Cacna1e突變基因及其檢測方法和應用的製作方法

2023-07-28 04:30:51 1

Cacna1e突變基因及其檢測方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的方法，該方法為全基因組深度測序法或毛細管電泳測序法。本發明還提供了CACNA1E突變基因。進一步地，本發明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的試劑盒以及上述試劑盒在肺癌的預防、檢測和/或治療中的應用。本發明還提供了上述突變基因和檢測方法在肺癌的預防、檢測和/或治療中的應用。通過全基因組測序及基於特異性PCR反應，在肺癌病人樣本中發現了基因CACNA1E突變位點，通過檢測其突變可為臨床治療、用藥提供分子分型、治療靶點等理論基礎，為預防及治療腫瘤提供新的思路。
【專利說明】CACNA1E突變基因及其檢測方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於腫瘤生物學領域，具體涉及一種CACNA1E突變基因的檢測方法及其突 變基因。進一步地，涉及檢測上述突變基因的試劑盒以及該試劑盒的應用。另外，本發明還 涉及檢測方法、基因和/或試劑盒在肺癌的預防、檢測和/或治療中的應用。

【背景技術】
[0002] 癌基因是一類能誘發癌症的基因。癌症的發生往往與癌基因的異常表達及其活化 相關。在腫瘤組織樣本中，與之相關的癌基因普遍高表達，同時這些癌基因突變後導致其活 性大大增強。以表皮生長因子受體（EGFR)為例，在肺癌腫瘤樣本中，EGFR的高表達導致了 PI3K-AKT信號通路異常激活，從而導致了細胞異常增生。結合臨床資料分析，EGFR突變導 致病人對藥物（吉非替尼等）產生敏感性，如發生在EGFR第21號外顯子（L858R)及第19 號外顯子的突變使得病人對吉非替尼敏感。另一方面，在臨床治療過程中，病人逐漸產生耐 藥性。進一步研究顯示，這種耐藥性的產生是由於EGFR第20號外顯子發生突變（T790M) 而導致的。針對於此，在肺癌患者進行臨床治療前，對其EGFR突變篩查已成為臨床及個性 化治療的常規手段，並已取得較好的效果。由此可見，針對相關癌基因突變檢測對於預防 及治療癌症尤其是肺癌意義重大。但是由於EGFR等其他癌基因的突變在肺癌病人中只佔 30% -50%，還有一大部分病人的發病機理並不清楚，因此，應用新技術發現癌基因並檢測 其突變顯得迫在眉睫。
[0003] 隨著人類全基因組測序工作的完成以及測序技術的不斷革新，全基因組測序已經 逐漸成為腫瘤基因組研究的有利武器。Ca 2+離子作為細胞內必不可少的第二信使參與了許 多重要的生理、生化過程。而鈣離子通道蛋白在調節鈣離子的過程中起著至關重要的作用。 近幾年研究發現，腫瘤的發生、發展與鈣相關蛋白有著密切的聯繫，例如，基因 CACNA2D1能 夠維持肝癌細胞的腫瘤幹細胞特點。
[0004] 基因 CACNA1E是鈣離子通道蛋白的a IE亞基。它有3個轉錄本，這三個轉錄本編 碼的蛋白分別由225U2270及2313個胺基酸組成。之前有報導，CACNA1E基因在腎母細胞 瘤中呈高拷貝狀態，其mRNA及蛋白均高表達，且這種高表達與腎母細胞瘤的復發正相關。 但是，截止目前，基因 CACNA1E在其他腫瘤中表達情況並不清楚，其在腫瘤樣本中的突變與 腫瘤的關係也並未報導。因此，研究CACNA1E在腫瘤中的表達與腫瘤的關係以及檢測其突 變及突變與腫瘤的關係對發現新的癌基因、預防及治療腫瘤意義重大。


【發明內容】

[0005] 發明人使用全基因組測序技術，對來自中國多環芳烴汙染嚴重的肺癌高發地區的 14個病人的癌及癌旁組織進行了深度測序，數據分析發現，鈣離子信號通路及鈣離子通道 蛋白在這些病人體內發生了大量突變。在全基因組測序結果中，鈣離子通道蛋白突變不僅 得到富集而且有著很高的突變頻率，尤其是基因 CACNA1E。
[0006] 進一步地，發明人針對基因 CACNA1E的每一個外顯子序列特點，設計每一個外顯 子的特異性引物，通過聚合酶鏈式反應（PCR)，在164例病人標本以及5個細胞系（L78細胞 系、％D細胞系、Hela細胞系、NCI-H1975細胞系及XLA-07細胞系）中將CACNA1E的所有外 顯子擴增出來，並通過毛細管電泳測序找出引起CACNA1E胺基酸改變的突變。結果發現，在 164例病人中共發現16例病人發生突變，其中在宣威/富源地區的79例病人中，有15例發 生突變，突變頻率達到19% ;在廣州及雲南非宣威/富源地區的85例病人中只有1例病人 發生突變，突變頻率為1. 2%。
[0007] 本發明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的方法，該方法為全基因組深度測序法 或毛細管電泳測序法。
[0008] 本發明還提供了 CACNA1E突變基因。
[0009] 本發明進一步提供了一種檢測CACNA1E突變基因的試劑盒以及上述試劑盒在肺 癌的預防、檢測和/或治療中的應用。
[0010] 本發明還提供了上述突變基因和檢測方法在肺癌的預防、檢測和/或治療中的應 用。
[0011] 根據本發明的一方面，本發明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的方法，所述方 法為全基因組深度測序法或毛細管電泳測序法。
[0012] 優選地，所述方法為毛細管電泳測序法，所述方法包括以下步驟：
[0013] 1)對CACNA1E基因的每個外顯子設計特異性PCR引物，並進行PCR擴增；
[0014] 優選地，所述PCR產物大小控制在400-1200bp之間；
[0015] 優選地，所述PCR引物的序列如SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:92所示；
[0016] 2)PCR產物純化後毛細管電泳測序檢測，將得到的序列與UCSC網站中的CACNA1E 的基因序列（GRCh37/hgl9)比較，從而確定CACNA1E基因的突變位點；
[0017] 3)將得到的PCR產物按照正常的讀碼框進行翻譯，以確定CACNA1E的突變位點。
[0018] 優選地，所述核苷酸突變位點至少具有以下的一種或多種：c. C356A、c. C507T、 C. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、 c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、 c. C5825A、c. G6037T、c. C6871A、c. C6862A、c. G6865T。進一步優選地，所述突變位點還位於 c. A6515G、c. C253A。
[0019] 再一方面，本發明提供了一種CACNA1E突變基因，其中所述CACNA1E突變基因的核 苷酸序列至少一個突變位點位於 c. C356A、c. C507T、c. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、 c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、 c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、c. C5825A、c. G6037T、c. C6871A、c. C6862A、 c. G6865T、c. A6515G、c.C253A。
[0020] 優選地，所述CACNA1E突變基因的編碼蛋白質序列至少一個胺基酸突變位點位 於 P. P119H、P. L169F、P. H179N、P. R249L、P. A275S、P. G352W、P. E391D、P. D426Y、P. G546V、 P. R772L、p. E795D、p. S851I、p. R925S、p. L1013Q、p. K1327N、p. E1435K、p. W1665L、p. A1870S、 p. S1942Y、p. D2013Y、p. Ρ2291Τ、ρ· R2288S、p. G2289W。進一步優選地，所述突變位點還位於 P. Y2172C、p. L85I。
[0021] 本申請中所有的突變命名是基於國際上突變的命名原則，包含了三部分，突變前 胺基酸-突變的胺基酸位置-突變後胺基酸，如A275S，即突變導致了第275個胺基酸由突 變前的丙氨酸（A)變成了突變後的絲氨酸（S)，核苷酸突變同理。
[0022] 本發明還提供了一種檢測CACNA1E突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括用於擴增 CACNA1E突變位點的引物，優選地，所述試劑盒包括SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的引 物。
[0023] 優選地，所述試劑盒還包括常用的PCR組分，例如PCR擴增酶以及相應的緩衝液。
[0024] 需要說明的是，試劑盒中的引物可以根據已知的胺基酸序列設計，這是本領域的 常規技術手段。
[0025] 本發明提供的試劑盒的具體使用方法如下所示：
[0026] I) CACNA1E各外顯子特異性PCR引物的設計：
[0027] 運用軟體Primer5設計CACNA1E 48個外顯子的特異性引物，共46對引物；設計引 物時，將產物大小控制在400-1200bp之間，並通過NCBI blast功能blast結果為單一性， 在本發明的一個優選的實施方案中，所述引物如表1所不。
[0028] 2) PCR產物擴增：
[0029] PCR反應體系為20 μ 1，模板DNA用量為10ng。
[0030] PCR程序為95°C，5分鐘，95°C，30秒，60°C，45秒，72°C，1分鐘，35個循環，最後 72 °C延伸10分鐘。
[0031] 3)PCR產物進行毛細管電泳測序，將得到的序列與CACNA1E的基因序列比較，從而 判斷是否存在突變位點。
[0032] 另外，也可以直接針對某個或某些突變位點設計引物，例如引物可以為SEQ ID NO: I-SEQ ID NO:92所示的序列中的一種或多種。
[0033] 由於上述試劑盒可以檢測到CACNA1E基因的突變情況，而CACNA1E基因在肺癌病 人，尤其是中國多環芳烴汙染嚴重的肺癌高發地區及細胞系中具有較高的突變率，因此該 試劑盒可以應用到肺癌的預防、檢測和/或治療中。
[0034] 同樣地，本發明提供的CACNA1E突變基因和檢測方法也可以應用到肺癌的預防、 檢測和/或治療中的應用。例如，由於本發明發現了在中國多環芳烴汙染嚴重地區的肺癌 中基因 CACNA1E發生了突變，並通過一系列實驗證實了基因 CACNA1E與肺癌發生相關，因此 基因 CACNA1E及其突變位點可以作為肺癌的治療靶點。
[0035] 優選地，可以通過siRNA幹擾技術，幹擾掉CACNA1E，從而達到降低腫瘤的成瘤能 力或者抑制腫瘤生長的目的，用於治療和/或預防肺癌。
[0036] 因此，本發明還提供了一種siRNA的組合，所述siRNA為用於幹擾CACNA1E表達的 特異性siRNA。優選地，所述siRNA的序列為
[0037] SEQ ID N0:93 :5, -CCUCCGGCUUCUAAGAAUA-3, ；（CACNA1E 幹擾 1)
[0038] SEQ ID N0:94 :5, -CGCCAUUUGAGUACAUGAU-3，。（CACNA1E 幹擾 2)
[0039] 本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含上述siRNA序列。所述試劑盒中還 包括PCR擴增酶及相應緩衝液。
[0040] 本發明提供還提供了上述試劑盒的使用方法，優選地，所述方法為二次幹擾法。
[0041] 在一個優選的實施方案中，所述二次幹擾法是通過包括以下步驟的方法實現的：
[0042] a.將受試者的細胞接種於6孔板，接種密度為IX IO5個細胞/孔，並使用培養基 培養；
[0043] 優選地，所述培養基為含10 % FBS的RPMI1640/DMEM培養基；
[0044] b. -天后，吸掉培養基，加入800 μ I Opti-MEM培養基；
[0045] c.將轉染試劑 Hyperfect 2000 及 2. 5 μ I siRNA (20 μ Μ)加入到含 200 μ 1 Opti-MEM的RNase free的管子中，漩渦振蕩混勻，室溫靜止10-15分鐘；
[0046] d.將混和液加入到6孔板中，細胞培養箱中培養6小時左右；
[0047] e. 6小時後，用新鮮培養基代替轉染液；
[0048] f.第三天重複步驟a-e。
[0049] 由於上述試劑盒可以幹擾CACNA1E突變基因的表達，從而抑制細胞的增殖、克隆 形成、成瘤能力，並使細胞內的鈣離子濃度以及細胞內磷酸化EGFR、ERK、AKT也隨之下降， 因此該試劑盒可以應用到肺癌的預防、檢測和/或治療中。
[0050] 本發明為檢測癌基因 CACNA1E突變提供了理論基礎，設計了檢測突變的特異性 引物。在此基礎上，本發明通過全基因組測序及PCR、毛細管電泳測序等方法公開了基因 CACNA1E在肺癌病人尤其是中國多環芳烴汙染嚴重的肺癌高發地區及細胞系中的突變情 況。除此之外，本發明通過幹擾的方式初步揭示了癌基因 CACNA1E在肺癌發病中的作用。發 明人發現，在帶CACNA1E突變的細胞中幹擾CACNA1E後，細胞的增殖、克隆形成、成瘤能力皆 受到抑制，細胞內的鈣離子濃度以及細胞內磷酸化EGFR、ERK、AKT也隨之下降。
[0051] 本發明適用於檢測癌基因 CACNA1E的突變，包括病人來源的腫瘤組織及細胞系。 通過檢測其突變可為臨床治療、用藥提供分子分型、治療靶點等理論基礎，為預防及治療腫 瘤提供新的思路。
[0052] 通過全基因組測序及基於特異性PCR反應在肺癌病人樣本中發現了基因 CACNA1E 突變位點，這些突變位點在肺癌預防、診斷及治療過程中的作用。設計針對CACNA1E的特異 性小核酸RNA幹擾序列（siRNA)，通過幹擾的方式在CACNA1E突變以及野生型的細胞中將蛋 白CACNA1E幹擾掉，檢測細胞增殖，克隆形成能力、鈣信號變化以及下遊信號通路的變化。 結果顯示，在CACNA1E突變的細胞中，幹擾CACNA1E後能明顯抑制細胞的增殖以及克隆形成 能力，並能導致細胞內鈣離子濃度降低。同時，檢測其下遊信號通路發現，在帶CACNA1E突 變的細胞中，幹擾CACNA1E，磷酸化的EGFR、ERK、AKT都下調。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0054] 圖1為肺癌病人樣本及細胞系中CACNA1E蛋白突變的結構示意圖；其中圖A為肺 癌病人樣本中CACNA1E蛋白突變的結構示意圖；其中圖B為肺癌細胞系（XLA-07)和Hela 細胞中CACNA1E蛋白突變的結構示意圖；
[0055] 圖2在基因 CACNA1E發生突變的Hela細胞及肺癌細胞XLA-07中，幹擾CACNA1E 後細胞增殖、克隆形成及相關信號通路變化；其中，A為Hela及XLA-07細胞幹擾CACNA1E 後，增殖能力受到抑制；B為Hela細胞幹擾CACNA1E後克隆形成能力受到抑制；C為Hela及 XLA-07細胞幹擾CACNA1E後，磷酸化EGFR、磷酸化AKT及磷酸化ERK下調；
[0056] 圖3為基因 CACNA1E發生突變的Hela細胞及肺癌細胞XLA-07中，幹擾CACNA1E 後細胞內鈣離子濃度降低；其中，橫坐標表示螢光強度，細胞內鈣離子濃度越高，螢光越強； 縱坐標是發射螢光的細胞比例；如圖中所示，對照組中的細胞螢光強度要高於CACNA1E幹 擾後的細胞，即CACNA1E幹擾後，細胞內鈣離子濃度降低；
[0057] 圖4為基因 CACNA1E發生突變的Hela細胞中，幹擾CACNA1E後，細胞成瘤能力受 到抑制。其中，圖A是在荷瘤的不同時間點測量腫瘤的體積，對照組中的瘤子體積明顯大於 CACNA1E幹擾後的瘤子體積；圖B是處死老鼠後將瘤子剝離下來後的瘤子照片；圖C是老鼠 處死時的荷瘤照片。

【具體實施方式】
[0058] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。
[0059] 除非特別指明，以下實施例中採用的Hela細胞系購自協和細胞庫；XLA-07細胞系 購自中國科學院昆明動物所；L78細胞系購自中國科學院上海細胞庫、％D細胞系購自中國 科學院上海細胞庫、NCI-H1975細胞系購自ATCC ;
[0060] 除非特別指明，以下實施例中採用的裸鼠為Nude mouse，購自北京大學醫學部。
[0061] 除非特別指明，以下實施例中所用的試驗方法均為本領域中所用的常規方法。
[0062] 除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規渠道商 購獲得。
[0063] 實施例1CACNA1E引物設計
[0064] CACNA1E為R型電壓門依賴性鈣離子通道蛋白α亞基1E，屬於細胞膜表面蛋白， 調控鈣離子的細胞內入。同時還參與了多種鈣離子依賴性的細胞生理生化反應，如肌肉收 縮、神經遞質的傳遞、基因表達調控、細胞運動、細胞分裂以及細胞死亡等。該基因目前發現 有三個轉錄本，其最長的轉錄本為ΝΜ_001205293. 1，包含48個外顯子，編碼2313個胺基酸。 其蛋白結構包含了三個I〇n_trans結構域、一個Ca_chan_IQ結構域和一個PKD_Channel結 構域。登陸UCSC網站下載CACNA1E的基因序列，通過軟體Primer 5設計CACNA1E每一個 外顯子的特異性引物，將產物大小控制在400-1200bp之間，並通過NCBI blast功能blast 結果為單一性，具體的引物序列如表1所示。
[0065] 表I. CACNA1E外顯子特異性引物序列
[0066]

【權利要求】
1. 一種CACNA1E突變基因，其中所述CACNA1E突變基因的至少一個突變位點位於 c. C356A、c. C507T、c. C535A、c. G746T、c. G823T、c.G1054T、c.G1173T、c.G1276T、c.G1637T、 c. G2315T、c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、 c. G5608T、c. C5825A、c. G6037T、c.C6871A、c.C6862A、c.G6865T、c. A6515G、c. C253A ; 優選地，所述突變位點還位於c. A6515G，其中所述CACNA1E突變基因為Hela細胞系中 的突變基因； 優選地，所述突變位點還位於c. C356A，其中所述CACNA1E突變基因為LXA-07細胞系中 的突變基因。
2. -種檢測如權利要求1所述的CACNA1E突變基因的方法，所述方法通過全基因組深 度測序法或毛細管電泳測序法確定突變基因。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中，所述突變位點定位於Ion_trans結構域、PKD_ Channel結構域、Ca_chan_IQ結構域和/或其它他非功能區； 優選地，所述核苷酸突變位點至少具有以下的一種或多種：c. C356A、c. C507T、 c. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、 c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、 c. C5825A, c. G6037T, c. C6871A,c. C6862A,c.G6865T,c.A6515G,c.C253A ； 進一步優選地，所述突變位點還位於c. A6515G、c. C253A。
4. 根據權利要求2或3所述的方法，其中，所述方法通過毛細管電泳測序法確定突變基 因，包括以下步驟： 1) 對CACNA1E基因的每個外顯子設計特異性PCR引物，並進行PCR擴增； 優選地，所述PCR產物大小控制在400-1200bp之間； 優選地，所述PCR引物的序列如SEQIDN0:1-SEQIDN0:92所示； 2. PCR產物純化後毛細管電泳測序檢測，將得到的序列與UCSC網站中的CACNA1E的基 因序列（GRCh37/hgl9)比較，從而確定CACNA1E基因的突變位點； 優選地，所述方法還包括將得到的PCR產物按照正常的讀碼框進行翻譯，以確定 CACNA1E的突變位點。
5. -種用於檢測如權利要求1所述的CACNA1E突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括用 於擴增CACNA1E突變位點的引物； 優選地，所述試劑盒還包括PCR擴增酶、緩衝液、酶切不同突變位點的相應的限制性內 切酶； 優選地，所述PCR引物的序列選自SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的序列中的一種或 多種。
6. -種用於幹擾如權利要求1所述的CACNA1E突變基因表達的siRNA的組合； 優選地，所述siRNA的序列為 SEQ ID N0:93 :5' -CCUCCGGCUUCUAAGAAUA-3' ；（CACNA1E 幹擾 1) SEQ ID N0:94:5'-CGCCAUUUGAGUACAUGAU-3'（CACNA1E 幹擾 2)。
7. -種用於幹擾如權利要求1所述的CACNA1E突變基因表達的試劑盒，所述試劑盒包 括如權利要求6所述的siRNA序列； 優選地，所述試劑盒中還包括PCR擴增酶及相應緩衝液。
8. 如權利要求7所述的試劑盒的使用方法，所述方法為二次幹擾法； 優選地，所述二次幹擾法是通過包括以下步驟的方法實現的： a. 將受試者的細胞接種於6孔板，，接種密度為1 X 105個細胞/孔，並使用培養基培養 優選地，所述培養基為含10% FBS的RPMI1640/DMEM培養基； b. -天后，吸掉培養基，加入800μ1 Opti-MEM培養基； c. 將轉染試劑 Hyperfect 2000 及 2. 5 μ 1 siRNA(20 μ M)加入到含 200 μ 1 Opti-MEM 的RNase free的管子中，漩潤振蕩混勻，室溫靜止10-15分鐘； d. 將混和液加入到6孔板中，細胞培養箱中培養6小時左右； e. 6小時後，用新鮮培養基代替轉染液； f. 第二天重複步驟a_e。
9. 一組用於擴增如權利要求1所述的CACNA1E突變基因的引物和/或用於幹擾如權利 要求1所述的CACNA1E突變基因的SiRNA在製備用於預防、檢測和/或治療肺癌的藥物或 試劑盒中的用途； 優選地，所述試劑盒還包括PCR擴增酶、緩衝液、酶切不同突變位點的相應的限制性內 切酶； 優選地，所述引物選自SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的序列中的一種或多種 優選地，所述siRNA為SEQ ID NO:93和/或94。
【文檔編號】A61P35/00GK104293796SQ201410524704
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月8日 優先權日:2014年10月8日
【發明者】周光飈, 吳黎川, 程昕 申請人:中國科學院動物研究所