視網膜神經細胞層體外分離製備的方法
2023-07-18 17:44:41 1
專利名稱：視網膜神經細胞層體外分離製備的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法。
技術背景:
世界衛生組織(WHO)統計資料顯示，全球約有1.6億視力障礙者，4000萬法定盲人，中國是全世界盲人最多的國家，約有700萬盲人，而中國每年約有45萬人失明，每分鐘新增一例盲人。如果我國盲人快速增加的趨勢無法有效地控制，到2020年預期中國的盲人將增加到2000萬，因致盲性眼病造成的傷害以及給社會造成的沉重負擔將無法估量。視網膜疾病是發達國家致盲的最常見原因(超過50%)，我國每年因此類疾病失明的患者近20萬(佔45%)，是目前國際上尚無有效治療手段的嚴重致盲性眼病。因此，為發病率高、危害重的致盲性視網膜疾病尋找治療手段，是我國經濟、社會和人民健康的重大需求。因此，大力開展視網I吳的基礎與臨床研究，尋找有效的治療措施的研究迫在眉睦。實驗眼科學領域，關於視網膜基礎與臨床研究中，對於視網膜發育及其功能、各種視網膜疾病的發病機制的研究，均需要把不同種屬動物來源的眼球或人體捐獻來源的眼球內的視網膜分離取出後，再進行各類相關性的細胞、分子、基因、核酸或蛋白質等水平的檢測。視網膜是眼部結構的重要組成部分，是位於眼球壁內層的一層透明薄膜，由視網膜神經層和視網膜色素上皮層組成，視網膜神經層與色素上皮層之間有一腔隙，為視網膜下腔，視網膜色素上皮層與脈絡膜緊密相連。目前，國內外常用的取出視網膜神經細胞層的方法是用酶消化和顯微解剖分離來獲得，一般需要時間為15-25分鐘。酶消化的最大缺點是把視網膜神經細胞層相鄰部位的視網膜色素上皮細胞或脈絡膜色素細胞消化下來，造成細胞之間的汙染，使視網膜神經細胞純度下降；顯微解剖分離的方法耗時較長，視網膜暴露在空氣中時間越長，神經細胞的死亡數目越多，而且嫻熟的顯微操作技巧需要長時間的訓練。由於視網膜神經細胞隨著離體時間的延長死亡數量增加，一般視網膜神經細胞離體15-25分鐘後，視網膜神經細胞死亡率佔40-60%，可造成實驗結果的嚴重錯誤。如何解決視網膜神經細胞層的快速分離，得到具有活性的視網膜神經細胞層，多年來是眼科領域科學家面對的困擾，也是我們急需解決的重點難題。發明內容:
本發明目的是提供一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，能夠克服常用的視網膜神經細胞層的分離所用時間長的缺點，實現視網膜神經細胞層的快速分離。本發明提供一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，包括如下步驟:
A.提供實驗動物眼球或遺體捐獻眼球；
B.清潔步驟A中所述眼球；
C.將步驟B中所述眼球固定在眼球固定器上；
D.提供視網膜取出器，所提供的視網膜取出器，包括手柄，所述手柄一端設有視網膜取出勺，另一端設有刀片，所述視網膜取出勺所在平面與手柄水平軸線呈傾斜夾角，所述刀片的前端設有刀尖；E.在解剖顯微鏡下，用步驟D中所述視網膜取出器的刀片沿角鞏膜緣或平坦部切開眼球全周的眼球壁全層，形成一個眼杯；
F.用步驟D中所述視網膜取出勺進入眼杯，把晶狀體和玻璃體取出；
G.沿眼球壁的切口全周分離眼球壁的內層，再用步驟D中所述視網膜取出勺沿眼球壁的弧度進入視網膜下腔，取出完整的視網膜神經細胞層。優選方案:還包括將步驟G取出的視網膜神經細胞層放在預冷的離心管中，用於下一步的實驗。優選方案:所述步驟B中清潔的方法包括下列步驟，先用預冷的PH7.4的磷酸鹽緩衝液充分衝洗眼球，根據眼球來源，評估是否有細菌汙染或感染，選擇相應濃度的抗生素加入預冷的生理鹽水內充分衝洗眼球，一般預防感染，使用慶大黴素則每毫升生理鹽水內含有20IU，將衝洗過的眼球放在裝有冰塊的眼球固定器上，最後去除眼球壁表面的所有血樣附屬物和其他附屬的組織，保留四條直肌。優選方案:所述預冷，是把裝有PH7.4的磷酸鹽緩衝液和生理鹽水的瓶子事先埋在冰裡，使PH7.4的磷酸鹽緩衝液和生理鹽水的溫度保持在O度左右，清潔的步驟在溫度處於0-4度的環境下進行。優選方案:將所述的四條直肌固定在與眼球大小相應的裝有冰塊的眼球固定器上。優選方案:所述步驟E中，沿眼角鞏膜緣後1-4_切開眼球壁的全層，切開眼球壁的深度為0.6-1.5mm,眼球壁全層切口圓周度數為360度，去除眼前段組織，保留眼杯內的組織結構；
優選方案:切開眼球壁全層之前，預先用標記筆畫出所要切開的部位，以免錯位。
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優選方案:所述步驟G中的分離，用一把無齒鑷輕輕夾住眼球壁呈灰白色的內層邊緣，用虹膜分離器的前端沿眼球壁切口的全周給予充分的分離，分離深度在2-5_左右，一般小鼠2-2.5mm,大動物3_4mm,人眼多為5mm左右。有益效果:快速取出視網膜神經細胞層，使實驗結果反應出真實性，解決了多年來困擾眼科領域科學家的問題；快速取出視網膜神經細胞層，簡便了取出方法，保存了視網膜神經細胞的活性，提高了效率，關鍵是能正確反應實驗結果，為視網膜發病機制、視網膜發育和基因調控機制的研究，創造了堅實有利的基礎條件。採用本專利中研製的視網膜取出器，5秒內快速完整的從動物來源的眼球或遺體捐獻的眼球中取出視網膜神經細胞層，確保視網膜神經細胞的活性，能準確的檢測來源於不同種屬的脊椎動物、不同發育階段動物眼球或遺體捐獻眼球的視網膜神經細胞的RNA水平、蛋白表達水平、基因表達水平等，使各種實驗結果具備最真實性，為視網膜發育的研究和視網膜早期病變的研究提供了技術支撐。本專利方法與常規的酶消化和解剖分離視網膜的三種方法比較研究:定量分析出生後14天的小鼠，每一對視網膜神經細胞中光感受器細胞內Rho和Mop兩種視蛋白，節細胞內Thyl蛋白含量的檢測，結果顯示:本專利方法獲得的視網膜神經細胞中，三種蛋白的表達水平分別為90%、80%、75% ;酶消化法分別為35%、31%、26% ;解剖分離法為36%、30%、25% ；三種蛋白的總體水平比現有的方法提高2倍以上；每一對視網膜神經細胞中Rho、Mop和Thyl三種蛋白水平定性分析，結果顯示，本專利方法獲得的視網膜神經細胞內三種蛋白的水平明顯高於另外兩種方法；對每隻小鼠一對視網膜的總RNA水平定量顯示，本專利方法為98%，酶消化法為40%，顯微解剖法為35%。附圖及
圖1.本專利與常規的酶消化、解剖分離三種方法獲得視網膜神經層，三種視網膜神經細胞內蛋白水平定量分析比較 圖2.本專利與常規的酶消化、解剖分離三種方法中Rho、Mop和Thyl三種蛋白水平定性分析比較 圖3.本專利與常規的酶消化、解剖分離三種方法中視網膜神經細胞總RNA水平定量分析比較圖。
具體實施方式
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實施例1:對實驗動物小鼠眼球進行的一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，採取的步驟如下:
(I)清潔眼球:首 先用預冷的磷酸鹽緩衝液(PH7.4)充分衝洗小鼠來源的眼球，再用每毫升含有20IU的慶大黴素液的預冷生理鹽水充分衝洗眼球；眼球放在裝有冰塊的眼球固定器上，去除眼球表面的所有血樣附著物和其他附屬組織，保留四條直肌。在該步驟中注意事項如下:因為來自動物(或遺體捐獻的眼球)眼球表面有許多血樣附著物和其他附屬的組織，為了防止組織細胞之間的汙染，小心用彎剪刀仔細剪除眼球表面的組織和血樣附著物，保留四條直肌。因為眼球壁較薄，小動物眼球壁大約厚度0.6-0.8_，大動物眼球壁厚度大約0.8-1.2mm,人的眼球壁厚度大約1.0-1.5mm,切記不要把眼球壁剪破。該步驟要求動作準確迅速，確保在0°-4°低溫條件下操作，以保證視網膜神經層各種細胞的活性。每一個眼球，需要更換一次眼球固定器的一次性保潔膜，以防汙染。(2)固定眼球:將清潔處理過的小鼠眼球的四條直肌固定在與眼球大小相應的裝有冰塊的眼球固定器上。注意事項:為了防止汙染，每一隻眼球在衝洗後，更換一張眼球固定器的一次性保潔膜。在固定眼球時，千萬注意不要強行牽拉四條直肌，因為直肌鞏膜附著點的鞏膜厚度大約為0.2-0.3mm,以免造成眼球破裂。選擇大小合適的眼球固定器，以眼球的直徑大小為依據來選擇。如果眼球固定器大小不適宜，切開眼球壁的時候，嚴重者可造成眼內容物的脫出，也可帶來操作的不便。(3)切開眼球壁:在解剖顯微鏡下，用視網膜取出器一端的刀片在小鼠眼球上，沿角鞏膜緣後Imm切開全層的眼球壁360度。注意事項:刀片必須確保其刀刃的鋒利，以確保手術時避免對眼球施加不必要的壓力，避免重複使用，以防止汙染；根據不同眼球壁的厚度，掌握好切開球壁的深度，一般成年小動物眼球壁厚度大約為0.6-0.8_。該步驟必須在顯微鏡下仔細操作，不要切開的過淺或過深，二者均可造成眼球組織細胞的損傷。小動物眼球壁切開是沿著角膜緣外Imm切開，預先用標記筆畫出所要切開的部位，以免錯位。(4)清除眼內容物:去除眼前段，用視網膜取出器一端的視網膜取出勺，沿著眼球壁的切口進入眼內，把晶狀體和玻璃體輕輕託出。注意事項:操作時不要對眼杯施加任何壓力，小動物用視網膜取出勺從眼球壁的切口沿球壁的弧形進入，輕輕將晶狀體和玻璃體一起託出；視網膜取出勺進入眼內操作時，動作一定要輕柔，切記不可使用其攪動眼內物，以免牽拉視網膜，造成人為的視網膜脫離。(5)取出視網膜神經層:用一把無齒鑷輕輕夾住眼球壁呈灰白色的內層邊緣，用虹膜分離器的前端沿眼球壁切口的全周給予充分的分離，分離深度在2-2.5mm左右，更換取出勺沿著球壁已分離的內層組織下進入視網膜下腔，取出完整的視網膜神經細胞層。注意事項:由於眼球離體後，離體時間越長，視網膜神經層越容易與視網膜色素上皮層脫離，該步驟操作時動作一定要輕柔，沿著視網膜下腔的自然弧度進入，將全層視網膜神經層取出。根據眼球的大小，選擇相適應直徑的視網膜取出勺。調整視網膜取出勺一定恰當的角度後進入視網膜下腔，切記操作動作不要粗暴，這一步最容易造成視網膜取出不完全，或視網膜呈碎片狀。(6)取出視網膜神經層後的處理:取出視網膜神經層後，立即放在預冷的離心管中，進行下一步的實驗。為了證實本專利方法的優越性和可靠性，利用本專利方法視網膜神經細胞層分離製備與常規的酶消化和解剖分離方法，獲取出生後14天小鼠的視網膜神經細胞層，對其中視網膜神經細胞所含的Rho、Mop和Thyl三種蛋白水平進行定量和定性分析；並對三種方法獲得的視網膜進行RNA提取後，進行視網膜神經細胞總RNA水平定量檢測。圖1.採用本專利方法提取視網膜神經細胞層與常規的酶消化和解剖分離的方法進行比較研究:取出生後14天同窩小鼠的視網膜神經細胞,進行Rho、Mop和Thyl三種蛋白水平定量分析，該方法獲取的視網膜神經細胞中三種蛋白的含量明顯高於其它兩種方法的2倍。圖2.採用本方法提取視網膜神經細胞層與常規的酶消化和解剖分離的方法進行比較研究:取出生後14天同窩小鼠的視網膜神經細胞，進行Rho、Mop和Thyl三種視網膜神經層光感受器細胞和節細胞內主要蛋白水平定性分析，該方法獲取的視網膜神經細胞中三種蛋白的含量明顯高於其它兩種方法；β-Actin在視網膜內普遍存在的蛋白作為陽性對照組，三種視網膜神經層取出方法對比該蛋白無明顯差異。該實驗直觀的顯示，快速取出視網膜神經層細胞，可正確的反應視網膜神經層內各種相關蛋白的含量。圖3.視網膜神經細胞總RNA水平定量檢測:每隻小鼠一對視網膜的總RNA水平定量顯示，本專利方法為98% ，酶消化法為40%，顯微解剖法為35%。實施例2:是對人遺體捐獻眼球進行的一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，與實施例1相同的步驟不再重述，不同之處在於:切開眼球壁步驟中，在解剖顯微鏡下，用視網膜取出器一端的刀片在人體捐獻眼球上沿角鞏膜緣後4mm切開全層的眼球壁360度。清除眼內容物步驟中，先用視網膜取出勺沿眼球壁切口水平進入將晶狀體託出，然後沿球壁的弧形進入將玻璃體輕輕託出。用虹膜恢復器分離眼球切口全周的內層時，一般分離深度為5mm左右。
權利要求
1.一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，包括如下步驟: A.提供實驗動物眼球或遺體捐獻眼球； B.清潔步驟A中所述眼球； C.將步驟B中所述眼球固定在眼球固定器上； D.提供視網膜取出器，所提供的視網膜取出器，包括手柄，所述手柄一端設有視網膜取出勺，另一端設有刀片，所述視網膜取出勺所在平面與手柄水平軸線呈傾斜夾角，所述刀片的前端設有刀尖； E.在解剖顯微鏡下，用步驟D中所述視網膜取出器的刀片沿角鞏膜緣或平坦部切開眼球全周的眼球壁全層，形成一個眼杯； F.用步驟D中所述視網膜取出勺進入眼杯，把晶狀體和玻璃體取出； G.沿眼球壁的切口全周分離眼球壁的內層，再用步驟D中所述視網膜取出勺沿眼球壁的弧度進入視網膜下腔，取出完整的視網膜神經細胞層。
2.根據權利要求1所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:還包括將步驟G取出的視網膜神經細胞層放在預冷的離心管中。
3.根據權利要求1所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:所述步驟B中離體眼球清潔包括下列步驟，先用預冷的PH7.4的磷酸鹽緩衝液充分衝洗眼球，再根據眼球來源，評估是否有細菌汙染或感染，選擇相應濃度的抗生素加入預冷的生理鹽水內衝洗眼球，將衝洗過的眼球放在裝有冰塊的眼球固定器上，最後去除眼球表面的所有血樣附著物和其他附屬的組織，保留四條直肌。
4.根據權利要求3所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:所述預冷，是把裝有PH7.4的磷酸鹽緩衝液和生理鹽水的瓶子事先埋在冰裡，使PH7.4的磷酸鹽緩衝液和生理鹽水的溫度保持在O度左右，清潔的步驟在溫度處於0-4度的環境下進行。
5.根據權利要求3所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:將所述的四條直肌固定在與眼球大小相應的裝有冰塊的眼球固定器上。
6.根據權利要求1所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:所述步驟E中，沿眼角鞏膜緣後1-4_切開眼球壁全層，切開眼球壁的深度為0.6-1.5mm,眼球壁全層切口圓周度數為360度。
7.根據權利要求6所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:切開眼球壁全層之前，預先用標記筆畫出所要切開的部位，以免錯位。
8.根據權利要求1所述的視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，其特徵在於:所述步驟G中的分離，用一把無齒鑷夾住眼球壁呈灰白色的內層邊緣，用虹膜恢復器的前端沿眼球壁切口的全周給予分離，分離深度為2-5mm。
全文摘要
本發明提供一種視網膜神經細胞層體外分離製備的方法，包括如下步驟提供實驗動物眼球或遺體捐獻眼球；清潔眼球；固定眼球；提供視網膜取出器；用視網膜取出器的刀片沿角鞏膜緣或平坦部切開眼球全周的眼球壁全層，形成一個眼杯；視網膜取出勺進入眼杯，把晶狀體和玻璃體取出；沿眼球壁的切口全周分離眼球壁的內層邊緣，再用視網膜取出勺沿眼球壁的弧度進入視網膜下腔，取出完整的視網膜神經細胞層。本發明能夠實現快速取出視網膜神經細胞層，保存了視網膜神經細胞的活性，提高了效率，能正確反應實驗結果。
文檔編號G01N1/04GK103234774SQ201310162180
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月6日 優先權日2013年5月6日
發明者彭廣華 申請人:鄭州大學第一附屬醫院