一種AD生物標記物及其檢測方法與流程
2023-07-15 09:09:46 3
本發明涉及AD生物標記物技術領域，尤其涉及一種AD生物標記物及其檢測方法。
背景技術：
阿爾茨海默症，簡稱AD (Alzheimer's Disease)，是一類神經退行性疾病，主要發作於65 歲以上老年人群中，全世界超過7000萬人患有不同程度痴呆，其中阿爾茨海默病超過50%，每年用於痴呆防治上的費用高達3150美元。在歐美主要城市人群中AD是僅次於癌症的第二大隱患，在我國1984~2004年60歲以上人口發病率為1.6％，患者總數已超過500萬。在各種易患因素中，年齡是AD最重要的影響因素，在65歲以上人群中，AD的發生率約為5.4%，且發病呈年輕化趨勢。AD患者的症狀體徵主要表現為起病隱匿、記憶障礙、認知障礙及精神障礙等，呈進行性不可逆進展，根據認知能力和身體機能的惡化程度分成三個時期，第一階段（1~3年）為輕度痴呆期，第二階段（2~10年）為中度痴呆期，第三階段（8~12年）為重度痴呆期，該期患者完全失去生活能力，嚴重時引起併發症導致死亡。隨著全球人口老齡化進程加快，其發病率愈來愈高，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔。
AD病理學上以神經炎性斑( NPs) 又稱老年斑( SPs) 、神經原纖維纏結( NFTs)和腦血管澱粉樣變性( CAA) 為典型病理特徵，腦組織內澱粉樣蛋白質片段異常增加或聚集是導致神經元死亡的主要原因。針對 β 澱粉樣蛋白（amyloid β, Aβ）為靶點的有關疫苗的臨床試驗均以失敗告終，提示多靶點幹預AD 的重要性，目前AD無法治癒，阿爾茨海默病的早期診斷對其預防和治療起著關鍵性的作用，同時新型生物標誌物的發現與應用有助於揭示新的治療靶點及AD 新藥的臨床評價。
目前臨床上已應用的AD生物標誌物及檢測技術非常有限，主要包括反映Aβ聚集情況的腦脊液(CSF) Aβ42濃度，以及總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的水平來作為AD生物標誌物。疾病中晚期實施的藥物幹預與治療難以逆轉病情，效果甚微，儘管目前有很多藥物治療，但並不能顯著改善臨床症狀和疾病生理發展進程。輕度認知障礙是介於正常化和痴呆之間的一種臨床狀態，因其發病率高、缺乏有效敏感的早期診斷指標、易漏診和誤診成為防治AD的難點問題。當前臨床上對AD的鑑別和診斷，主要依靠以臨床症狀為基礎的體檢、輔助檢查和神經心理測試等方法。其實，在臨床症狀出現之前的5~10年，AD的病理改變已經發生，因此，阿爾茨海默病的早期診斷是預防和延緩AD病程的有效途徑。
蛋白質組學技術可以檢測到系統蛋白質表達水平、結構，提供蛋白質的修飾信息，以及蛋白之間的相互作用，可高通量識別樣本中的蛋白質並對其含量進行分析，因為蛋白質組學的這些特性，它在分子疾病表型，尋找藥物靶點和臨床診斷生物標誌物提供了一個綜合而廣泛的路徑。
因此，現有技術還有待於改進和發展。
技術實現要素：
鑑於上述現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種AD生物標記物及其檢測方法，旨在解決現有AD生物標記物應用受到限制和檢測結果變動很大的問題。
本發明的技術方案如下：
一種AD生物標記物，其中，所述AD生物標記物包括表達量上調蛋白和表達量下調蛋白中的一種或兩種；
所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一種或多種；
所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一種或多種。
所述的AD生物標記物，其中，所述AD生物標記物為表達量上調蛋白；
所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一種或多種。
所述的AD生物標記物，其中，所述AD生物標記物為表達量下調蛋白；
所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C，Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一種或多種。
所述的AD生物標記物，其中，所述AD生物標記物包括表達量上調蛋白和表達量下調蛋白；
所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一種或多種；
所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一種或多種。
所述的AD生物標記物，其中，所述AD生物標記物包括表達量上調蛋白和表達量下調蛋白；
所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11和Alpha-2-macroglobulin；
所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B和Annexin A3。
一種AD生物標記物的檢測方法，其中，採集唾液，採用ITRAQ蛋白質組學分析技術，檢測唾液中是否存在如上任一所述的AD生物標記物。
有益效果：本發明上述蛋白的任意組合均可以作為AD生物標記物，該AD生物標記物均能準確地反映AD病理發展狀況，實現對AD的早期診斷。
具體實施方式
本發明提供一種AD生物標記物及其檢測方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
本發明提供一種AD生物標記物，其中，按照表達量改變程度的不同，所述AD生物標記物可分為兩組：表達量上調蛋白（表達量增加，上調）和表達量下調蛋白（表達量下降，下調），即本發明所述AD生物標記物包括表達量上調蛋白和表達量下調蛋白中的一種或兩種；
具體地，所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E（蛋白質-穀氨酸-γ-穀氨醯胺基轉移酶E） 、Protein S100-A12（S100-A12蛋白）、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1（α-2-巨球蛋白-樣蛋白1）、Polymeric immunoglobulin receptor（聚合免疫球蛋白受體）、Myeloperoxidase（髓過氧化物酶）、Peroxiredoxin-1（過氧物毒素-1）、Protein S100-A11（S100-A11蛋白）、Alpha-2-macroglobulin（α-2-巨球蛋白）中的一種或多種；
具體地，所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C（胱胺酸蛋白酶抑制劑C）、Histone H2A（組蛋白H2A）、Histone H2B（組蛋白H2B） 、Tubulin alpha-1B（微管蛋白α-1B）、Annexin A3（膜聯蛋白A3）中的一種或多種。
換句話說，本發明確定了用於診斷AD的生物標記物，AD生物標記物為以上13種表達差異蛋白中的一種或多種蛋白的組合：8種表達量上調蛋白和5種表達量下調蛋白。本發明上述蛋白的任意組合均可作為AD生物標記物，其均能準確地反映AD病理發展狀況，實現對AD的早期診斷。
作為優選實施例，所述AD生物標記物為表達量上調蛋白；所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一種或多種。本發明上述表達量上調蛋白中的一種或多種可以作為AD生物標記物，檢測上述表達量上調蛋白中的一種或多種的表達量變化情況，根據表達量變化情況即可實現對AD的早期診斷。
作為另一優選實施例，所述AD生物標記物為表達量下調蛋白；所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C，Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一種或多種。即本發明上述表達量下調蛋白中的一種或多種同樣可作為AD生物標記物，檢測上述表達量下調蛋白中的一種或多種的表達量變化情況，即可實現對AD的早期診斷。
作為另一優選實施例，所述AD生物標記物包括表達量上調蛋白和表達量下調蛋白；
所述表達量上調蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一種或多種；
所述表達量下調蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一種或多種。即本發明將上述表達量上調蛋白和表達量下調蛋白作為蛋白質組，以該蛋白質組作為AD生物標記物，該AD生物標記物同樣可實現對AD的早期診斷，並能夠提高診斷的準確度。
本發明還提供一種AD生物標記物的檢測方法，其中，採集唾液，採用ITRAQ蛋白質組學分析技術，檢測唾液中是否存在如上任一所述的AD生物標記物。
本發明通過ITRAQ蛋白質組學分析技術，檢測唾液中是否存在如上任一所述的AD生物標記物，若存在則表明為AD患者，若不存在則表明為健康。本發明將上述表達差異蛋白中的任意一種或一種以上以組合作為AD檢測標誌物，用於臨床診斷，可極大提高診斷特異性和準確性。本發明中唾液的採集快速簡單，與腦脊液取樣相比創傷性小、安全性高。與AD的影像學檢測方法如PET檢測相比，對患者無毒副作用，且具有定量檢測的效果。
本發明檢測AD唾液中蛋白的表達量變化情況，與目前臨床使用的量表檢測及影像學診斷相比，人為主觀性降低，更為準確，而且具有定量檢測的效果。
下面通過具體實施例對本發明進行詳細說明。
實施例
（1）唾液中蛋白的提取
1、樣品分類，15例AD患者唾液和15例年齡匹配的正常對照組唾液，做好標記。
2、12000r 4℃離心10min ，吸取上清。
3、將取450ul上清加入10KD超濾管的柱子中，11000r離心20min，重複3-4次，注意將柱子上的液體離心乾淨。
4、取200ul 50mM Tris-Hcl（（羥甲基）氨基甲烷）清洗，11000r離心20min，重複2次。
5、加入200ul 50mM Tris-Hcl溶解離心分離出的蛋白。
6、BCA定量測定蛋白濃度。
7、取出100ug蛋白至新的EP管（塑料管）中，剩餘的不動，封口，凍幹。
（2）唾液蛋白酶切步驟
1．按蛋白定量結果向1.5mL的離心管中加入100μg唾液蛋白，用Buffer（緩衝液）定容體積至40 μL，並做好標記。向每管樣品中加入4倍體積（160 μL）的還原劑，充分渦旋混勻，短時離心將粘在管壁上的蛋白溶液離到管底，然後37℃水浴（或者恆溫振蕩器400rpm）1.5 h。
2．取出樣品後進行短時離心，加入與還原劑等體積（160 μL）的烷基化試劑，渦旋混勻，室溫避光放置15 min。
3．取新的超濾管做好標記，然後將烷基化後的樣品轉移至對應的超濾管中，4℃，11500 rpm（10000g）30min，將未反應液體全部離心下去（廢液）。
4．向每個超濾管中加入150 μL TEAB溶液（ 四乙基溴化銨溶液），4℃，11500 rpm（10000g），30min，直至超濾管中的液體全部離心下去，重複3~4次。
5．吸儘管底的廢液，加入400μLH2O將超濾管洗淨，然後倒掉液體，向每管中加入100 μL 配製好的酶解液，37℃水浴過夜15h。
6. 取出酶解好的蛋白樣品，室溫下11500rpm，離心10min，再加入100ulTEAB溶液(確認不含尿素)，室溫下11500rpm，離心5 min，重複一次。
7. 將過濾得到的液體轉移至乾淨新離心管中，做好標記，封口膜封好，再用針在膜上扎些小孔，將其置冷凍乾燥濃縮儀裡過夜凍幹。
8. 取出凍幹的樣品，向其中加入30μL TEAB（不含尿素）使其濃度為1 μg/μL，並充分渦旋混勻。
9. iTRAQ試劑的準備：確保樣品的pH呈鹼性一般為8左右，用異丙醇溶解iTRAQ試劑，是最終的反應體系中有機溶劑的比例大於65%，一般為70%。從-20℃冰箱中取出試劑，向每管中加入70 μL異丙醇，充分渦旋混勻，離心，重複1次。
10. 取混勻離心後的iTRAQ試劑分別加入到含30μL蛋白樣品的離心管中，渦旋混勻，離心，於室溫下放置2 h。
11. 反應結束後向每管中加入100μL色譜純水終止反應30 min。
12 將終止反應的液體離心後轉移至一個管中混勻，將其轉移至冷凍乾燥機中過夜凍幹。
13 取出凍幹樣品，加100ul水溶解均勻，液相色譜分離，將所得溶液於冷凍乾燥機凍幹。
14 液相色譜串聯質譜鑑定，質譜採集到的原始wiff圖譜文件，採用Protein Pilot Software v. 4.5(AB SCIEX, USA)軟體進行數據加工處理和檢索分析。
（三）結果
將15例AD患者和15例年齡匹配的正常對照組唾液進行ITRAQ蛋白質組學分析後，發現AD組相比於健康對照組有8個明顯上調的蛋白，分別為：Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E ，Protein S100-A12，Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Polymeric immunoglobulin receptor，Myeloperoxidase，Peroxiredoxin-1，Protein S100-A11，Alpha-2-macroglobulin.，5個明顯下調的蛋白：Cystatin-C，Histone H2A，Histone H2B ，Tubulin alpha-1B，Annexin A3。
綜上所述，本發明提供一種AD生物標記物及其檢測方法，本發明通過ITRAQ蛋白質組學分析技術，檢測唾液中是否存在上述表達差異蛋白，將上述表達差異蛋白中的任意一種或一種以上以組合作為AD檢測標誌物，用於臨床診斷，可極大提高診斷特異性和準確性。本發明中唾液的採集快速簡單，與腦脊液取樣相比創傷性小、安全性高。與AD的影像學檢測方法如PET檢測相比，對患者無毒副作用，且具有定量檢測的效果。本發明檢測AD唾液中蛋白的表達量變化情況，與目前臨床使用的量表檢測及影像學診斷相比，人為主觀性降低，更為準確，而且具有定量檢測的效果。
應當理解的是，本發明的應用不限於上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。