組分源於一種前體蛋白，該前體蛋白選自免疫球蛋白重鏈、載脂蛋白A1的N-末端片段(ApoAI和AapoA1)、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、纖維根α鏈、凝溶膠蛋白、β2微球蛋白、心鈉素、角蛋白、胰島澱粉樣多肽、肽類激素、(Pro)降鈣素、前降鈣素和合成核素。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述的澱粉樣組分是原纖維組分。
13.權利要求12的藥物組合物，其中所述的抗體與所述的原纖維組分的表位結合。
14.權利要求13的藥物組合物，其中抗體特異地與所述的原纖維組分結合，而不與所述的原纖維組分的前體結合。
15.權利要求14的藥物組合物，其中抗體是所述原纖維的人抗體，所述的人抗體由來自用原纖維組分表位免疫的人的B細胞製備而來。
16.權利要求12的藥物組合物，其中所述的澱粉樣原纖維組分選自AH，ATTR，AapoA1，Alys，Agel，AB2M，Acal，AIAPP，AANF，SVEP以及合成核素-NAC片段。
17.權利要求11的藥物組合物，其中所述的組合物包括結合至少兩種澱粉樣原纖維組分的抗體或抗體片段。
18.權利要求11的藥物組合物，其中所述的有效劑量的特徵為在患者體內有效產生針對所述的澱粉樣組分的血清免疫活性的水平的抗體或抗體片段的量，該血清水平比在預處理的對照血清樣品中測量的針對所述組分的血清免疫活性水平至少高四倍。
19.權利要求11的藥物組合物，其中該藥物組合物包括一種載體。
20.權利要求11的藥物組合物，其中藥物組合物配製適於通過腹膜下，口服，皮下，肌內注射，鼻腔內，局部或靜脈內給藥。
21.權利要求11的藥物組合物，其中所述的藥物組合物以持續釋放組合物的形式配製。
22.一種藥物組合物，該組合物包括有效誘導患者體內針對澱粉樣組分的免疫應答的藥劑，以及藥用賦型劑，所述的澱粉樣組分源於一種原纖維前體蛋白，該前體蛋白選自由免疫球蛋白重鏈、載脂蛋白A1的N-末端片段(ApoAI和AapoA1)、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、纖維根α鏈、凝溶膠蛋白、β2微球蛋白、心鈉素、角蛋白、胰島澱粉樣多肽、肽類激素、 (Pro)降鈣素、前降鈣素和合成核素組成的蛋白或者肽。
23.權利要求22的藥物組合物，其中的澱粉樣組分是原纖維肽或者原纖維蛋白。
24.權利要求22的藥物組合物，其中相對於針對原纖維前體蛋白，所述的藥劑誘導針對由所述原纖維蛋白或者肽形成的新表位的免疫應答。
25.權利要求22的藥物組合物，其中所述的澱粉樣組分選自AH，ATTR，AapoA1，Alys，Agel，AB2M，Acal，AIAPP，AANF，SVEP以及合成核素-NAC片段。
26.權利要求25的藥物組合物，其中所述的藥劑選自AH，ATTR，AapoA1，Alys，Agel，AB2M，Acal，AIAPP，AANF，SVEP以及合成核素-NAC片段，包括其片段以及變體。
27.權利要求22的藥物組合物，其中所述的組合物包括有效誘導針對至少兩種不同澱粉樣組分的免疫原性應答的藥劑。
28.權利要求22的藥物組合物，其中所述的藥劑是與載體蛋白連接的肽。
29.權利要求22到28任一項的藥物組合物，其中的組合物包括助劑。
30.權利要求29的藥物組合物，其中所述的助劑選自QS21，單磷醯脂，明礬以及弗氏佐劑。
全文摘要
公開了預防或治療一些澱粉樣疾病，包括阿爾茨海默氏病、蛋白感染素家族性澱粉樣神經病等的藥物組合物和方法。該藥物組合物包含免疫反應有效量的澱粉樣原纖維組分，特別是原纖維形式的肽或蛋白質。此外公開了使用與這樣的原纖維組分反應的免疫試劑的治療組合物和方法。
文檔編號C07K16/18GK101091795SQ200710103280
公開日2007年12月26日 申請日期2000年6月1日 優先權日1999年6月1日
發明者戴爾·B·申克 申請人:神經實驗室有限公司