抗菌素bu-3608的絲氨酸類似物的製作方法

2023-07-25 17:53:01 2

專利名稱：抗菌素bu-3608的絲氨酸類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗真菌的抗菌素、它們的生產方法、它們在藥學上的應用以及含有它們的藥用組合物。更具體地說，本發明的抗菌素是用木槿馬杜拉放線菌(Actinomadurahibisca)生產的，並且本發明的抗菌素具有苯並〔a〕並四苯母核。
由微生物得到苯並〔a〕並四苯醌類的實例僅有少數報導，這些報導包括稱之為G-2N和G-2A，以及KS-619-1的化合物。雖然沒有G-2N和G-2A生物活性的報導，但KS-619-1已公開可作為鈣離子抑制劑和與環核苷酸磷酸二酯酶有關的鈣調素的抑制劑。近來公布的歐洲專利申請277，621公開了抗真菌的抗菌素BU-3608(Ⅰa)、BU-3608B(Ⅰb)和BU-3608C(Ⅰc)。抗菌素貝那諾米辛(benanomicin)A和B發表在J.Antibiotics，1988，41807-811上;並且貝那諾米辛B看來似乎與BU-3608C一樣，而貝那諾米辛A則為用羥基代替糖上的氨基。
R＝CH3R＝HⅠaR′＝CH3;R″-β-D-木糖基 ⅠdR′＝CH3;R″＝β-D-木糖基ⅠbR′＝CH3;R″＝H ⅠeR′＝H;R″＝β-D-木糖基ⅠcR′＝H;R″＝β-D-木糖基我們的共同未決申請U.S.S.N.203，776(申請日期1988年6月7日)公開了BU-3608D(Ⅰd)和BU-3608E(Ⅰe)。
本發明提供了式Ⅱ化合物或其藥學上適用的鹽，
式中絲氨酸為D-絲氨酸;R1和R2獨立地為氫或C1-6烷基;R3為氫或β-D-木糖基。
β-D-木糖基的結構如下
另一方面，本發明提供了製備式Ⅲ化合物或其藥學上適用的鹽的方法，
Ⅲ BU-3608 FA-1R1＝CH3BU-3608 FA-2R1＝H式中R1為氫或甲基，該方法包括在含有能同化的碳源、氮源以及D-或DL-絲氨酸的培養基中，於需氧條件下培養能產生式Ⅲ化合物的木槿馬杜拉放線菌菌株，並且從培養液中回收上述式Ⅲ化合物。
再一方面，本發明提供了含有式Ⅱ化合物及其藥學上適用載體的藥用組合物。
再一方面，本發明提供了治療哺乳動物宿主真菌感染的方法，該方法包括給所述宿主施用抗真菌有效劑量的式Ⅱ化合物。
又一方面，本發明還提供了在含有D-或DL-絲氨酸的培養基中能產生式Ⅲ抗菌素的木槿馬杜拉放線菌菌株。
本發明也提供了具有式Ⅳ的化合物及其鹽。
式Ⅳ化合物表示BU-3608FA-1和FA-2的糖苷配基，它可用於合成抗真菌劑或其衍生物的母核。


圖1表示以DMSO-d6為溶劑，用400MHz核磁共振儀測得的BU-3608 FA-1的質子核磁共振譜。
圖2表示以DMSO-d6為溶劑，用400MHz核磁共振儀測得的BU-3608 FA-2的質子核磁共振譜。
本發明的抗菌素為抗真菌劑。式Ⅲ化合物(即BU-3608FA-1和BU-3608FA-2)可通過在含有D-或DL-絲氨酸的培養基中培養能產生抗菌素的木槿馬杜拉放線菌菌株或其變異體或突變體而得到。作為產生抗菌素的木槿馬杜拉放線菌菌株的實例，可以提到的有P-157-2菌株及由其得到的稱為A2660、A2493和B0012的變異菌株。P-157-2菌株是從南太平洋的裴劑島上收集的土壤標本中分離出來的，在補充有D-絲氨酸源的培養基中P-157-2優先產生BU-3608FA-1。木槿馬杜拉放線菌(Actinomadurahibisca)菌株在生物學上純的菌種P-157-2存放在美國標準菌種保藏所(AmericanTyPeCultureCollection，馬裡蘭州，羅克維爾)，並編為ATCC53557長期貯存。P-157-2菌株的培養和生理學特徵的詳細描述已在我們共同未決申請115，273(申請日期1987年11月2日)中公開，並收編在申請中作為參考。在含有D-絲氨酸源的培養基中能夠產生BU-3608FA-1和FA-2的變異菌株A2660、A2493和B0012，可以從親代株P-157-2中得到，方法是使其與N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(1，000μg/ml)接觸1小時;在未加入D-絲氨酸源的情況下，根據它們產生BU-3608抗菌素複合物(即BU-3608，或B、C、D或E成分)的能力選擇上述菌株。生物學上純的菌種A2660、A2493和B0012存放在美國標準菌種保藏所(ATCC)，登記號為53762(A2660)、53815(A2493)和53816(B0012)。
上述產生抗菌素的木槿馬杜拉放線菌菌株的培養特徵列於表Ⅰ。
(表Ⅰ見下頁)應該理解，要產生BU-3608FA-1和FA-2，本發明不限於上述特定的細菌，而且也包括應用各種方法例如X-射線照射、UV-照射和化學致變物由上述菌株產生的變異體和突變體。還包括能夠結合D-絲氨酸產生抗菌素BU-3608族的其他菌株及其變異體和突變體。
將產生抗菌素的細菌置於營養培養基中生長，該營養培養基中除含有放線菌的已知營養源之外還含有D-絲氨酸源，即使其置於能同化的碳源和氮源、有選擇的無機鹽以及其他已知的生長因子中生長。為了大量生產抗菌素，最好應用深層需氧條件，不過生產有限的數量也可以應用表面培養和瓶培養。用於培養其他放線菌的一般方法也適用於本申請。
營養培養基應含有適當的能同化的碳源，例如核糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素二糖。作為氮源，可以應用氯化銨、硫酸銨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉等，它們可以單獨應用，或者與有機氮源，例如蛋白腖、肉羹、酵母浸膏、玉米漿、黃豆粉、棉子粉等並用。如果需要，還可以加入營養的無機鹽以提供鈉源、鉀源、鈣源、銨源、磷酸鹽源、硫酸鹽源、氯化物源、溴化物源、碳酸鹽源、鋅源、鎂源、錳源、鈷源、鐵源等。作為D-絲氨酸源，可以應用D-絲氨酸，或者應用DL-絲氨酸。
抗菌素BU-3608FA-1和FA-2的生產可以在滿足細菌生長的
任一溫度下進行，例如可在25～40℃下進行，最好是在27～32℃下進行。雖然在某些情況下需要較長時間，但是最佳的抗菌素產品通常是在振搖的燒瓶中保溫培養5～8天之後獲得。通過攪動，例如在旋轉振蕩器上進行振蕩，可以使振蕩燒瓶內進行換氣。如果發酵需在發酵罐內進行，那麼最好是用細菌的斜面培養物或冷凍乾燥培養物接種肉湯培養基，得到營養肉湯的營養接種物。在按該方法得到活性接種物之後，用無菌操作將其轉移到發酵罐的培養基中。在發酵罐中生產抗菌素通常在保溫培養3～6天之後達到最佳的情況。通過攪拌使發酵罐內進行攪動，注入空氣或氧氣到攪動的混合物中達到通氣的作用。應用色譜技術或分光光度技術或一般的生物學試驗方法監測抗菌素的產生。
應用合適的分離方法，可以從培養肉湯中分離得到本發明的抗菌素。從發酵液中分離和純化抗菌素BU-3608FA-1和FA-2的一個方法，其一般的流程如下面流程Ⅰ所示。(見8頁)對流程Ⅰ作詳細的說明全部發酵液用一般的方法(例如離心)分離成菌絲體濾餅和上清液。將上清液酸化，生成的沉澱棄去，將濾液調至pH5，以便使粗的抗菌素沉澱，再使其重新溶於鹼性水溶液中，過濾，以便除去雜質。將濾液酸化至pH2，並在吸收柱(例如DiaionHP-20柱)上進行層析，得到粗的BU-3608HCl複合物。該粗的抗菌素複合物可以進行重結晶，例如用乙酸乙酯重結晶，應用反相矽膠高效液相色譜使產品分成各個抗菌素成分。含有BU-3608FA-1和BU-3608FA-2的部分可以用DiaionHP-20層析進一步地純化。然後將抗菌素的鹽酸鹽水溶液調至pH5.5，使抗菌素的鹽酸鹽轉變成兩性離子化合物。
抗菌素BU-3608FA-1和FA-2具有下述物理-化學性質。
表Ⅱ.BU-3608FA-1和FA-2的物理-化學性質BU-3608FA-1BU-3608FA-2特徵暗紅色無定型粉末暗紅色無定型粉末M.P.(分解)215-220℃186-190℃[α]24D+919°(c 0.1，0.1N HCl) +79°(c 0.1，0.1N HCl)SIMS m/z857(M+H)+843(M+H)+分子式C40H44N2O19C39H42N2O191H NMR詳見圖1 詳見圖213C NMR(100MHz DMSO-d6)16.3(q)，20.3(q)，36.4(q)，16.4(q)，20.4(q)，54.9(d)，56.1(q)，61.6(t)，55.0(d)，56.2(q)，63.1(d)，65.9(q)，67.8(d)，61.7(t)，54.3(d)，69.3(d)，69.9(d)，71.7(d)，65.9(q)，67.3(d)，73.6(d)，75.8(d)，80.5(d)，69.4(d)，69.7(q)，82.1(d)，104.1(d)，71.8(d)，73.5(d)，104.2(d)，105.2(d)，75.9(d)，79.1(d)，106.0(d)，110.3(s)，82.5(d)，104.2(d)，111.4(d)，117.1(d)，104.3(d)，105.1(d)，119.0(s)，119.2(s)，106.1(d)，110.4(s)，126.3(s)，132.1(s)，111.5(d)，117.2(d)，133.0(s)，136.8(s)，119.1(s)，119.3(s)，137.6(s)，137.9(s)，126.3(s)，132.1(s)，143.5(s)，158.0(s)，133.1(s)，136.8(s)，163.6(s)，165.8(s)，137.8(s)，138.0(s)，166.2(s)，168.5(s)，143.5(s)，158.2(s)，172.2(s)，180.2(s)，163.7(s)，165.8(s)，187.3(s)166.2(s)，168.6(s)，172.3(s)，180.1(s)，187.4(s)UVλ最大nm(ε)在50%MeOH中221(32，100)，276(27，400)223(27，700)，277(25，400)499(12，900)499(12，200)在0.01NHCl-234(37，400)，299(31，100)234(34，500)，296(28，900)50%MeOH中460(12，900)460(12，000)在0.01NNaOH-244(34，100)，320(15，700)233(37，200)，319(16，600)50%MeOH中498(14，900)498(15，100)IR(KBr)cm-13400，2920，1605，1385， 3400，2920，1600，1385，1295，1260，1160，10401295，1255，1160，1040TLC SiO2Rf0.26 0.22
(S-114，MeOAc-n-PrOH-28%NH4OH＝45∶105∶60，v/v)HPLCRt(分鐘)8.617.65(ODS，CH3CN-0.15%KH2PO4，pH3.5(25∶75)
可以將抗菌素BU-3608FA-1和FA-2進行進一步的化學修飾。在酸性介質中將BU-3608FA-1、FA-2或它們的混合物加熱足夠的時間以便分解木糖基，得到相應的脫木糖基衍生物和少量的糖苷配基Ⅳ。所應用的溶劑可以是例如二噁烷、四氫呋喃、水、低級鏈烷醇或它們的混合物;酸性催化劑可以是例如鹽酸、硫酸和三氟乙酸。溫度可以從約60～100℃，或者為溶劑的回流溫度。反應時間可以從約0.5小時～10小時，這取決於所應用的反應條件。可以按類似的方法，將通過下面敘述的還原性烷基化方法製得的N，N-二甲基BU-3608FA-2轉變為其相應的脫木糖基化合物。已經發現，酸性水解N，N-二甲基BU-3608FA-2結果得到糖苷配基Ⅳ。
BU-3608FA-1、FA-2或它們相應的脫木糖基衍生物的氨基可以用還原性烷基化反應進行烷基化，它包括首先使起始原料抗菌素與醛或酮反應生成亞胺，然後將生成的亞胺還原。縮合反應與還原反應可以在同一反應容器內一步進行，或者以兩步分開進行。BU-3608FA-2或它的脫木糖基衍生物的伯胺基可以轉變成有兩個相同烷基的叔胺，其方法是使其與相對於抗菌素至少為兩個當量的羰基化合物反應，接著進行還原;或者得到有兩個不同烷基取代基的叔胺，其方法是用控制量的第一個羰基化合物反應，使伯胺轉變成仲胺，再使仲胺與第二個不同的羰基化合物反應，得到產品叔胺。如果不加入第二個羰基化合物，那麼得到的是仲胺。
羰基化合物可以是有1～6個碳原子的醛或酮，例如甲醛、乙醛、丙醛或丙酮。應用還原劑，例如金屬氫化物(如硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、氫化鋁鋰)可以將亞胺基還原。反應可以在極性有機溶劑(如水、乙腈、低級鏈烷醇和二甲基亞碸)或其混合物中進行。反應溫度不是特別受限制的，可以從室溫～約100℃。在我們的試驗中，在室溫下進行的烷基化反應通常在24小時內完成。當然，最佳的反應條件將取決於所應用的具體反應物的性質和反應性能。應該明白，N，N-二甲基BU-3608FA-2可以從BU-3608FA-2、FA-1或它們未經分離的兩個成分的混合物中得到。同樣，N，N-二甲基脫木糖基BU-3608FA-2可以從脫木糖基BU-3608FA-2、FA-1或它們的混合物中得到。
用體外和體內試驗評價本發明具有代表性的化合物的抗真菌活性。應用薩布羅氏葡萄糖瓊脂，通過連續瓊脂稀釋方法測定對不同真菌的最小抑制濃度(MICS)。因此，將含有106菌落/ml的約0.003ml真菌懸浮液加到含有試驗抗菌素的瓊脂平板的表面。將培養基於28℃保溫培養40小時之後得到的MIC值列於下面表Ⅲ中。
(表Ⅲ見13頁)用白色念珠菌A9540、新型隱球菌IAM4514和煙麴黴IAM2034經靜脈感染小白鼠，評價本發明抗菌素在體內的抗真菌活性。在28℃於YGP培養基〔(酵母浸膏(0.2%)、葡萄糖(1.5%)、蛋白腖(0.5%)、K2HPO4(0.05%)和MgSO4(0.05%)〕中將白色念珠菌和新型隱球菌分別培養18和48小時，並懸浮在鹽水中。在28℃於YGP瓊脂斜面上將煙麴黴培養7天，並懸浮在鹽水中。通過紗布過濾真菌懸浮液收集孢子。用約10倍的真菌平均致死劑量由靜脈感染體重為20～24g的雄性ICR小白鼠。
給每組5隻小白鼠服用不同劑量的試驗化合物，或者在真菌感染之後當天(0天)一次靜脈注射給藥;或者從感染當天(0天)到第4天(qd×5)連續給藥5天，每天一次。在真菌感染之後第20天由
存活率計算50%保護劑量(PD50)。對照動物在真菌感染之後第7天～15天內全部死亡。體內試驗的結果列於表Ⅳ。
表Ⅳ.由靜脈感染抗白色念珠菌、新型隱球菌和煙麴黴的體內活性PD50(mg/kg/靜脈注射)白色念珠菌新型隱球菌煙麴黴A9540IAM4514IAM2034一次一次一次給藥qdx5給藥qdx5給藥qdx5BU-3608FA-118-----BU-3608FA-27.4-----N，N-二甲基BU-3608FA-29.07.5112.83615在一次靜脈給藥之後，測定N，N-二甲基BU-3608 FA-2對小白鼠的LD50。在試驗的最大劑量600mg/Kg，既未觀察到致死毒性也未觀察到任何明顯的中毒跡象。
為了治療動物和人的真菌感染，用可以接受的給藥途徑給予抗真菌有效劑量的本發明抗菌素，其給藥途徑可以為靜脈注射、肌內注射、口服、鼻內給藥，對於表面感染可用局部給藥，並且不限於上述途徑。非經胃腸道給藥的製劑包括無菌水溶液或非水溶液劑、懸浮劑或乳劑。還可以製成無菌的固體組合物劑型，在應用之前立即將該固體組合物溶於無菌水、生理鹽水或一些其他可注射的無菌介質中。口服劑型可以是片劑、明膠膠囊劑、粉劑、錠劑、糖漿劑等。對於局部給藥，可以將本發明的化合物加到洗劑、軟膏、凝膠、乳油、油膏、酊劑等中。應用藥物製劑領域中專業人員熟知的一般方法配成單位劑量形式。
可以明白，在對於本發明的抗菌素敏感的真菌所感染的宿主進行治療時，實際最好的給藥途徑和應用的劑量可以由熟悉治療真菌感染的臨床醫生來決定，並且可以根據病原體、病原體對抗菌素的敏感性、感染嚴重的程度和感染的部位以及患者的情況(如年令、體重、排洩的速度、合併治療的情況及一般的身體情況)進行改變。
下面以實例詳細敘述本發明，它們不是對本發明範圍的限制。
實例1發酵生產BU-3608FA-1(a)瓊脂斜面培養使木槿馬杜拉放線菌P-157-2(ATCC53557)在含有以下成分和pH為7.0的瓊脂斜面上生長，0.5%可溶性澱粉0.5%葡萄糖0.1%魚肉膏0.1%酵母浸膏
0.1%CaCO31.6%瓊脂培養物於28℃培養10天。
(b)接種培養將斜面培養基上一部分細菌生長物轉移到500ml錐形瓶中，該錐形瓶內含有100ml由以下成分組成的pH為7.0的營養培養基，3%葡萄糖3%大豆粉0.5%藥用介質0.1%酵母浸膏0.3%CaCO3培養物置於200轉/分的旋轉振蕩器上在32℃培養6天。
(c)生產培養從接種培養物中將5ml細菌生長物轉移到500ml錐形瓶中，該錐形瓶中含有100ml由以下成分組成的無菌生產培養基，3%葡萄糖3%大豆粉0.5%藥用介質0.1%酵母浸膏0.3%CaCO30.25%D-絲氨酸將培養物置於200轉/分的旋轉振蕩器上在28℃培養6天。抗菌素產物達到443μg/ml，其中72.9%是BU-3608FA-1，26.0%是BU-3608，1.1%是BU-3608C。通過測量發酵液在500和600nm處的光密度來測定抗菌素產物。從500nm處的光密度減去600nm處的光密度(OD)值，得到真實的光密度。抗菌素的濃度以BU-3608游離鹼的當量表示。用實例5所述的HPLC方法鑑定抗菌素。
實例2應用A-2493菌株發酵生產BU-3608FA-1和FA-2應用與實例1所述相同成分的培養基，在實例1給出的條件下，瓊脂斜面培養和接種培養稱為A-2493(ATCC53815)的菌株，該菌株為木槿馬杜拉放線菌P-157-2的精氨酸營養缺陷型突變體。
生產A.
從接種培養物中取5ml細菌生長物轉移到各個500ml錐形瓶(共100個錐形瓶)中，各個錐形瓶中含有100ml實例1(c)所述相同的生產培養基。將培養物置於200轉/分的旋轉振蕩器上在28℃培養6天。抗菌素產物達到261μg/ml，它由29.8%BU-3608FA-1、28.9%BU-3608FA-2、19.5%BU-3608c和21.8%BU-3608組成。
生產B也可以用A2493菌株在由以下成分組成的培養基(pH7.0)中生產抗菌素，3%葡萄糖3%蛋白S(大豆粉，Ajinomoto)0.3%CaCO30.5%DL-絲氨酸培養物於28℃保溫培養11天後，抗菌素產物可達到890μg/ml。各成分的比例為BU-3608FA-2，17.7%，BU-3608FA-1，17.0%，BU-3608，33.5%和BU-3608C，31.8%。
實例3應用B-0012菌株發酵生產BU-3608FA-1和FA-2。
生產A採用實例1(a)、(b)和(c)所述的條件和培養基，並用稱為B-0012(ATCC53816)的變異株代替代株P-157-2。培養6天後抗菌素產物達到1，150μg/ml，各成分的比例為BU-3608FA-133.7%，BU-3608FA-221.2%，BU-360824.0%和BU-3608C21.1%。
生產B將B-0012菌株斜面培養物中的部分細菌生長物轉移到500ml錐形瓶中，該錐形瓶內含有100ml由以下成分組成的培養基(pH為7.0)，1%可溶性澱粉1%葡萄糖0.5%醇母浸膏0.5%蛋白腖0.3%NaCl0.2%CaCO3接種培養物於32℃培養6天，將5ml細菌生長物轉移到500ml錐形瓶中，該錐形瓶內含有100ml由以下成分組成的生產培養基(pH為7.0)，3%葡萄糖3%蛋白S(大豆粉，Ajinomoto)0.3%CaCO30.25%D-絲氨酸培養物於28℃培養11天。抗菌素產物達到1，970μg/ml，各成分的比例為BU-3608FA-220.0%，BU-3608FA-110.0%，BU-3608C39.0%和BU-360831.0%。
實例4應用A-2660菌株發酵生產BU-3608FA-1和FA-2應用實例1(a)和(b)給出的同樣條件和培養基製備木槿馬杜拉放線菌突變株A-2660(ATCC53762)的瓊脂斜面培養物和接種培養物。將5ml接種培養物轉移到500ml錐形瓶中，該錐形瓶內含有100ml由以下成分組成的生產培養基，3%葡萄糖3%大豆粉0.5%藥用介質0.1%酵母浸膏0.3%CaCO30.5%DL-絲氨酸培養物於28℃培養7天。抗菌素產物達到620μg/ml，各成分的比例為BU-3608FA-117.0%，BU-3608FA-215.6%，BU-360823.9%，BU-3608C24.7%，D8.3%和E10.5%。
實例5從發酵液中分離和純化BU-3608FA-1與FA-2將按實例2的生產A所述的方法製得的10升發酵液經離心分離成菌絲體濾餅和上清液。該上清液用6NHCl酸化至pH2.0，經過濾除去析出的無定形沉澱。澄清的濾液用6NNaOH調至pH5.0，於5℃放置2小時。過濾收集析出的暗紅色沉澱。將該沉澱溶於4.1l用6NNaOH調至pH9.0的水中，過濾溶液以除去不溶的雜質。濾液調節至pH2.0，並加到DiaionHP-20(2.0L)柱上。柱用水洗滌，並用60%丙酮水溶液(pH3.0)洗脫。濃縮紅色洗脫液，得到BU-3608複合物鹽酸鹽的無定形固體(3.1g)。將該固體複合物(3.0g)溶於甲醇(120ml)中並過濾。向攪拌的濾液中滴加720ml乙酸乙酯，得到的溶液於5℃放置15小時。過濾收集析出的沉澱，並乾燥，得1.28g。
將該固體(1.28g)溶於水(100ml)中，並在用CH3CN-0.15%KH2PO4，pH3.5(21∶79)的混合液平衡過的YMC GEL ODS A60(10L，Yamamura化學實驗研究所)柱上進行反相層析。用相同的溶劑混合液進行洗脫，以每份1L收集洗脫液。收集的洗脫液經HPLC分析(柱YMC A-301-3，4.6mm內徑×100mm，3μm，ODS Yamamura化學實驗研究所)，流動相CH3CN-0.15%KH2PO4，pH3.5(25∶75)，流速0.8ml/分鐘，檢測於254nm處紫外吸收，保留時間BU-3608 FA-2，7.65分鐘;BU-3608 FA-1，8.61分鐘;BU-3608 A，19.11分鐘)。合併含有單一BU-3608 FA-2或BU-3608 FA-1的洗脫溶，並在真空下濃縮以除去CH3CN。各個濃縮物經Diaion HP-20層析使其脫鹽，得到幾乎單一的BU-3608 FA-2鹽酸鹽(75mg)和BU-3608 FA-1鹽酸鹽(50mg)。
為了使鹽酸鹽轉變成其游離的形式並除去無機鹽，將各個鹽的水溶液用0.1NNaOH調節至pH5.5，以便析出兩性離子形式的純的BU-3608FA-2(48mg)和BU-3608FA-1(11mg)。
實例6製備N，N-二甲基BU-3608FA-2
將BU-3608FA-1和BU-3608FA-2(45∶55，510mg)的混合物溶於50ml水中，溶液用1N氫氧化鈉調節至pH7.9，並用50ml乙腈稀釋。於室溫下向該溶液中依次加入甲醛水溶液(＞35%，1.6ml)和氰基硼氫化鈉(240mg)。該溶液於室溫下攪拌1小時，反應進程用HPLC監測。在真空下除去有機溶劑，將殘餘物水溶液調節至pH10.9。在攪拌下將上述溶液(40ml)滴加到240ml丙酮中並於5℃放置2小時。經離心(3000轉/分)收集得到的沉澱，並將其重新溶於40ml水中。在真空下除去微量丙酮後，將溶液調節至pH5.0，並於5℃靜置24小時。經離心收集析出的沉澱，依次用水和丙酮洗滌，於60℃真空乾燥，得80mg兩性離子形式的N，N-二甲基FA-2，M.P.214～218℃(分解);
UV0.01 N NaOH最大nm(ε)232.8(32，900)，320.0(15，500)，498.4(15，200)。
實例7製備脫木糖基BU-3608FA-1在蒸汽浴上將BU-3608FA-1(54mg)在二噁烷(5.4ml)和1NHCl(5.4ml)中的溶液回流8小時。反應混合物用水(30ml)稀釋，並注入裝有DiaionHP-20的短柱(Mitsubishikasei，1.8×25cm)中。該柱用水洗滌，然後用80%丙酮的酸性水溶液(pH3，用1NHCl酸化)洗脫。收集紅橙色的洗滌液並蒸發，得深紅色的粉末。將該粉末溶於35%乙腈/磷酸鹽緩衝液(pH3.5)中，用ODS柱(YMC-ODS，2.1×25cm，用相同的溶劑洗脫)進行層析。將含有所需化合物的洗脫液合併，並通過HP-20柱。用水洗滌該柱，並用80%丙酮(pH3)洗脫。蒸發洗脫液得暗紅色粉末，再將該粉末溶於水(8ml)中，溶液用0.1NNaOH調節至pH5.3。經離心收集生成的沉澱，並用丙酮洗滌，經乾燥得暗紅色粉末(23.3mg，51%)，M.P.＞180℃(分解)。經HPLC測定純度＞95%。
IRν最大(KBr)cm-13400，1605，1290，1255，1060.
UVλ最大(1/100NNaOH)nm(ε)212(35，400)，319(15，300)，498(14，500).
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)1.26(3H，d，J＝6Hz，6′-CH3)，2.32(3H，s，Ph-CH3)，2.65(3H，s，NCH3)，3.75(2H，m，OCH2)，3.91(3H，s，OCH3)，4.68(1H，d，J＝8Hz，1′-H)，6.72(1H，d，J＝2Hz，10-H)，6.87(1H，s，4-H)，7.12(1H，d，J＝2Hz，12-H)，7.71(1H，s，7-H).
實例8製備脫木糖基BU-3608FA-2在蒸汽浴上將BU-3608FA-2(54mg)在二噁烷(5.4ml)和1NHCl(5.4ml)中的溶液回流8小時。反應混合物用水(30ml)稀釋，並注入裝有DiaionHP-20的短柱(Mitsubishikasei，1.8×25cm)中，用水洗滌，並用80%丙酮酸性水溶液(pH3)洗脫。將朱紅色的洗脫液合併，並且濃縮，殘餘物溶於水(8ml)中。溶液用0.1NNaOH調節至pH5.3，經離心收集生成的沉澱，用丙酮洗滌，並在真空下乾燥，得暗紅色粉末(37.7mg，85%)，M.P.＞180℃(分解)，經HPLC測定純度＞95%。
IRν最大(KBr)cm-13400，1605，1290，1265，1035UVλ最大(1/100NNaOH)nm(ε)214(33，000)，234(32，300)，319(14，900)，498(14，100)
1H NMR(DMSO-d6)1.15(3H，d，J＝7Hz，6′-CH3)，2.32(3H，s，PhCH3)，3.75(2H，m，OCH2)，3.91(3H，s，OCH3)，4.67(1H，d，J＝8Hz，，1′-H)，6.72(1H，d，J＝3Hz，10-H)，6.93(1H，s，4-H)，7.12(1H，d，J＝3Hz，12-H)，7.71(1H，s，7-H).
實例9製備脫木糖基N，N-二甲基BU-3608FA-2方法A在蒸汽浴上將N，N-二甲基BU-3608 FA-2(實例6產物，50mg)在二噁烷(5ml)和1N HCl(5ml)中的溶液回流8小時。反應混合物冷卻至室溫並過濾，得7.2mg沉澱。濾液注入乾燥的矽膠柱(Merck Kieselgel 60，4×30cm)中，用正-BUOH-ACOH-H2O(3∶1∶1)洗脫。以10ml為一份收集洗脫液。2-14份洗脫液和較早得到的沉澱按實例10所述方法處理。合併21～32份洗脫液，並注入HP-20柱(1.8×25cm)中。用水洗滌該柱，並用80%丙酮酸性水溶液(pH3)洗脫。濃縮朱紅色的洗脫液得到固體，該固體依次經ODS柱層析(YMC-ODS，2×37cm，用20%CH3CN/pH3.5磷酸鹽緩衝液洗脫)和Diaion HP-20柱層析(1.8×25cm，用pH3的80%丙酮酸性水溶液洗脫)純化，得7.8mg(17%)標題化合物，為暗紅色粉末。M.P.＞180℃(分解)，經HPLC測定純度＞95%。
IRν最大(KBr)cm-13400，1730，1610，1380，1260，1070.
UVλ最大(1/100NNaOH)nm(ε)211(38，100)，318(14，200)，496(12，500).
1H NMR(DMSO-d6)1.23(3H，d，J＝7Hz，6′-CH3)，2.29(3H，s，PhCH3)，2.75(6H，s，NCH3)，3.74(2H，m，OCH2)，3.91(3H，s，OCH3)，4.60(1H，d，J＝8Hz，1′-H)，6.73(1H，d，J＝3Hz，10-H)，6.89(1H，s，4-H)，7.12(1H，d，J＝3Hz，12-H)，7.77(1H，s，7-H).
方法B脫木糖基BU-3608FA-2(實例8產物，71mg)在水(7ml)和乙腈(7ml)中的溶液用0.1NNaOH調節至pH7。在室溫下向該浴液中加入甲醛水溶液(35%，0.3ml)和氰基硼氫化鈉(45mg)。將反應混合物攪拌過夜，在真空下除去有機溶劑。殘餘物的水溶液用NaOH調至pH10，然後將其滴加到丙酮(70ml)中。濾出沉澱，並溶於pH2.5的水中。將該溶液注入裝有DiaionHP-20的柱(1.8×25cm)中，用水洗滌，用酸性丙酮水溶液(pH3，用1NHCl酸化)洗脫。將深紅色的洗脫液合併，並且濃縮至約5ml，用稀NaOH調至pH5.3，然後將其滴加到丙酮(70ml)中。過濾收集生成的沉澱，從丙酮水溶液中再次沉澱，得66mg(90%)標題化合物，為暗紅色粉末，該粉末與由方法A得到的產物完全相用，經HPLC測定純度＞95%。
實例10BU-3608FA糖苷配基將實例9(方法A)中從矽膠柱上洗脫下來的第2～14份洗脫液合併，並且濃縮至幹，得到粉末。將該粉末和實例9(方法A)得到的沉澱溶於0.01NNaOH中，注入裝有DiaionHP-20的柱(1.8×25cm)中。用水洗滌，用80%丙酮酸性水溶液(pH3)洗脫。合併朱紅色的洗脫液，在真空下蒸除丙酮，得到懸浮液。將該懸浮液用1NHCl酸化(pH3)，並用丁醇萃取。濃縮丁醇萃取液，得11.5mg糖苷配基(33%)，為暗紅色無定形粉末。
M.P.＞200℃(分解)，經HPLC測定純度＞95%IRν最大(KBr)cm-13240，1720，1605，1340，1305，1165.
UVλ最大(1/100NNaOH)nm(ε)212(34，500)，319(15，200)，498(14，000).
1H NMR(DMSO-d6)2.34(3H，s，PhCH3)，3.73(2H，m，OCH2)，3.91(3H，s，OCH3)，4.24(2H，AB-q，J＝11Hz，5-H 6-H)，4.46(1H，m，N-CH-COOH)，6.92(1H，d，J＝2Hz，10-H)，7.06(1H，s，4-H)，7.28(1H，d，J＝2Hz，12-H)，8.08(1H，s，7-H).
實例11按實例6所述的通法，應用下列反應物製得相應的BU-3608FA-1和FA-2的烷基化類似物。
A+B→ⅡABⅡBU-3608 FA-1 乙醛(1當量)＊R3-β-D-木糖基;R1＝CH3;
R2＝CH3CH2-″ 丙醛(1當量) R3＝β-D-木糖基;R1＝CH3;
R2＝CH3CH2CH2-″ 丙酮(1當量) R3＝β-D-木糖基;R1＝CH3;
R2＝CH(CH3)2
ABⅡBU-3608 FA-2 乙醛(2當量) R3＝β-D-木糖基;R1＝R2＝CH3CH2-″ 丙酮(1當量) R3＝β-D-木糖基;R1＝H，R2＝CH((CH3)2″ 丙醛(2當量) R3＝β-D-木糖基;R1＝R2＝CH3CH2CH2-″ 丁醛(1當量) R3＝β-D-木糖基;R1＝H;
R2＝CH3(CH2)3-脫木糖基BU-3608 乙醛(1當量) R3＝H;R1＝CH3;R2＝CH3CH2-FA-1″ 丙醛(1當量) R3＝H;R1＝CH3;R2＝CH3CH2CH2-″ 丙酮(1當量) R3＝H;R1＝CH3;R2＝-CH(CH3)2脫木糖基BU-3608 乙醛(2當量) R3＝H;R1＝R2＝CH3CH2-FA-2″ 丙酮(1當量) R3＝H;R1＝H，R2＝-CH(CH3)2″ 丙醛(2當量) R3＝H;R1＝R2＝CH3CH2CH2-″ 丁醛(1當量) R3＝H;R1＝H;R2＝CH3(CH2)3-＊相對於BU-3608反應物的最小量。
權利要求
1.一種製備具有下式的化合物或其藥學上適用鹽的方法，
式中R1和R2獨立選自H或C1～C6烷基；R3為氫或β-D-木糖基；該方法包括以下步驟(a)使下式化合物或其藥學上適用的鹽與有1～6個碳原子的醛或酮進行反應生成亞胺，
式中R3為氫或β-D-木糖基，R4為氫或甲基，(b)用還原劑處理由(a)得到的亞胺。
2.權利要求1所述的方法，其中R3為β-D-木糖基。
3.權利要求1所述的方法，其中R3為氫。
4.權利要求1所述的方法，其中R1為氫或甲基，R2為氫或甲基。
5.權利要求1所述的方法，其中R1和R2獨立地選自C2-6烷基;或者R1為氫或甲基，R2為C2-6烷基。
6.權利要求1所述具有下式的化合物或其藥學上適用的鹽，
7.權利要求1所述具有下式的化合物或其藥學上適用的鹽，
8.權利要求1所述具有下式的化合物或其藥學上適用的鹽，
9.權利要求1所述具有下式的化合物或其藥學上適用的鹽，
10.權利要求1所述具有下式的化合物或其藥學上適用的鹽，
11.權利要求1所述具有下式的化合物或其藥學上適用的鹽，
12.具有下式的化合物或其鹽，
式中絲氨酸為D-絲氨酸。
13.製備式Ⅲ抗菌素的方法，
式中R1為氫或甲基，該方法包括在含有可同化的碳源和氮源以及D-或DL-絲氨酸的培養基中，於需氧條件下培養能產生上述抗菌素的木槿馬杜拉放線菌(Actinomadura hibisca)菌株，並且從培養液中分離得到上述抗菌素。
14.含有由權利要求1所述方法製備的化合物及其藥學上適用載體的藥用組合物。
15.治療哺乳動物宿求真菌感染的方法，該方法包括給所述哺乳動物宿主服用由權利要求1所述方法製備的抗真菌有效劑量的化合物。
16.生物學上純的菌種木槿馬杜拉放線菌，它與ATCC53815具有相同的特徵，並且在含有可同化的碳源、氮源和D-絲氨酸的含水培養基中進行培養時，能夠產生式Ⅲ抗菌素。
17.生物學上純的菌種木槿馬杜拉放線菌，它與ATCC53816具有相同的特徵，並且在含有可同化的碳源、氮源和D-絲氨酸的含水培養基中進行培養時，能夠產生式Ⅲ抗菌素。
全文摘要
本申請公開了抗菌素BU-3608FA-1和FA-2及其烷基衍生物。上述化合物可用作為抗真菌劑。BU-3608FA-1和FA-2可以在含有D-絲氨酸源的培養基中用木槿馬杜拉放線菌(Antinomadurahibisca)生產。
文檔編號A61P31/04GK1044299SQ8910845
公開日1990年8月1日 申請日期1989年11月9日 優先權日1988年11月10日
發明者澤田洋介, 角正甫, 西尾真樹, 宮威夫, 沖俊一 申請人:布里斯托-邁爾斯·斯奎布公司