抗類風溼關節炎的小肽基因及其生產方法
2023-07-28 12:51:56 1
抗類風溼關節炎的小肽基因及其生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗類風溼關節炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本發明利用基因重組的方法來生產DNAJP1的衍生物M-DNAJP1，人工構建dnaJP1的基因，並通過首尾相連中間添加蛋氨酸的方法進行串聯形成如下方式：M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1，將其克隆到質粒pet31b(+)中，然後轉化進大腸桿菌中進行表達得到DNAJP1修飾後的多肽：M-DNAJP1的重複序列如SEQIDNO：2所示。通過發酵製備該小肽，然後利用溴化氰裂解的方法來得到游離多肽，裂解後的溴化氰通過高溫高壓處理，生成氨水和甲酸鈉，減少對環境的汙染，整個過程成本低，產量高，純化簡單，利於產業化。
【專利說明】抗類風溼關節炎的小肽基因及其生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抗類風溼關節炎的小肽的重組發酵生產，以及純化方法。
【背景技術】
[0002] 類風溼性關節炎是一種慢性反覆發作的以全身關節炎症改變為主的疼痛性疾病， 英文名稱Rheumatoid arthritis,簡寫RA,是一種常見病、多發病。發病時間可以持續幾 天、幾周或幾個月，並帶有不同程度的活動性，嚴重者病人生活不能自理，往往累及終生，形 成長期病痛，極大地危害著人類的生命和健康，人們期望能研發和生產出更多高效優質的 藥物在臨床應用。
[0003] 現在應用的RA治療藥物有抗炎藥，如阿司匹林、皮質類固醇和通過抑制或消滅機 體免疫反應而減輕疾病症狀的藥物，這些藥物雖可改善症狀，但不能去除風溼的基本病理 改變，而且還存在減弱機體的抗病能力的危害。
[0004] DNAJPl是一個通過計算機輔助設計技術開發的新藥多肽，它起源於熱休克蛋白 dnaj.，在該蛋白的基礎上通過合成法得到的。熱休克蛋白細胞在經受諸如發炎、自身免疫 性疾病如類風溼性關節炎的情況下會產生熱休克蛋白。dnaJPl的作用機制在於通過調節 T細胞的功能來減少發炎、增強調控免疫系統，使得由類風溼性關節炎引起的炎症反應受到 抑制，美國160例二期臨床實驗表明，口服該多肽可以降低炎症反應，取得了良好的效果。
[0005] 抗類風溼關節炎的小肽dnaJPl與傳統的治療類風溼關節炎物相比，具有無可比 擬的優勢。該藥物不會對患者的免疫系統產生抑制，通過口服應用dnaJPl，因為腸內的黏膜 免疫系統可以對患者的免疫系統進行重新馴化，從而有效改善免疫系統。通過模擬反應，幫 助患者免疫系統重新識別自身物質和外源抗原，保護原來深受破壞的病灶得以恢復，症狀 得到緩解，通過使得患者的免疫系統耐受dnaj而起到治療作用，具有安全性高、作用直接 迅速、易被人體吸收、特異性高、持續時間長、可口服等優點，具有極為誘人的廣闊前景。
[0006] 現有的抗類風溼關節炎的小肽dnaJPl的純化方法為化學合成法。美國發明專利 US5773570A，該技術利用聚合鏈式反應（PCR)從業和重組的噬菌體質粒包含dnaK和dnaj中 擴增了含有dnaj基因的片段，然後將該片段亞克隆到PCG808fX的Xbal位點，作為麥芽糖 結合融合蛋白進行表達，然後用含有針對該融合蛋白的兔抗血清將用PUC19質粒進行表達 的rdnaj進行純化，最後，用固定化的蛋白A，將IgG-MBL-DnaJ進行純化，然後用pH2. 5的 甘氨酸緩衝液進行洗脫出來，SDS電泳結果表明只有一條帶，融合蛋白符合預期，分子量在 41KD。該專利採用了融合蛋白和目的多肽融合生產的方法，融合標籤本身的分子量為40KD， 而目的多肽的分子量僅有1.76KD，相差20多倍，也就是說即使產生大量的融合蛋白，其實 含有目的蛋白的產量很低（佔總蛋白含量的4%)，造成不必要的浪費，不利於大規模生產。 另外他純化出來的是融合蛋白（41KD)，而不是真正的dnaJPl多肽（I. 76KD)。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是：抗類風溼關節炎的小肽dnaJPl是由幾個胺基酸組 成的短肽，而要實現短肽直接在宿主菌中的表達並分離出來非常困難，而採取融合表達方 式也因採用較大的融合標籤和較低的抗炎基因拷貝導致表達量很低。本發明構建具有合適 高拷貝數的基因，通過將其基因進行6個重複串聯的方法來增加產量，並採用較小的融合 標籤來融合表達該基因已增加在表達產物中的相對比重，對實現抗類風溼關節炎小肽的高 效表達，相對比重約為50%，由於生成的融合蛋白是包涵體，所以非常容易純化，純化後的包 涵體蛋白，採用溴化氰裂解，專一性強，成本低，本發明採用高壓裂解的方法清除溴化氰，成 本低，汙染小，操作簡單，易於產業化。
[0008] 本發明的技術方案為：一種抗類風溼關節炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 所述的抗類風溼關節炎的小肽基因，核苷酸序列所編碼的多肽如SEQ ID NO :2所 /Jn 〇
[0010] 所述的表達抗類風溼關節炎的小肽基因的多肽串聯生產方法，利用大腸桿菌的 pET31b(+)表達體系，將SEQ ID N0:1基因序列亞克隆到質粒pET31b(+)融合標籤KSI的 基因序列的後面，限制性內切酶為AwnI，然後將亞克隆得到的轉化進大腸桿菌BL21 (DE3) PlysS中進行表達，並進行發酵生產，得到的菌體通過低溫高壓裂解得到包涵體，洗滌後的 包涵體利用溴化氰（CNBr)或者蛋氨酸裂解酶進行裂解成單個多肽，裂解完畢後加鹼水猝 滅反應，採用高溫高壓水解法，除去溴化氰等雜質，通過納濾除鹽，得到純品。
[0011] 所述的表達抗類風溼關節炎的小肽基因的多肽串聯生產方法，所述高溫高壓水解 法的條件為，103. 4kPa，I. 05kg/cm2,在溫度121. 3° C的條件下處理15?20分鐘。
[0012] 本發明的有益效果是：本發明利用基因重組的方法來生產DNAJPl的衍生物 M-DNAJPl，人工構建dnaJPl的基因，並通過首尾相連中間添加蛋氨酸的方法進行串聯形成 如下方式：M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl，將其克隆到 質粒pet31b(+)中，然後轉化進大腸桿菌中進行表達得到DNAJPl修飾後的多肽：M-DNAJP1 的重複序列如SEQ ID NO :2所示。通過發酵製備該小肽，然後利用溴化氰裂解的方法來得 到游離多肽，裂解後的溴化氰通過高溫高壓處理，生成氨水和甲酸鈉，減少對環境的汙染， 整個過程成本低，產量高，純化簡單，利於產業化。
[0013] 本發明利用pet-31 (b+)上較小的His標籤片段融合表達串聯6次目的小肽，增加 了表達出來的重組蛋白中目的多肽所佔的比例（?50%)，形成融合蛋白包涵體，以減少表 達蛋白的細胞毒性，大大增加了表達效率和減小了小肽的分離難度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1為工程菌發酵表達中5升小試實驗結果； 圖2為中試50升發酵過程中生長曲線； 圖3為發酵SDS-PAGE ; 圖4為菌體經過低溫高壓破碎後的樣品電泳圖； 圖5為包涵體洗漆後產物電泳圖； 圖6為小肽溴化氰裂解電泳圖； 圖7為小肽MALDI-T0F/T0F質譜聯機檢測圖。
【具體實施方式】
[0015] 工程菌的構建： 內容包括根據密碼子偏愛性設計序列、合成全基因序列、利用Alwn I酶切質粒，導入 目的序列，構建了以以pet-31(b+)為表達載體的、大腸桿菌BL21(DE3) pLysS為宿主菌的 MDNAJP1融合表達系統。6個重複的MDNAJP1的胺基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性。 確定基因序列如SEQ ID NO :1所不。
[0016] 基因序列由本實驗室自己合成。將質粒用AlwnI內切酶切開，將目的基因片段進 行亞克隆，連接到質粒中去，然後轉化到大腸桿菌中，宿主菌和表達載體均購自Novagen 公司。工程菌構建完成後，經表達質粒酶切鑑定、目的片段DNA測序鑑定，結果表明工程菌 構建正確。
[0017] 工程菌發酵表達 構建了工程菌株後，基因重組大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS劃線接種於含氨苄青黴素 (80ug/ml)的LB固體平板上，首先進行小試表達：搖瓶培養，然後進行了 5升發酵罐培養。 以便對種子培養基、接種濃度進行摸索。
[0018] 5升小試實驗結果如圖1所示。從左至右點樣順序為：二級種、0hr、3 hr、5 hr(誘 導 0hr)、MARK、8 hr (誘導 3hr)、ll hr (誘導 6hr)、17 hr (誘導 12hr)、20 h (誘導 15hr) 最終確定工藝步驟如下： 一級、二級種子培養基為LB，發酵培養基為TB (修改版)，接種前Amp濃度為lOOPg/mL 本項目碳源為甘油，因為其做碳源產生更少的雜質蛋白。
[0019] 中試50升發酵過程： 一發酵過程 (1) 將基因重組大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS劃線接種於含氨苄青黴素（80ug/ml)的LB 固體平板上，置37°C恆溫箱倒置培養12h ; (2) 挑取平板上的大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS 接種到20ml含氨苄青黴素（80ug/ml)的LB培養基中，37°C下200rpm. min - 1振蕩培 養8h至對數生長期，將上述培養液20ml接種於200ml含氨苄青黴素（80ug/ml)的LB培養 基中，37?下220rpm. min - 1振蕩培養4h，得到發酵種子液； (3) 發酵罐空消後，校正pH電極、溶氧電極，倒入溶解好的TB培養基，按發酵罐滅菌操 作進行滅菌（121°C，30min)，待料液溫度降至37°C時，加入準備好的氨苄青黴素（80ug/ml) 和葡萄糖（3%)，按10%比例接進種子液，控制溫度37°C、溶氧30%以上，用氨水調節pH7. 0， 攪拌速率和通氣量調節由溶氧濃度決定。當發酵液中菌密度達到0D600值為15時加入誘 導劑IPTG達0. 2mM，繼續培養10 - 16h左右，最終OD約42。
[0020] 表1發酵記錄
【權利要求】
1. 一種抗類風溼關節炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 如權利要求1所述的抗類風溼關節炎的小肽基因，核苷酸序列所編碼的多肽如SEQ ID NO :2 所示。
3. 如權利要求2所述的表達抗類風溼關節炎的小肽基因的多肽串聯生產方法，其特 徵在於：利用大腸桿菌的pET31b(+)表達體系，將SEQ ID NO :1基因序列亞克隆到質粒 pET31b(+)融合標籤KSI的基因序列的後面，限制性內切酶為AwnI，然後將亞克隆得到的轉 化進大腸桿菌BL21 (DE3)plysS中進行表達，並進行發酵生產，得到的菌體通過低溫高壓裂 解得到包涵體，洗滌後的包涵體利用溴化氰（CNBr)或者蛋氨酸裂解酶進行裂解成單個多 肽，裂解完畢後加鹼水猝滅反應，採用高溫高壓水解法，除去溴化氰等雜質，通過納濾除鹽， 得到純品。
4. 如權利要求3所述的表達抗類風溼關節炎的小肽基因的多肽串聯生產方法，其特徵 在於：所述高溫高壓水解法的條件為，103. 4kPa，I. 05kg/cm2,在溫度121. 3° C的條件下處 理15?20分鐘。
【文檔編號】C12N15/70GK104313028SQ201410521516
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】李相魯, 張嚴冬, 孟建軍, 梁莊嚴 申請人:北京生科東方科技有限公司