細粒棘球蚴基因工程疫苗候選分子p-29的製作方法

2023-07-18 20:42:26 3

專利名稱：細粒棘球蚴基因工程疫苗候選分子p-29的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及人畜共患寄生蟲病基因工程疫苗，特別針對肝包 蟲病的基因工程疫苗
背景技術：
細粒棘球蚴蟲病，俗稱包蟲病，是由細粒棘球蚴感染人和食草類家畜所引起的寄 生蟲疾病。由於細粒棘球蚴主要寄生於人的肝臟，故該病又稱為肝包蟲病。它呈世界性分 布，嚴重危害人類的健康和農牧業經濟的發展，是全球性的公共衛生問題。據近年普查，我 國有25個省、市和自治區有該病的病例報導，其中以新疆、寧夏、甘肅、青海、西藏、四川、內 蒙古7個省(區)流行最為嚴重，高發區約佔全國面積的44%，受威脅人口約5千萬。該病 已被列為我國重點防治的寄生蟲病之一。目前，對人包蟲病的首選治療方法是外科手術，但由於該病發病早期可無自覺症 狀，等到入院就診時，相應的臟器已經受到嚴重的損傷並且手術本身對機體也有損傷，從而 使患者在健康和經濟上都蒙受了極大的損害。對於較早期小棘球蚴或有手術禁忌的病例可 採用阿苯噠唑或甲苯咪唑等藥物進行化療，臨床發現這些藥物存在嚴重的毒副作用，部分 患者不能耐受，同時某些化療患者可產生耐藥性。近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展及在醫學科學中的廣泛應用，利用基因 工程技術對病原體進行分子疫苗的預防研究引起了人們的廣泛觀注。從目前的研究情況來 看，國內外對細胞粒棘球蚴蟲研究較為成功的重組疫苗有Eg95，它已在人工感染的牛和羊 群獲得了較好的免疫保護水平，免疫保護力達到96-98%。我們研究的細粒棘球蚴重組疫苗 EgP-29的免疫保護力也達到了 96. 6%。因此，該疫苗候選分子將有望在肝包蟲預防中發揮 著巨大的作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種細粒棘球蚴重組疫苗候選分子，其具備安全、經濟、有 效、製備簡單、性能穩定、使用方便、可產生較持久免疫保護效果等優點。從而有效控制人畜 感染，減少人畜患病人數，使國家、人民減少財產損失，並帶來巨大的經濟效益。本發明通過利用生物信息學技術登陸NCBI/GenBank公共資料庫，檢索出已發表 細粒棘球蚴(烏拉圭株)診斷抗原P-29基因序列(GenBank序列號AF07893)，參照檢索 的基因序列設計併合成引物，以中國寧夏地區病人手術後獲得的細粒棘球蚴原頭蚴中提取 的總RNA為模板，通過RT-PCR技術擴增出細粒棘球蚴的P-29基因；通過對擴增出的P-29 基因DNA序列分析，證實該擴增基因與烏拉圭株P-29基因序列完全一致，表明我們成功克 隆出的細粒棘球蚴(中國大陸株)P-29基因；通過DNA重組技術，將克隆出的P-29基因與 表達載體pET-28a構建成重組質粒，並將其轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)plysS中，成功的構 建出含細粒棘球蚴(中國大陸株)P-29基因的基因工程菌株；通過對工程菌株的誘導表達 及通過含Ni2的His-bind樹脂親合柱純化出重組蛋白rEgP-29。經免疫學鑑定初步說明rEgP-29有較好的抗原性及免疫原性，具有抗包蟲病疫苗候選分子的潛能。通過上述步驟 獲得的重組蛋白EgP-29背部多點注射免疫小鼠，每兩周免疫1次，共3次。從寧夏醫科大 學附屬醫院肝膽外科住院包蟲病患者手術摘除的完整包囊中，無菌條件分離原頭蚴，用原 頭蚴攻擊免疫小鼠(1. 5 X IO4個原頭蚴/ml懸液)，攻擊感染20周後剖殺小鼠，切開小鼠腹 部，計數肝臟及腸繫膜處的棘球蚴包囊，根據Dempster計算免疫保護力，公式免疫保護力 (% ) = (1-免疫組平均包囊數/對照組平均包囊數)X 100%。經計算用重組蛋白EgP-29 免疫小鼠後，免疫保護力達到96. 6%。


(圖1)細粒棘球蚴重組疫苗候選分子製備流程圖、(圖2)重組表達質粒酶切鑑定 (Ml. 200bp DNA marker ；M2. Lander DNA HindIII marker ； 1.未酶切重組表達質粒；2.酶 切重組表達質粒；3. RT-PCR產物；4.酶切空表達質粒；5.未酶切空表達質粒)、(圖3)重組 蛋白細粒棘球蚴中國大陸株P-29 (EgP-29)表達及純化電泳圖譜(M.蛋白分子量Marker; 1.重組蛋白純化產物；2. EgP29/pET28a/BL21plysS誘導產物；3. BL21plysS誘導產物)。
具體實施例方式細粒棘球蚴組疫苗候選分子的製備1.利用生物信息學技術檢索目的基因片段首先登錄GenBank(美國國立衛生研究院)資料庫(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/GeneBank/)，輸入物種名稱-細粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)後，通過Entrez Nucleotide來查詢已登載的細粒棘球蚴基因序列，通過檢索，選取P_29基因序列作為基因 工程疫苗的候選基因。2.合成引物根據P-29的鹼基序列設計引物，引物序列分別列於序列表2至3。P-29基因之5』端引物見序列2 ；P-29基因之3』端引物見序列3。3.細粒棘球蚴原頭蚴總RNA的提取取新鮮或液氮中凍存的原頭蚴200mg，按總RNA提取試劑盒(Total RNAIsolation System)說明抽提總RNA。4. RT-PCR擴增及產物純化4. IRT-PCR 擴增按照RT-PCR試劑盒說明書指定的體積將無RNA酶水、AMV/Tfl 5 X buffer、dNTP 混合物、特異性上、下遊引物及25mM MgSO4W入到預先置於冰上的0. 2ml薄壁離心管中，配 製成反應混合物。反覆吹吸使混合物中各組分混合均勻。然後向反應體系中加入AMV逆轉 錄酶和Tfl DNA多聚酶。將反應管輕柔震蕩10秒以混勻。最後加入RNA模板，經PCR儀擴 增目的DNA。PCR反應組成為5 X buffer10 μ 1MgSO4 (25mM)2 μ 1dNTPs (IOmmol)1 μ 1引物 I2μ 1引物 II2μ 1
逆轉錄酶AMV1 μ 1DNA 聚合酶 Tf I1 μ 1RNA(lng/y 1)2μ 1 DEPC 水29 μ 1_合計50 μ 1在PCR儀按說明書上的要求設置反應條件第一條cDNA鏈的合成1個循環 48°C，45mins反轉錄反應1個循環 94°C，2mins 反轉錄酶AMV失活RNA/DNA/引物變性第二條cDNA鏈的合成及PCR擴增94 "C 30s 變性40 個循環 60°C Imin 復性68 "C 2mins 延伸1個循環 68°C 7mins 最後延伸1個循環 4°C儲存4. 2PCR產物的分離鑑定①灌膠按瓊脂糖濃度配製，稱Ig瓊脂糖倒入250ml三角燒瓶中加入IOOml IXTAE緩衝溶液，放入微波爐，中火段，3mins將膠溶解，稍涼一下(約80°C時)加入2 μ 1 10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液並混勻(注意！溴化乙錠為強致癌誘變劑，使用時一定小心。) 趁熱倒入電泳槽，並加上相應的梳子。②加樣將涼透後的膠放入水平電泳槽，加入IXTAE緩衝溶液將槽子倒滿。取 10 μ 1 DNA樣品於新的離心管中，加入2 μ 1 6 X上樣緩衝液混勻，用40 μ 1的加樣器小心將 樣品加入到孔中。③電泳將電泳裝置按正負極安好，以94mA的電流進行電泳，觀察溴酚蘭的位置 判斷電泳的速度。④觀察電泳結果將凝膠從電泳槽取出後放到紫外燈下觀察電泳結果，將膠放入 凝膠成像儀中拍照，並將結果保存在計算機中。4.3PCR產物的純化在紫外燈下用乾淨刀片切下含有目的片段的條帶，用DNA回收試劑盒純化PCR產 物①溶膠200-400mg瓊脂糖凝膠中加入0. 4ml純化樹脂(使用前充分混勻)，70°C 水浴箱水浴10-15mins，每2mins顛倒混勻一次，使瓊脂糖凝膠完全融化。②去膠將溶化的Agarose液移入吸附柱，離心30s (13000rpm)，倒掉收集管中的 廢液，再將吸附柱放入同一個收集管。③洗膠在吸附柱中加500 μ 180%乙醇，離心30s(13000rpm)，倒掉收集管中的濾 液，再將吸附柱放入同一個收集管。④在吸附柱中加入500μ 1 80%乙醇，靜置2min後，離心30s，倒掉收集管中的濾 液，將吸附柱放入同一個收集管。
⑤空柱離心 2mins (13000rpm)。⑥洗脫DNA 將吸附柱放入一個乾淨的1. 5ml EP管中，在吸附膜中央加入40 μ 1 T1 液(或 ddH20)，靜置 2mins 後，離心 Imin (13000rpm)。⑦保存將1 · 5ml EP管放入_20°C冰箱中，備用。5.將所得的PCR產物P-29基因進行酶切後連接入真核表達載體pET_28a得到重
組疫苗。 目的片段與表達載體pET_28a在T4DNA連接酶的作用下，4°C連接反應過夜。以空 載體做為對照，連接反應體系如下EgP-29/pET-28a pET_28a 對照pET-28a1 μ 11 μ 1目的片段 EgP-292 μ 10 μ 1IOXbuffer5μ 15μ 1T4DNA ligase (3ng/μ 1) 1 μ 11 μ 1ddH201 μ 13μ 1_總體積10 μ 110 μ 1將兩管混勻後，放4°C恆溫水浴循環儀過夜。5. 1 重組質粒 EgP-29/pET_28a 轉化大腸桿菌 BL21plys(1)感受態大腸桿菌BL21plys的製備。a)將大腸桿菌BL21plys劃盤於LB底瓊脂平板中，37°C，倒置培養過夜。b)挑取單個菌落接種於3ml LB培養液(每ml LB培養液中加入2 X Kana 2ul)，37°C振蕩培養2_3h直至OD6tltl約為0. 4，置於冰上降溫。c)4°C，12000rpm 離心 15s，棄上清。d)加入500 μ 1冰預冷的0. lmol/L的CaCl2溶液重懸沉澱，置於冰上30mins。e)4°C，12000rpm 離心 15s，棄上清。f)加入180 μ 1冰預冷的0. lmol/L的CaCl2溶液重懸沉澱(要輕)，4°C備用。(2)重組質粒轉化大腸桿菌BL21plysSg)將連接產物2 μ 1分別與感受態大腸桿菌BL21plys混合後置於冰上30mins。h)熱休克42°C水浴90s後，立即置於冰上2mins。i)加入 800 μ 1 YT 培養液後，37°C，150rpm 振蕩培養 1. 5h。j)6000rpm離心15s去上清800 μ 1，其餘重懸沉澱。(3)鋪板用兩塊LB底瓊脂平板(含2XKana 2 μ 1/ml)，凝固後置於37°C培養箱Ih後，將 180 μ 1轉化後的菌液均勻塗布於平板上，於37°C培養箱倒置過夜。次日觀察菌落生長情 況。5. 2重組質粒P-29/pET_28a酶切鑑定(1)挑取菌落挑取含Kana LB底瓊脂平板上的單個白色菌落，同時挑取另一塊空載體平板上的 單個白色菌落做陰參，分別接種於5ml LB培養液中，37°C，ISOrpm振蕩培養過夜。
(2) BamHI、NotI對相應的片段進行雙酶切鑑定反應體系如下重組質粒10 μ 1 (2 μ g)NotI1 μ 1BamHI1 μ 1ddH208 μ 1
_總體積20 μ 1置37°C水浴搖床，40rpm, 1. 5h。結束後1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。(3)目的基因的核苷酸序列測定及分析a.目的基因的核苷酸序列測定經BamHI、NotI雙酶切初步鑑定為陽性克隆的菌 株送往大連寶生物公司再次進行核苷酸序列測定。b.目的基因的核苷酸序列分析採用DNAman軟體分析基因的核苷酸序列(鹼基 數目、組成及開放閱讀框)，將測序結果在NCBI/GenBank資料庫進行blast比較和分析，並 與第一次插入基因片段的測序結果比對。5. 3重組P-29/pET_28a蛋白的表達及鑑定將重組菌接種於含卡那黴素(終濃度為50ug/ml)的LB培養基中，37°C，220rmp， 培養至0D600 = 0. 6時，收集誘導前的菌液後加入IPTG至終濃度為lmmol/1，分別調至 25°C、28°C、30°C振蕩培養過夜進而選擇最優的表達條件。6000r/min離心5分鐘，棄上清， 收集細菌沉澱。將樣本經SDS-PAGE、180V電壓電泳lh，用0. 2%考馬斯亮藍R250染色後， 用脫色液脫至本底無色為止。6.表達鑑定純化的P-29在寧夏醫科大學中心實驗室保存(保藏編號01)。用純化的P-29免 疫動物，製備抗血清。通過western-blot及ELISA鑑定rEgP-29的免疫學特性。6.1動物免疫①動物6周齡雌性ICR小鼠，體重(18 士 2g)，實驗隨機分為兩組A組、B組，每組 12隻ο②抗原製備A組每隻用純化的EgP-29重組抗原IOug (用PBS調至100 μ 1)與等 體積弗氏佐劑充分混合(首次為弗氏完全佐劑，第二三次為弗氏不完全佐劑)。採用多點皮 下注射方法，共3次，間隔2周。B組為PBS對照組，注射弗氏佐劑加PBS的乳化劑。抗原 定量根據Bio-Rad公司的Gel DocIOOO凝膠分析軟體對抗原進行定量。③製備抗血清0、2、4、6、8周各採血1次。最後，眼球取血殺小鼠。每次採完血放 4°C冰箱靜置約6h後，將鼠尾血液10000rpm，4°C離心lOmins，提取上層血清，_85°C保存。6. 2Western blot 鑑定重組蛋白①洗玻璃先用酒精棉球小心的將大小兩片玻璃按一個方向擦乾，再用甲醇棉球
再擦一遍，並晾乾。②膠的配製按操作要求將玻璃安裝到膠架上，配方如下10%分離膠5%濃縮膠ddH203ml1.8ml
30% AA 母液2. 5ml300 μ 11. 5molTris(pH8. 8) 1.88mlImolTris (pH6. 8) 750 μ 110% SDS75 μ 130 μ 110% APS75 μ 155 μ 1 TEMED7. 5 μ 15. 5 μ 1取一乾淨的50ml 燒杯，按順序加入 ddH20、30% 母液、1. 5mol Tris (pH8. 8) ,10% SDS (先預熱溶解)並充分混勻，再加入10 % APS 75 μ 1和TEMED 7. 5 μ 1 (二者均為促凝劑) 後吹勻，迅速用槍加入到已安裝好的兩層玻璃之間，然後加入ddH20覆蓋到上面，室溫下靜 置，待膠凝後(膠和水面呈現出界限)，將水倒出，並用濾紙條將多餘的水吸淨。將現配好的 濃縮膠加入到分離膠的上層，(注意不要產生氣泡，)並迅速加上梳子。室溫靜置30mins。③樣本的處理各取20 μ 1 rEgP-29、BL21plysS的表達產物及原頭蚴、囊液、囊壁 分別加入20μ1 2Χ電泳加樣緩衝液並混勻後，室溫靜置30mins，放入沸水中煮沸5mins。④加樣將凝好的膠安裝進入電泳槽，向內、外槽分別加入電泳緩衝液，將梳子小心 的水平取出。依次加入處理好的樣本，並作好記錄。⑤電泳(Electrophoresis)按正負極接好電源，打開開關，將電泳儀調至180V電 壓，電泳lh，直至指示劑染料溴酚藍接近膠底部時停止電泳。⑥轉印電泳結束後，立即取出凝膠，取一大小與膠相似的硝酸纖維薄膜，在轉移 電泳液中浸溼後與膠對齊，兩側放兩層濾紙，濾紙兩側各放一層海綿，膜在正極端，膠在負 極端，放入電轉移槽中，加滿轉移緩衝液，在300mA下對硝酸纖維膜進行印跡轉移電泳lh。⑦封閉、一抗孵育轉移電泳結束後，取出硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中， 37°C封閉2h或4°C過夜。以IXPBS-T(含0. 5%> Tween-20)溶液洗3次每次5mins。再將 硝酸纖維膜浸泡於(1 100稀釋)抗原免疫組的小鼠血清(一抗)中，4°C搖床上過夜。⑧二抗孵育、顯色次日將膜與1 800稀釋的羊抗鼠IgG-HRP結合，在37°C搖床 上反應2h。再以IXPBS-T溶液洗膜4次，每次慢搖lOmins。加入新配製的顯色液(6mg 4-氯-1-奈酚，2ml冷甲醇，IOml lXTBS,12y 1 H2O2)顯色2mins，最後用蒸餾水衝洗終止 反應。膜放入凝膠成像儀將結果保存在計算機中。6. 3酶聯免疫吸附實驗(ELISA)①抗原包被採用96孔酶標板，分別將囊液及原頭蚴天然抗原1 100稀釋、 rEgP-291 200稀釋後，按每孔100 μ 1包被酶標板4°C過夜。②封閉次日將96孔酶標板垂直向下棄去抗原，洗板機用IXPBS-T洗板4次，在 吸水紙上拍幹殘液後，按每孔加 οομ 1 5%脫脂奶粉封閉，放37°C溫箱中，反應lh。③加一抗反應Ih後，取出96孔酶標板垂直向下棄去脫脂奶粉，洗板機用 IXPBS-T洗板4次，在吸水紙上拍幹殘液後，每孔加入100μ 1按1 100稀釋的相應A 組、B組小鼠抗血清，4°C過夜。④加二抗後顯色第二天取出96孔酶標板垂直向下棄去一抗，洗板機用IXPBS-T 洗板4次，在吸水紙上拍幹殘液後，每孔加入IOOul按1 400稀釋的羊抗鼠IgG-HRP結合 一抗，在37°C溫箱中，反應2h。再以IXPBS-T溶液洗板機洗板4次。加入新配製的顯色液 (70ml 基質液，700 μ 1 6mgTMB/lml DMSO, 252 μ 1 H2O2)顯色 20mins, 2M 濃 H2SO4 每孔 50 μ 1 停止反應後，將酶標板放入Bio-Rad公司550型酶標儀上讀取數據。
7.進行保護實驗，經小鼠皮下接種疫苗，觀察其誘導動物抗肝包蟲攻擊感染的能 力，並研究疫苗抗感染的免疫機制。免疫保護力觀察①免疫保護力攻擊感染20周後剖殺小鼠，切開小鼠腹部，稱取小鼠脾臟，計算脾 指數，公式脾指數=脾的重量(mg)/小鼠體重(g)；計數肝臟及腸繫膜處的棘球蚴包囊，根 據Dempster1341計算免疫保護力，公式免疫保護力(％ ) = (1_免疫組平均包囊數/對照 組平均包囊數)X 100。②常規ELISA檢測小鼠血清特異性抗體水平選用小鼠免疫前、攻擊前(第三次免 疫後)和剖殺前(眼眶取血)三次血清做ELISA檢測IgG、IgGl、IgG3、IgG2a、IgG2b和IgE 水平，測 0D15(lnm。③統計學處理所有數據用SP SS統計軟體包處理，用單因素方差分析(ANOVA)進 行比較。8.實驗結果(1)Ρ-29免疫小鼠攻擊感染後的棘球蚴包囊數、免疫保護力及脾指數(χ士S)
權利要求
一種細粒棘球蚴基因工程疫苗，其特徵在於成功克隆了細粒棘球蚴(中國大陸株)P 29基因並且構建了基因工程菌株EgP 29/pET 28a/BL21(DE3)plysS，表達並純化出蛋白rEgP 29(分子量為31KD)。經免疫學鑑定初步說明rEgP 29有較好的抗原性及免疫原性，具有抗包蟲病疫苗候選分子的潛能。
2.根據權利要求1所述的細粒棘球蚴基因工程疫苗，其特徵在於能誘導小鼠產生免疫 保護力(免疫保護力達96. 6% )，其保護性免疫主要通過誘導宿主產生體液免疫應答和細 胞免疫應答，表明rEgP-29是具有保護機體免受細粒棘球蚴感染的效能。
全文摘要
一種細粒棘球蚴基因工程疫苗。從www.ncbi.nlm.nih.Gov的GenBank上檢索細粒棘球蚴烏拉圭株診斷抗原P-29基因序列，以中國寧夏地區包蟲病人的細粒棘球蚴病原體的總RNA為模板通過RT-PCR擴增P-29基因；擴增的基因DNA序列與烏拉圭株的基因序列一致。通過DNA重組技術，將克隆出的P-29基因與表達載體pET-28a重組，轉化並構建大腸桿菌工程菌株；製備P-29重組蛋白，將獲得的重組蛋P-29免疫小鼠後用寧夏地區包蟲病人的原頭蚴病原體攻擊免疫小鼠，經過實驗計算，EgP-29免疫保護力為96.6％。證明重組蛋白P-29具有疫苗的免疫學效應。
文檔編號A61P33/10GK101961487SQ200910159848
公開日2011年2月2日 申請日期2009年7月11日 優先權日2009年7月11日
發明者師志雲, 棘懷慶, 趙巍 申請人:趙巍;師志雲;棘懷慶