一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒及其製備方法

2023-07-15 07:49:51

專利名稱：一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物納米材料及技術領域，尤其涉及一種簡單有效的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒及其製備方法。
背景技術：
近年來,普魯士藍納米顆粒(Prussian blue nanoparticles, PBNPs)在模擬酶領域受到了廣泛的關注，由於具備較低的氧化還原電位和良好的電子轉移能力，PBNPs被認為是一種高性能的人工模擬酶。 鐵蛋白(ferritin)是一種由24個亞基自組裝形成的直徑為12nm的球形蛋白，內腔直徑8nm左右,儲存著鐵的水合氧化物納米顆粒。它是一種天然的納米結構，具有特殊的生物功能。雖然人類、馬、牛蛙和細菌等的鐵蛋白在一級結構上有很大的差異，但是本質上它們擁有相同的體系結構，所以其他機體的鐵蛋白應該和人類的鐵蛋白具有相同的功能。研究發現，很多腫瘤細胞表面大量表達鐵蛋白特異性受體，從而通過鐵蛋白受體一鐵蛋白的結合介導對鐵蛋白的內吞作用。有報導指出，重鏈鐵蛋白(HFt)的受體是轉鐵蛋白受體I(Transferrin receptor-1,TfRl),在腫瘤組織中，TfRl的表達量遠遠高於健康組織及癌周組織，這保證了腫瘤組織對鐵的攝取，對腫瘤的發生、發展及代謝具有重要意義。各種天然的鐵蛋白(含鐵)和重組鐵蛋白(無鐵)已經被使用作為模板來合成各種納米顆粒，如磁性Fe3O4納米顆粒、半導體CdS量子點、Au原子團簇、CoPt合金納米顆粒,等等。製備方法一般先要通過還原溶解方法去除天然的鐵蛋白內的氧化鐵核，或直接利用空的重組鐵蛋白殼作為模板。目前主要的合成途徑有兩種(1)鐵蛋白加載途徑；(2)鐵蛋白分解-組裝途徑。途徑I是將一種反應物通過擴散填充入鐵蛋白殼內，去除游離的反應物後，再加入另外一種反應物進行反應，從而在蛋白殼內形成納米顆粒；多次重複上述步驟以增大蛋白殼內顆粒的尺寸，以滿足需要；最後進行純化除去游離的剩餘反應物。途徑2在鐵蛋白內填充反應物的方法是，將鐵蛋白殼在酸性條件下解聚，使24個亞基分散，並與反應物混合，通過調節PH到7. 5^8. 5再使24個亞基重新組裝成鐵蛋白，同時將反應物包含到蛋白殼內，然後按照前一種方法與另外一種反應物反應。這種方法更適合於填充較大的反應物。上述兩種方法較為複雜，都需要利用重組的空腔鐵蛋白或先將天然鐵蛋白的內核去除，還需要不斷地交替進行反應物之間的反應以達到所需的納米顆粒尺寸，其中第二種方法藉助鐵蛋白在低PH下解聚來實現反應物的填充，填充量有限，因此製備方法效率低，難以放大生產，並造成獲得的最終產物穩定性較差，尺寸難於控制，生物表面活性受到影響。

發明內容
本發明要解決的技術問題在於，針對現有技術的上述缺陷，提供產物穩定、尺寸均一且活性好的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒，並進一步提供一種過程簡單的製備方法和用途。為實現上述目的，本發明可採用的技術方案是
—種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒,亞鐵氰化鉀穿過鐵蛋白表面的蛋白質亞基之間的通道並與鐵蛋白內核表面的三價鐵離子反應生成普魯士藍，隨後所述普魯士藍附著於該內核表面形成。在優選地實施例中，所述普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的等電點為4飛，外周尺寸為10-12納米。本發明進一步提供了一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，它包括以下步驟，步驟一、取一定量的鐵蛋白，用ρΗ=2. (Γ4. 5的酸性溶液稀釋並混合均勻，得到鐵蛋白溶液；取一定量的亞鐵氰化鉀，用PH=L 5^4. 5的酸性溶液稀釋並混合均勻，得到亞鐵氰化鉀溶液；在該步驟中，製取鐵蛋白溶液或亞鐵氰化鉀溶液的順序是任意的；步驟二、取一定體積的所述亞鐵氰化鉀溶液加入到一定體積的所述鐵蛋白溶液中或取一定體積的所述鐵蛋白溶液加入到所述亞鐵氰化鉀溶液中，混合均勻，在l°c 70°C之 間的某一溫度下進行恆溫反應，其中，在混合後的溶液中，以鐵元素的濃度計，亞鐵氰化鉀與鐵蛋白的摩爾比為O. 5^1. 25 ；步驟三、在反應1(Γ30小時之後，取出溶液，在pH = 2. (Γ4. 5的酸性溶液中用透析袋進行透析，每隔4 10小時更換一次溶液，透析2飛次；步驟四、取出透析過的溶液，用離心機500(Tl0000r/min的速度離心5 20min,將
得到的最終溶液，放置在恆溫容器中保存，所述恆溫容器的溫度設定為TC至10°C之間的
某一溫度O優選地，在所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法中在所述步驟二中，將混合後的溶液在l°c至13°c之間的某一溫度下進行恆溫反應。優選地，在所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法中在所述步驟二中，將混合後的溶液在4±0. 5 °C之間的某一溫度下進行恆溫反應。優選地，在所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法中在所述步驟一或步驟三中，所述酸性溶液的pH = 3±0. I。優選地，在所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法中在所述步驟五中，將最終溶液放置在恆溫容器中保存，恆溫容器的溫度設定為3°C 4. 5°C之間的某一溫度。優選地，在所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法中所述鐵蛋白為馬脾鐵蛋白。優選地，在所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法中在步驟二中，以鐵元素的濃度計，亞鐵氰化鉀與鐵蛋白的摩爾比為O. 75^1. O。本發明所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒在製備診斷腫瘤藥劑中的應用。
本發明所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法簡單有效，得到的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒尺寸小(10-12nm)、單分散，以藍色透明水溶液形式保存，穩定性好；得到的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒具有高的類過氧化物酶活性，可催化常用的過氧化物酶底物反應，該納米顆粒具有鐵蛋白的表面特性和好的生物相容性，表面易於修飾和功能化。應當認識到，本發明以上各方面中的特徵可以在本發明的範圍內自由組合，而並不受其順序的限制一隻要組合後的技術方案落在本發明的實質精神內。


下面將結合附圖及實施例對本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒及製備方法作進一步說明，附圖中圖Ia是鐵蛋白納米顆粒的結構示意圖。圖Ib是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的結構示意圖。圖2a是本發明的未染色的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的透射電鏡照片圖2b是本發明普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的高解析度的TEM圖；
圖2c是本發明的用2%磷鎢酸負染的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的電鏡照片;圖3是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的紫外可見吸收光譜圖。圖4a是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒催化TMB的類過氧化物酶活性圖；圖4b是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒催化ABTS的類過氧化物酶活性圖；圖5a是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒在底物為TMB時的類過氧化物酶活性和PH的關係圖；圖5b是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒在底物為ABTS時的類過氧化物酶活性和PH的關係圖；圖5c是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒類過氧化物酶活性隨溫度的變化關係圖；圖5d是本發明的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒類過氧化物酶活性隨自身濃度的變化關係圖；圖6是本發明的在不同pH條件下合成的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的紫外可見吸收光譜圖；圖7a至7d是不同亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵濃度計摩爾比條件下合成普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的透射電鏡照片，其中，圖7a至圖7d的亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白摩爾比(以鐵元素濃度計)分別為O. 5,0. 75，I. O, I. 25 ；圖8是本發明在不同亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白摩爾比(以鐵元素濃度計)條件下合成普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的紫外可見吸收光譜。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
，進一步闡明本發明，應理解這些實施方式僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，在閱讀本發明之後，本領域的技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落於本申請的權利要求所限定的範圍。如圖Ia和圖Ib所示，是鐵蛋白顆粒和經普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的結構不意圖。圖Ia是反應之如的鐵蛋白顆粒2的結構不意圖，在該圖中，鐵蛋白內核21被亞基22包裹。圖Ib顯示的是獲得的鐵蛋白顆粒1，從中可見普魯士藍顆粒3沉澱在鐵蛋白內核11上，亞基12環繞在內核周圍。以鐵蛋白為合成模板，通過在酸性條件下亞鐵氰化鉀通過蛋白亞基之間的孔道在鐵蛋白內核氧化鐵顆粒上的沉積(附著)，實現單分散的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米結構製備。在這裡，沉積或附著表示普魯士藍和鐵蛋白內核之間的位置關係，兩者之間通過物理的作用(包括疏水、親水作用，以及分子之間的其他作用)和化學的作用(化學鍵，包括配位鍵、離子鍵)結合。通過上述物理、化學作用力使亞鐵氰化鉀與鐵蛋白內核形成的普魯士藍和鐵蛋白內核形成一種特定的結構和位置關係。轉到圖2a至圖2c，為普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的透射電鏡照片。其中2a圖為未染色的PB-Ft (普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒)，從中可以看到普魯士藍修飾的內核氧化鐵顆粒，平均尺寸約為7nm ;圖2b為高分辨TEM (透射電鏡)圖，可以看到經過修飾後的不完整內核晶格結構；圖2c為用2%磷鎢酸負染的PB-Ft納米顆粒，可以清楚地觀察到鐵蛋白的完整蛋白質外殼。接著描述圖3，是普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的紫外可見吸收光譜圖。馬脾鐵蛋白(HoSF)在280nm處有蛋白質的特徵吸收峰，而PB-Ft納米顆粒在280nm處有蛋白質的特徵吸收峰，且在710nm左右有普魯士藍特徵吸收峰。 轉到圖4a至圖4b，是普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒催化不同的過氧化物酶底物時的類過氧化物酶活性測量結果。圖4a中，以TMB為顯色底物，對照組和HoSF組幾乎未顯示顏色變化，而PB-Ft納米顆粒組在IOmin內有明顯的吸光度的上升,說明PB-Ft納米顆粒可以有效地催化H2O2氧化底物TMB顯色。圖4b中以ABTS為顯色底物，對照組幾乎沒有發生顏色變化，HoSF組有較弱的吸光度上升，而PB-Ft納米顆粒組在IOmin內有明顯的吸光度的上升，說明PB-Ft納米顆粒可以有效地催化H2O2氧化底物ABTS顯色。其中，TMB為3，3』，5，5』 -四甲基聯苯，ABTS為2，2』 - 二氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽，二者均為過氧化物酶顯色底物。轉到圖5a至圖5d，分別是普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒類過氧化物酶活性的隨pH、溫度和自身濃度的測量結果關係圖。從圖5a和圖5b中可見PB-Ft納米顆粒的催化活性表現了較強的PH依賴性。當以TMB為底物時，PB-Ft納米顆粒的催化活性在pH為3時最大，PH小於2或大於4時，催化活性很低，當pH大於4時，催化活性均處於一個較低的水平。在圖5b中可見，當底物為ABST時，PB-Ft納米顆粒的催化活性隨著pH的升高急劇下降，當pH大於4時,反應活性一直處於較低的水平。從圖5c中可見,PB-Ft納米顆粒的催化活性隨著溫度的升高不斷提高，到60°C左右達到最高，隨後反應活性稍有下降。從圖5d中可見PB-Ft納米顆粒的催化活性與PB-Ft納米顆粒的濃度從I μ g/mL升高至7 μ g/mL範圍內呈線性相關，其催化底物發生顯色反應的吸光度變化滿足線性方程y=0. 0796x+0. 3727，其中 R2=O. 9896。圖6是本發明的在不同pH條件(線條61、62和63所示)下合成的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的紫外可見吸收光譜圖；從圖中可知，PB-Ft納米顆粒在280nm處和700nm處有特徵吸收峰。轉到圖7a至7d，是不同亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵濃度計摩爾比條件下合成普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的透射電鏡照片，其中，圖7a至圖7d的亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白摩爾比(以鐵元素濃度計)分別為O. 5,0. 75，I. O, I. 25。從照片中可見，隨著亞鐵氰化鉀的濃度比例的不斷增加，鐵蛋白內核中的普魯士藍顆粒的沉積量也不斷提高，到1.0時基本達到飽和。實驗發現亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵元素濃度計的摩爾比O. 5^1. 25為適宜的反應範圍，亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵濃度計的摩爾比低於O. 5生成的普魯士藍過少從而類酶活性過低，亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵濃度計的摩爾比高於I. 25則有較多游離的普魯士藍生成，影響產品的純度。結果表明在上述條件下均可獲得形貌完好、尺寸均一的納米顆粒。最後描述圖8，是不同亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵濃度計摩爾比為O. 5,0. 75、I. O、I. 25 (分別無81-84線條所示)條件下合成的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的紫外可見吸收光譜。隨著鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白摩爾比的增高，普魯士藍在710nm處吸收值增高，說明修飾上去的普魯士藍增多。實施例I一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備流程先取940 μ g馬脾鐵蛋白，用20mLpH 3. O的HCl溶液稀釋，搖晃使得其充分混合(Fe3+的濃度約為I. 8mM);再稱取190mg 亞鐵氰化鉀，用pH=3. O的鹽酸溶液定容到250mL (亞鐵氰化鉀濃度約為I. 8mM)，取150μ L加入到第一步的馬脾鐵蛋白溶液中，充分混合。該溶液中，以鐵元素濃度計，亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白摩爾比為O. 75 ;將上述溶液充分混合之後轉入到4°C冰箱中過夜反應；24小時之後，取出反應溶液，用規格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中進行透析，7小時換一次溶液，透析4遍；取出透析完的溶液,用離心機7000r/min的速度離心15min以去除可能沉澱的一些聚集體，所得到的藍色透亮溶液即普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒，放置在4°C冰箱中保存。實施例2-8一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備流程，如下所示改變反應pH條件，實施例2-8中的pH值分別為2. O、2. 5、2. 8、2. 9、3. O、3. I、3. 2、3. 5進行製備，具體如下先取940 μ g 馬脾鐵蛋白，分別用 20mL 的 ρΗ=2· 0、2· 5、2· 8、2· 9、3· 1、3· 2、3· 5 的HCl溶液稀釋，搖晃使得其充分混合(Fe3+的濃度約為I. 8mM);再稱取190mg亞鐵氰化鉀，分別用ρΗ=2. 0、2· 5、2· 8、2· 9、3· 1、3· 2、3· 5的鹽酸溶液定容到250mL (亞鐵氰化鉀濃度約為1.8mM)，取150 μ L加入到第一步的馬脾鐵蛋白溶液中，充分混合。該溶液中亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵濃度計摩爾比為O. 75 ;將上述溶液充分混合之後轉入到4°C冰箱中過夜反應；24小時之後，取出反應溶液，用規格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中進行透析，7小時換一次溶液，透析4遍；取出透析完的溶液，用離心機7000r/min的速度離心15min以去除可能沉澱的一些聚集體。實驗中所述pH=2. 9^3. I為適宜的反應範圍，pH低於2. 9生成的產物穩定性較差，PH高於3. I則無藍色普魯士藍生成。實施例9-16一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備流程，如下所示實施例9-16中的亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白的摩爾比(以鐵元素的濃度計)分別為 O. 25、0· 5、0· 75、1· 0、1· 25、1· 5、1· 75、2· O。製備過程為先取 940 μ g 馬脾鐵蛋白，用20mLpH=3. O的HCl溶液稀釋，搖晃使得其充分混合(Fe3+的濃度約為I. 8mM);再稱取190mg亞鐵氰化鉀，用pH=3. O的鹽酸溶液定容到250mL (亞鐵氰化鉀濃度約為I. 8mM),分別取 50μ L、100y L、150y L、200y L、250y L、300y L、350y L、400y L 加入到第一步的馬脾鐵蛋白溶液中，充分混合。該溶液中亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白以鐵元素濃度計摩爾比分別為O. 25,0. 5,0. 75、I. O、I. 25、I. 5、I. 75,2. O ;將上述溶液充分混合之後轉入到4°C冰箱中過夜反應；24小時之後，取出反應溶液，用規格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中進行透析，7小時換一次溶液，透析4遍；取出透析完的溶液，用離心機7000r/min的速度離心15min以去除可能沉澱的一些聚集體。實施例17-22先取940 μ g馬脾鐵蛋白，用20mLpH 3. O的HCl溶液稀釋，搖晃使得其充分混合(Fe3+的濃度約為I. 8mM);再稱取190mg亞鐵氰化鉀，用pH=3. O的鹽酸溶液定容到250mL(亞鐵氰化鉀濃度約為I. 8mM)，取150 μ L加入到第一步的馬脾鐵蛋白溶液中，充分混合。該溶液中，以鐵元素濃度計，亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白摩爾比約為O. 75 ;將上述溶液充分混合之後轉入到2°〇、31、41、81、131、371、601和70°C的恆溫容器中反應；24小時之後，取出反應溶液，用規格13K的透析袋在pH 3. O的HCl溶液中進行透析，7小時換一次溶液，透析 4遍；取出透析完的溶液，用離心機7000r/min的速度離心15min以去除可能沉澱的一些聚集體，所得到的藍色透亮溶液即普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒，放置在4°C冰箱中保存。需要說明的是，在上述實施例1-16中，技術人員可以根據實際需要改變某些參數，例如馬脾鐵蛋白和亞鐵氰化鉀的重量、酸性溶液的體積，以及馬脾鐵蛋白和亞鐵氰化鉀的濃度，實質上只需要調節亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白的摩爾比在一定的範圍即可，其中亞鐵氰化鉀/馬脾鐵蛋白的摩爾比是以鐵元素濃度計的，即混合後的溶液中亞鐵氰化鉀的鐵元素和鐵蛋白中的鐵元素的濃度比。另外，技術人員還可以根據上述實施例對透析和離心的條件進行優化。需要注意的是，離心速度不能過高，以防止修飾後的鐵蛋白被沉澱而分離出去。技術人員還可以選擇其他動物的鐵蛋白進行上述實驗，本發明採用馬脾鐵蛋白具有原料來源廣、成本較低的優點。在上述實施例中，採用鹽酸來產生酸性溶液，在其他實施例中，技術人員也可以採用硝酸、硫酸等有機酸或醋酸等無機酸來實現。上述普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒可以用來製備用於腫瘤診斷的藥物，例如用作腫瘤組織免疫組織化學(IHC)檢測的探針。經試驗驗證上述探針對食管癌、胃癌和乳腺癌的靈敏度可以達到96%以上。表I是普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的米氏動力學參數測量結果。Fe3O4納米粒子是當前研究得較多的一種納米粒子模擬酶，平均粒徑也在IOnm左右。PB-Ft納米顆粒的kcat值比Fe3O4高兩個數量級，說明PB-Ft納米顆粒的催化能力比Fe3O4納米粒子強得多。
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發明人發展了一種新的基於天然鐵蛋白模板的合成方法，無需去除內部氧化鐵核，而是利用亞鐵氰化鉀在氧化鐵核表面的沉積反應，進行有效普魯士藍修飾和功能實現，巧妙地將普魯士藍的高的類過氧化物酶活性和鐵蛋白本身的生物特性結合起來，從而實現單分散和生物相容性納米顆粒的製備，並克服了無法直接將普魯士藍顆粒沉澱在 鐵蛋白內核中的技術難點。通過鐵蛋白模板法來合成普魯士藍納米顆粒，一方面由於粒子比較小，具有很大的比表面積，有望得到較高的酶活性，另一方面複合物可以具備鐵蛋白的蛋白質活性，且和機體具有很好相容性，有望得到更廣的生物應用範圍。
權利要求
1.一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒，其特徵在於，亞鐵氰化鉀穿過鐵蛋白表面的蛋白質亞基之間的通道並與鐵蛋白內核表面的三價鐵離子反應生成普魯士藍，隨後所述普魯士藍附著於該鐵蛋白內核表面形成。
2.根據權利要求I所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒，其特徵在於，所述普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的等電點為4飛，外周尺寸為1(T12納米。
3.—種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，它包括以下步驟， 步驟一、取一定量的鐵蛋白，用pH=2. (T4. 5的酸性溶液稀釋並混合均勻，得到鐵蛋白溶液；取一定量的亞鐵氰化鉀，用PH=L 5^4. 5的酸性溶液稀釋並混合均勻，得到亞鐵氰化鉀溶液； 步驟二、取一定體積的所述亞鐵氰化鉀溶液加入到一定體積的所述鐵蛋白溶液中或取一定體積的所述鐵蛋白溶液加入到所述亞鐵氰化鉀溶液中，混合均勻，在1°C 70°C之間的某一溫度下進行恆溫反應，其中，在混合後的溶液中，以鐵元素的濃度計，亞鐵氰化鉀與鐵蛋白的摩爾比為0. 5^1.25 ； 步驟三、在反應1(T30小時之後，取出溶液，在pH = 2. (T4. 5的酸性溶液中用透析袋進行透析，每隔4 10小時更換一次溶液，透析2飛次； 步驟四、取出透析過的溶液，用離心機500(Tl0000r/min的速度離心5 20min,將得到的最終溶液，放置在恆溫容器中保存，所述恆溫容器的溫度設定為TC至10°C之間的某一溫度。
4.根據權利要求3所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，在所述步驟二中，將混合後的溶液在1°C至13°C之間的某一溫度下進行恆溫反應。
5.根據權利要求3所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，在所述步驟二中，將混合後的溶液在4±0. 5 °C之間的某一溫度下進行恆溫反應。
6.根據權利要求3至5任一項所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述步驟一或步驟三中，所述酸性溶液的pH = 3±0. I。
7.根據權利要求3至5任一項所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，在所述步驟五中，將最終溶液放置在恆溫容器中保存，恆溫容器的溫度設定為3 0C 4.5 °C之間的某一溫度。
8.根據權利要求3至5任一項所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述鐵蛋白為馬脾鐵蛋白。
9.根據權利要求3至5任一項所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒的製備方法，其特徵在於，在步驟二中，以鐵元素的濃度計，亞鐵氰化鉀與鐵蛋白的摩爾比為0. 75^1. O。
10.權利要求I所述的普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒在製備診斷腫瘤藥劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種普魯士藍修飾的鐵蛋白納米顆粒及其製備方法，它由亞鐵氰化鉀穿過鐵蛋白表面的蛋白質亞基之間的通道並與鐵蛋白內核表面的三價鐵離子反應，隨後附著於該內核表面形成。該鐵蛋白納米顆粒的製備方法包括如下步驟製備鐵蛋白和亞鐵氰化鉀的溶液，將上述溶液混合，並在一定條件下反應，經透析、離心後，獲得最終產品。本發明的鐵蛋白納米顆粒具有尺寸小，穩定性好和生物活性高的優點。
文檔編號G01N33/574GK102964445SQ201210444339
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者張宇, 張薇, 馬明, 顧寧, 王建國 申請人:東南大學, 南京東納生物科技有限公司