犬狂犬病病毒np-elisa抗體檢測試劑盒的製作方法

2023-07-29 00:42:11

專利名稱：犬狂犬病病毒np-elisa抗體檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種動物病毒抗體的快速診斷方法和器具，具體是一種
犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患的急性高度致死性傳染病，主要侵害中樞神經系 統，導致急性、進行性、幾乎不可逆性的致死性腦脊髓炎，是當前世界上流行最廣、危害最 嚴重的人獸共患傳染病。狂犬病是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病之一，無特效的治 療藥物，病死率幾乎100%，狂犬病主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發展中國家，除英 國、紐西蘭、日本和中國臺灣省外，其它國家和地區均有發生。全世界每年約有5.5萬人死 於狂犬病，其中90%以上存在亞洲和非洲，每年造成的經濟損失高達5.83億美元。我國是 世界上受狂犬病危害最為嚴重的國家之一，每年狂犬病發病和死亡人數位於印度之後，居世 界第二位。近幾年我國人狂犬病發病數和死亡數呈持續上升趨勢，穩居我國法定報告傳染病 發病總數和死亡總數之第二位，病死率和死亡率則位居各法定報告傳染病首位，每年約 1000-1200萬人接受狂犬病暴露後接種。狂犬病是一種自然疫源性疾病，人和各種溫血動物 均可感染，感染極為廣泛，包括狐、狼、鼠、垸熊、貓、蝙蝠、兔、牛、羊、馬、犬等動物， 以肉食目的犬科和貓科動物最為易感，人對狂犬病中度敏感。流行病學調查表明，95%以上 的人狂犬病病例是與患病或帶毒的犬和貓通過直接或間接接觸引起的，犬、貓等動物是狂犬 病毒的主要儲存宿主和傳播宿主。因此，加強犬、貓狂犬病的防控對於有效地遏制人狂犬病 是十分必要的，其中對狂犬病流行地區的犬、貓等動物施行強制免疫接種與免疫後抗體效價 監測相結合，及對疑似帶毒動物進行病原檢測等則是防控措施的重要環節。
目前，用於狂犬病病毒抗原和血清抗體檢測的方法主要有螢光抗體試驗(FAT)、小鼠中 和試驗(MNT)、快速螢光灶抑制試驗(RFFIT)、螢光抗體病毒中和試驗(FAVNT)、酶聯免疫吸 附試驗(ELISA)等，但這些方法均為全病毒抗原，在樣本檢測和評價時具有一定的危險性， 在一定程度上限制了它們的應用。因此，研製開發適用於犬狂犬病病毒抗體檢測的特異的、 敏感的、生物安全度高的、適合於基層使用的診斷檢測的器具，對犬狂犬病免疫水平進行實 時監控和建立科學、靈活的狂犬病的免疫程序，以及對疫病的預防和控制有重要意義

發明內容
本發明的目的是提供一種犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒。 本發明的目的是這樣實現的採用原核表達的狂犬病病毒核蛋白NP作為抗原包被可拆96孔酶標板，以辣根過氧化物酶標記抗犬IgG單克隆抗體製備酶結合物工作液，以間接ELISA 法直接檢測犬血清中的狂犬病病毒抗體。具體如下
本發明的犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒內設有NP抗體檢測板，酶結合物工 作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，10x濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液， NP抗體檢測板為包被狂犬病病毒核蛋白NP的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液為辣根過 氧化物酶標記抗犬IgG單克隆抗體，陽性對照為犬狂犬病標準陽性血清，陰性對照為犬標準 陰性血清。
狂犬病病毒核蛋白NP為利用原核高效表達系統表達和純化的基因工程重組蛋白，可與 狂犬病病毒核蛋白NP抗體特異結合。它的製備為利用RT-PCR技術擴增狂犬病病毒ERA 活疫苗(國產商品化產品)的1350bpNP基因片段，將其插入到原核表達載體pET-28a(Novagen 公司商品化產品)的下遊構建pET-NP重組表達質粒，以氯化鈣法轉化大腸桿菌BL21(DE3)， 經O.OlmM IPTG誘導表達6h，用超聲波裂解表達菌體，NP重組蛋白經Ni-NTA親和層析柱 純化獲得，純化的NP蛋白用於犬狂犬病病毒抗體檢測。
抗體檢測板的最佳製備條件為用pH&5的0.05M Tris-HCl緩衝液作包被液，將狂犬病 病毒核蛋白NP稀釋為2pg/ml，按100^1/孔加入聚苯乙烯微孔板中，即包被量為200ng/孔， 37。C2小時，再4。C包被過夜，甩幹，按200nl/孔加入含1。/。牛血清白蛋白(BSA)， pH7.4的磷 酸鹽緩衝液37t:封閉2小時，洗滌甩幹，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時，置 乾燥室乾燥後，裝入含千燥劑的包裝袋中保存。
酶結合物工作液的製備過程為
(1) 用超純水配製辣根過氧化物酶(HRP， R^3.0)溶液，加入0.06M過碘酸鈉溶液4'C避光 l小時，加入160mM乙二醇，室溫反應30分鐘，加入pH4.4的醋酸緩衝液2-8。C透析過夜，
換液兩次；
(2) 將純化的抗犬IgG單克隆抗體加入上述活化的酶中，轉移至透析袋，於0.05mMpH9.6 的碳酸緩衝液中透析，4'C攪拌過夜，換液兩次；
(3) 透析液吸至離心管中，加現配的0.05M硼氫化鈉溶液，4'C反應2小時，加入等量的 飽和硫酸銨溶液4"放置30分鐘，4'C4000rpm離心20分鐘，棄上清，瀝乾，將瀝乾的沉澱溶 於少量PBS，裝入透析袋中，對0.02MPBS(pH7.4)透析，4'C過夜；
(4) 收集透析袋中液體，4000rpm離心20分鐘，上清液即為辣根過氧化物酶標記的抗犬 IgG單克隆抗體，將其與等量甘油混和，-20"凍存，以含0."/。BSA， 0.05%吐溫-20， 0.01% 硫柳汞，pH7.4的磷酸緩衝液按1:200-5000稀釋凍存的辣根過氧化物酶標記的羊抗犬IgG多 克隆抗體作為酶結合物工作液。
本發明犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒中，樣品稀釋液為含0.1%BSA的0.01M 磷酸鹽緩衝液(pH7.4); 10x濃縮洗滌液為含0.5。/。吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4);顯色 液A為0.2mg/ml的四甲基聯苯胺(TMB)溶液，顯色液B為含0.5%。過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩衝液；終止液為2M硫酸溶液；陽性對照為經用狂犬病病毒ERA疫苗免疫獲得的犬 狂犬病病毒標準陽性血清(OD45c^l.00)加入少量紅色顏料並按1000U/ml加入青黴素和鏈黴 素，無菌過濾；陰性對照為經篩選獲得的犬標準陰性血清(OD45^0.150)，按1000U/ml加入青黴素和鏈黴素，無菌過濾。
本發明犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒，其檢測程序為(l)將10x濃縮洗滌液 稀釋10倍即為洗滌液；(2)將待檢血清用樣品稀釋液作1:100稀釋，按100^1/孔加入抗體檢測 板中，同時設只加100^1樣品稀釋液的空白、犬標準陰性血清作為陰性對照、犬狂犬病陽性 血清作為陽性對照，37'c孵育60分鐘，甩幹；(3)每孔加洗漆液200^U，洗滌6次，每次間隔 l分鐘，拍幹；(4)每孔加lOOpl的酶結合物工作液，空白不加，37。c孵育60分鐘，甩幹；(5) 每孔加洗漆液200nl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(6)依次加50^1顯色液A和 顯色液B，室溫避光孵育10分鐘；(7)加50m1終止液，用酶標儀在450nm波長下讀取每孔光
吸收值(OD45Q值)。
本發明犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒，其檢測樣本的判定標準為以待檢樣 本OD45o值與標準陰性OD45o值的比值(P/N)，大於或等於2.1判為陽性，小於或等於1.8為陰 性，介於1.8-2.1之間為可疑，須重檢；重測時仍為可疑值判為陽性。
本發明具有下列優點
(1) 特異性強，敏感性高，安全性好。犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒以基因工 程表達的NP重組蛋白為基礎製備而成；NP重組蛋白為非全病毒抗原、安全性好，不含無關 雜蛋白，只與相應犬狂犬病病毒陽性血清特異結合，不與犬其它疫病陽性血清發生交叉反應。 具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性。
(2) 操作簡便快速。使用犬狂犬病病毒血凝素抗體檢測試劑盒檢測核蛋白抗體時，無需 另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在l-2小時內即可判定檢測結果。
(3) 結果判定形象、準確、可靠。犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒以顯色的深淺 顯示檢測結果，即檢測孔出現藍色顯色為陽性，中止後呈黃色，無色為陰性，結果判定形象。 採用酶標儀機讀數，減少主觀性，準確可靠。
(4) 成本低，投資少。犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒可批量檢測， 一步到位， 成本低廉，投資少，見效快。


圖1是犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒橫截面剖視圖，即盒內設置的組成及位 置示意圖。圖中1為密封包裝的NP-ELISA抗體檢測板、2為10倍濃縮洗滌液、3為陰性 對照、4為陽性對照、5為酶結合物工作液、6為顯色液A、 7為顯色液B、 8為終止液、9為 操作說明書和io為盒體。
圖2是NP重組蛋白的抗原活性鑑定結果。圖中A為重組蛋白的SDS-PAGE分析，B 為重組蛋白的Western Blot鑑定，M.為蛋白質Marker, 1為含空載體pET-28a的大腸桿菌 BL21(DE3)誘導表達產物，2為含重組表達質粒pET28a-NP的大腸桿菌BL21(DE3)誘導表達 產物。
具體實施例方式
根據本發明的技術方案，具體製備如下 (l)RVNP重組蛋白的製備利用RT-PCR技術從RV ERA活疫苗(國產商品化產品)中擴增1350bp NP基因序列，PCR 產物經SamHI+iZ/mflll雙酶切後，克隆入pET-28a表達載體的T7啟動子下遊，構建重組表達 質粒pET28a-NP。用氯化鈣法轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經O.OlmM IPTG誘導表達6h，用 超聲波裂解細菌，利用商用的Ni-NTA親和層析柱純化表達的NP蛋白，獲得狂犬病病毒NP 重組蛋白，測定NP蛋白的蛋白濃度，用於NP-ELISA檢測試劑盒NP抗體檢測板的製備。 (2)RV抗體檢測板的製備 用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩衝液作包被液，將犬狂犬病病毒NP蛋白稀釋為2pg/ml， 按100nl/孔加入可拆96孔酶標板，其包被量為200ng/孔，37°C2小時，再4'C包被過夜，用 0.5。/。BSA37。C封閉2小時，以含0.05%吐溫-20的PBS(pH7.4)洗滌液充分洗滌，甩幹。再加 入20%蔗糖磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時，置乾燥室乾燥後，用於犬狂犬病病毒NP-ELISA 抗體檢測試劑盒裝配。
(3)抗犬IgG單克隆抗體的製備 採取犬全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨沉澱法粗提犬IgG。再經SepherdexG200凝膠層 析和DEAE纖維素離子交換層析進一步純化，獲得IgG純品。以純化的犬IgG蛋白免疫6-8 周齡BALB/c雌性小鼠，首免以50pg犬IgG蛋白抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化， 腹腔注射BALB/c小鼠；間隔3周後，取同樣抗原量與等量弗氏不完全佐劑乳化，腹腔注射 BALB/c小鼠；免疫每隔3周一次，共三次。繼三免後兩個星期，腹腔注射2倍首免劑量的抗 原加強免疫。無菌條件下取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，在PEG4000作用下進 行細胞融合，用含1% HAT， 15%FCS的RPMI 1640培養基進行選擇性培養，5天後半量換液， 10天後改用含in/。HT的RPMI 1640培養。待細胞克隆布滿1/5-1/2培養孔時，吸取上清用間 接ELISA方法篩選陽性孔，篩選出的特異性陽性孔釆用有限稀釋法進行3次克隆，選擇抗體 效價高、呈單個克隆生長、形態良好的細胞株繼續克隆培養，直至抗體分泌陽性率大於95%， 擴大培養並即時液氮保存。將陽性雜交瘤細胞以5-10><106/只的量注射經降植烷預先致敏的8 周齡左右BALB/c小鼠，注射後7-10天收集腹水，1200g離心3min，收集上清，-70'(:凍存 備用，用於製備NP-ELISA抗體檢測試劑盒酶結合物工作液。 (4)酶結合物工作液的製備 用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物(HRP)酶偶聯於抗犬IgG單克隆抗體。用超純水lml 溶解辣根過氧化物酶(HRP,RZ^3.0)5mg溶液，加入lml 0.06M過碘酸鈉溶液4'C避光1小時， 加入lml 160mM乙二醇，室溫反應30分鐘，加入pH4.4的醋酸緩衝液2-8'C透析過夜，換液 兩次。將10mg純化的抗犬IgG單克隆抗體加入上述活化的酶中，轉移至透析袋，於0.05mM pH9.6的碳酸緩衝液中透析，4'C攪拌過夜(換液兩次)。透析液吸至離心管中，加入5mg/ml 的0.05M硼氫化鈉溶液0.4ml, 4'C反應2小時。加入等量的飽和硫酸銨溶液，4'C30分鐘， 4°C4000轉離心20分鐘,棄上清，瀝乾。將沉澱溶於少量PBS，裝入透析袋中，對0.02M PBS(pH7.4)透析，4'C過夜。將透析液中液體吸至離心管中，離心，將上清液吸出，加等量甘 油，混勻，-2(TC保存。再以含0."/。BSA， 0.05%吐溫-20, 0.01。/o硫柳汞的磷酸緩衝液(pH7.4) 按1:200-5000稀釋凍存的標記酶作為酶結合物工作液。 (5)樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配製樣品稀釋液為含0.1%BSA的0.01M磷酸鹽緩衝液(KH2P04 0.2g， Na2HP04*12H20 2.9g， NaCl 8g，定容至lOOOml， pH7.4); 10x濃縮洗滌液為含0.5%吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩衝液 (KH2P04 2g， Na2HP04'12H20 29g， NaCl 80g，定容至lOOOml, pH7.4，再加5ml吐溫-20); 終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至lOOOml。
(6) 陽性對照和陰性對照的製備
將用狂犬病病毒ERA疫苗免疫獲得的犬狂犬病病毒標準陽性血清用樣品稀釋液1:100稀 釋(OD45^1.00)加入少量紅色顏料並按1000U/ml加入青黴素和鏈黴素，無菌過濾，作為犬狂 犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒陽性對照；將篩選獲得的犬標準陰性血清用樣品稀釋液 1:100稀釋(OD45。50.150)，按1000U/ml加入青黴素和鏈黴素，無菌過濾，作為犬狂犬病病毒 NP-ELISA抗體檢測試劑盒陰性對照。
(7) 顯色液的配製
稱取200mg四甲基聯苯胺(TMB)，用100ml無水乙醇或DMSO溶解後，以雙蒸水定容 至lOOOml，配製顯色液A;稱取21g —水檸檬酸，28.2g無水磷酸氫二鈉(Na2HP04)， 6.4ml 0.75% 過氧化氫尿素，雙蒸水定容至lOOOml，調pH值到4.5-5.0，配製顯色液B。
(8) 試劑盒檢測操作程序
其檢測程序為l)將lOx濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液 作1:100稀釋，按100pl/孔加入抗體檢測板中，同時設空白(只加100nl樣品稀釋液)、陰性對 照(犬標準陰性血清)、陽性對照(犬標準陽性血清)，37'C孵育60分鐘，甩幹；3)每孔加洗滌 液200^1，洗滌6次，每次間隔l分鐘，拍幹；4)每孔加lOOial酶結合物工作液(空白不加)， 37C孵育60分鐘，甩幹；5)每孔加洗滌液200^1，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；6)依 次加50^1顯色液A和50|al顯色液B，混勻，室溫避光顯色10min; 7)加終止液，用酶 標儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值(0045值)。
(9) 結果判定標準
判定標準以待檢樣本OD450值與標準陰性OD450值比值(P/N)，大於或等於2.1判為陽性，
小於或等於1.8為陰性。介於1.8-2.1之間為可疑，須重檢，重測時仍為可疑值判為陽性。如 果陽性對照無明顯顯色反應，或陰性對照出現顯色，表明試劑盒失效或檢測操作有誤，需重 新檢測。
RV重組NP蛋白和抗犬IgG單克隆抗體製備的實施實例
以下通過RV NP重組蛋白和抗犬IgG單克隆抗體製備的實施實例進一步描述本發明的犬 狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒。
1. 寡核苷酸引物的設計與合成
根據已公開的狂犬病病毒(RV) ERA株NP基因序列(GenBank No. AF406695)，針對NP 基因的ORF兩端設計了 5'端和3'端一對引物，在5'端和3'端分別引入5flwHI、 ///mHII酶切 位點。引物由上海博亞生物公司合成。
5'端引物5，- GCGGATCCATGGATGCCGACAAGATTG -3，
3'端引物5，- GGCAAGCTTTTATGAGTCACTCGAATATG墨3'
2. 病毒培養與檢測用Vero細胞培養狂犬病病毒(RV) ERA株，以含2%血清的MEM培養基為維持液，33 'C培養4-5天，收集病毒；同時製備細胞飛片，以RV螢光抗體對感染細胞進行直接螢光抗體 檢測，螢光顯微鏡觀察檢測結果。Vero細胞在感染RV 4天後形態圓縮，並被染成較亮的蘋 果綠色或黃綠色，特異性螢光染色灶具有不同的形態和大小，比較常見的呈圓形或橢圓形； 陰性對照Vero細胞形態正常，不含典型的包涵體，僅有桔黃或黃色的非特異性染色。
3. 病毒總RNA的抽提
以Trizol LS提取RV感染細胞總RNA，在感染RV細胞中加RNase free水0.25mL，再 加入0.75mL Trizol LS試劑，混勻，室溫放置5min;加200pL氯仿，混勻，靜置2-5min; 4 。C， 12000rpm， 15min;小心吸上清於新eppendorf管，加0.5mL異丙醇，混勻，室溫靜置10min; 4'C， 12000rpm， 20min;棄上清，沉澱用75%乙醇清洗一遍；4°C, 12000rpm， 10min;棄上 清，室溫乾燥5-10min;加20nLDEPC處理水溶解，用於RT-PCR擴增。
4. RT-PCR擴增
以Oligo(dT)為引物，利用cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈；以合成的cDNA第一鏈 為模板，以RVNP基因引物進行PCR擴增(25pL體系)。PCR體系為在一新的200nL PCR eppendorf管中，依次加入滅菌ddH20 17.35pL， MgCl22.5nL， 10Xbuffer 2.5^L， dNTP0.5nL， 5'端引物0.5nL， 3'端引物0.5pL， Taqplus DNApolymerase 0.15nl，第一鏈cDNAlnL。 PCR 程序94'C預變性2min;然後進入循環，94'C變性15s， 55.5'C,退火15s， 72'C延伸90s，共 30個循環；最後72'C再延伸10min。 1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得預期的1350bp的 NP基因片段。
5. 測序載體的構建和序列測定
用PCR產物純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接連接於pMD18-T vector,連接產 物轉化EcoZ/ToplO感受態細胞，藍白斑篩選。挑取陽性克隆，分別進行PCR鑑定和酶切鑑定。 DNA自動測序儀測定RV NP基因核苷酸序列。RV NP核苷酸及推導胺基酸序列見序列表1 。 表1 RVNP核苷酸及胺基酸序列(SEQNo.l) (l.核苷酸序列2.胺基酸序列)
1 ATG GAT GCC GAC AAG ATT GTA TTC AAA GTC MT AAT CAG GTG GTC TCT TTG AAG 54
2 MDADKIVFKVNNQVVSLK 18
1 CCT GAG ATT ATC GTG GAT CAA CAT GAG TAC AAG TAC CCT GCC ATC AAA GAT TTG 108
2 PEIIVDQHEYKYPAIKDL 36
1 AAA AAG CCC TGT ATA ACC CTA GGA MG GCT CCC GAT TTA AAT MA GCA TAC AAG 162
2 KKPCITLGKAPDLNKAYK 54
1 TCA GTT TTG CCA GGC ATG AGC GCC GCC MA CTT GAT CCT GAC GAT GTA TGT TCC 216
2 SVLPGMSAAKLDPDDVCS 72
1 TAT TTG GCA GCG GCA ATG CAG TTT TTT GAG GGG ACA TGT CCG GAA GAC TGG ACC 270
2 YLAAAMQFFEGTCPEDWT 90
1 AGC TAT GGA ATC GTG ATT GCA CGA MA GGA GAT AAG ATC ACC CCA GGT TCT CTG 324
2 SYGIVIARKGDKITPGSL 108 1GTG GAG ATA AAA CGT ACT GAT GTA GAA GGG AAT TGG GCT CTG ACA GGA GGC ATG 378VEIKRTDVEGNWATGGM126
GAACTGACAAGAGACCCCACTGTCCCTGAGCATGCGTCCTTAGTCGGTCTTCTC432
ETRDPTVPEHASVG144
TTGAGTCTGTATAGGTTGAGCAMATATCCGGGCAAAACACTGGTAACTATAAG486
LSYRSKISGQNTGNYK162
ACAAACATTGCAGACAGGATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCTTTTGTTAAA540
TNIADRIEQIFETAPFVK180
ATCGTGGAACACCATACTCTAATGACAACTCACAAAATGTGTGCTAATTGGAGT594
IVEHHTMTTHKMCANWS198
ACTATACCAAACTTCAGATTTTTGGCCGGAACCTATGACATGTTTTTCTCCCGG648
TIPNFRFAGTYDMFFSR216
ATTGAGCATCTATATTCAGCAATCAGAGTGGGCATAGTTGTCACTGCTTATGAA702
IEHYSAIRVGIVVTAYE234
GACTGTTCAGGACTGGTATCATTTACTGGGTTCATAAAACAAATCAATCTCACC756
DCSGVSFTGFIKQINT252
GCTAGAGAGGCAATACTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGA810
AREAIYFFHKNFEEEIR270
AGAACGTTTGAGCCAGGGCAGGAGACAGCTGTTCCTCACTCTTATTTCATCCAC864
RTFEPGQETAVPHSYFIH288
TTCCGTTCACTAGGCTTGAGTGGGMATCTCCTTATTCATCAAATGCTGTTGGT918
FRSGSGKSPYSSNAVG306
CACGTGTTCAATCTCATTCACTTTGTAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGATCC972
HVFNIHFVGCMGQVRS324
CTAAATGCAACGGTTATTGCTGCATGTACTCCTCATGAAATGTCTGTTCTAGGG1026
NATVIAACTPHEMSVG342
GGCTATCTGGGAGAGGAATTCTTCGGGAAAGGGACATTTGAAAGAAGATTCTTC1080
GYGEEFFGKGTFERRFF360
織GATGAGAAAGAACTTCAAGMTACGAGGCGGCTGAACTGACAAAGACTGAC1134
RDEKEQEYEAAETKTD378
GTAGCACTGGCAGATGATGGAACTGTCAACTCTGACGACGAGGACTACTTCTCA1188
VAADDGTVNSDDEDYFS396
GGTGAAACCAGAAGTCCGGAGGCTGTTTATACTCGAATCATGATGAATGGAGGT1242
GETRSPEAVYTRIMMNGG414
CGACTAAAGAGATCTCACATACGGAGATATGTCTCAGTCAGTTCCAATCGTCAT1296
RKRSHIRRYVSVSSNRH432
GCCCGTCCAAACTCATTCGCCGAGTTTCTAMCMGACATATTCGAGTGACTCA1350
ARPNSFAEF.NKTYSSDS450
6. pET28a-NP重組表達質粒的構建、篩選及鑑定
以pMD18-NP為模板在95。Clmin、 50'C45s、 72。C1.5min環境下30個循環進行PCR，最後 延伸10min。 PCR產物電泳回收後，經萬owHI和頂"Jin雙酶切後，回收目的片段，克隆入表達 質粒pET-28a的A wHI和所"^[II位點間，構建重組表達質粒pET28a-NP，轉化宿主菌TOPIO， 提取重組質粒進行PCR、雙酶切鑑定和序列測定。
7. NP重組蛋白的誘導表達與鑑定經鑑定的重組質粒pET28a-NP轉入BL21(DE3)宿主菌，挑取單克隆接種到含有50pg/mL 卡那黴素LB培養基中，37"C培養過夜，按1:100的比例將培養物接種於LB培養基中，250卬m 震蕩培養2小時左右，當誘導前ODsoo值達到1.0時，加入終濃度O.OlmM IPTG， 37。C誘導 培養6小時，離心收集菌體。將菌體加入適量的lxSDS上樣緩衝液，採用12。/。的SDS-PAGE 鑑定，產物表達量可達10~15%，以RV陽性血清為一抗進行Western blot檢測，可檢測到表 達的融合蛋白(如圖2)。
8. NP重組蛋白的製備
經大腸桿菌菌株BL21(DE3)表達的NP蛋白主要以融合蛋白的形式存在。用PBS重懸菌 體，超聲波裂解菌體，4°C， 8000rpm離心10min;沉澱經3M尿素洗滌後，以8M尿素溶液 溶解，採用QIAGEN公司Ni-NTA鎳親和層析變性純化表達蛋白；收集洗脫蛋白，進行 SDS-PAGE分析，以BCA法測定純化蛋白濃度，計算表達蛋白的產量。結果獲得高純度的 NP重組蛋白，產量為13.6mg/L。
9. 犬IgG抗原製備
採集健康犬血清，以辛酸-硫酸銨法提取犬血清IgG蛋白。將犬血清4。C 12000rpm離心 15min，吸取上清，加入4倍體積的0.06M pH 4.8醋酸鹽緩衝液，用1M NaOH調pH至4.5; 在室溫攪拌下逐滴加入正辛酸(33ul/ml)，攪拌30min， 4'C靜置2h; 12000rpm離心30min，上 清液用濾紙過濾；濾液加10倍體積PBS，用5MNaOH調pH至7.4，冰浴至4'C;按每毫升 混合液加0.277g硫酸銨並攪拌30min， 4。C靜置4h; 4'C， 10000rpm離心30min,沉澱用適量 PBS溶解，對PBS緩衝液進行透析過夜。利用GE公司AKTA purifier的蛋白純化系統以Hiload 16/60 superdex 200預裝柱對犬IgG進行凝膠層析純化。用緩衝液(0.05M sodium phosphate, 0.15M NaCl， pH8.0)平衡蛋白層析柱(HUoad 16/60 superdex 200 perp pg)。以0.02urn濾膜濾過 犬IgG粗提物，取待純化樣品2mL上柱，流速為0.3mL/min，觀察UV280值基線的變化，收 集紫外吸收峰蛋白，SDS-PAGE分析各個洗脫峰蛋白的分子量及分離效果。結果犬IgG粗提 物的第l洗脫峰可見52kDa和27kDa兩條蛋白條帶，即犬IgG的重鏈和輕鏈，未見明顯的其 他雜蛋白帶，表明純化的犬IgG蛋白純度高。
10. 抗犬IgG單克隆抗體的製備
挑選6-8周齡體重為18-20g BALB/c雌性小鼠，首免以50-100嗎純化犬IgG抗原和等體積的 弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射BALB/c小鼠；間隔3周後，取同樣抗原量與等量弗氏不完全 佐劑混勻，腹腔注射BALB/c小鼠；免疫後7天採血，以ELISA測定免疫小鼠血清抗犬IgG 抗體效價為1:102400，提示小鼠誘導產生良好的免疫反應，均達到細胞融合要求。3周後以 加倍劑量的抗原進行超強免疫，3d後取脾細胞進行融合。取BALB/c免疫小鼠脾細胞和SP2/0 小鼠骨髓瘤進行細胞融合後，第3天開始出現融合細胞。待細胞克隆布滿培養孔的1/5-1/2時， 吸取上清用間接ELISA方法篩選出陽性孔100孔，陽性率為25%,對篩選出的特異陽性孔採 用有限稀釋法進行3次克隆，選擇抗體效價高、呈單個克隆生長、形態良好的細胞株繼續克 隆培養，直至抗體分泌陽性率大於95%，獲得6株陽性雜交瘤細胞株，經傳代培養後，仍能 穩定分泌抗體，分別命名為1A1、 2D10、 3H7、 3D4、 3D5和4D10。利用小鼠誘生腹水生 產抗豬IgG單克隆抗體。將雜交瘤細胞以5-10"06/只注射經降植烷致敏8周齡左右的BALB/c小鼠，注射後7-10天收集腹水，1200g離心3min,收集上清，每株單克隆抗體獲小鼠腹水約 5-10mL，分裝，置-70'C凍存，用於酶結合物的製備。
按實施例中(2)方法步驟製備核蛋白抗體檢測板，按實施例中(3)(4)方法步驟製備抗體檢測 試劑盒酶結合物工作液，按實施例中(5)方法步驟製備樣品稀釋液、洗滌液、終止液，按實施 例中(6)方法步驟製備抗體檢測試劑盒陽性對照和陰性對照，按實施例中(7)方法步驟製備顯色 液A、顯色液B，最後，將各種組成成份裝配成犬狂犬病病毒血凝素抗體檢測試劑盒。
使用犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒檢測犬核蛋白抗體水平時，將採集分離的 犬血清，用樣品稀釋液作1:100或梯度稀釋，製備待檢樣品溶液或梯度稀釋樣品溶液，將待 檢樣品、陽性和陰性對照分別加入NP抗體檢測板，按實施例中(8)中操作程序，37'C作用60 分鐘，洗滌液洗滌，加酶結合物工作液，37'C作用60分鐘，同上洗滌，加入顯色液A，顯色 液B各50nl，室溫避光顯色10min，滴加終止液50|lU終止顯色反應，酶標儀檢測00450值。
按實施例中(9)中的判定標準判定結果。檢測孔OD450值與標準陰性對照OD450值比值(P/N)大
於或等於2.1判為陽性。對於梯度稀釋樣品則檢測孔為陽性的樣品最高稀釋度為該待檢血清 的血凝素抗體滴度。如果RV陽性對照無明顯顯色反應，或陰性對照出現顯色，表明試劑盒 失效或檢測操作有誤，需重新檢測。formula see original document page 12AGAACGTTTGAGCCAGGGCAGGAGACAGCTGTTCCTCACTCTTATTTCATCCAC864
RTFEPGQETAVPHSYFIH288
TTCCGTTCACTAGGCTTGAGTGGGAAATCTCCTTATTCATCAAATGCTGTTGGT918
FRSGSGKSPYSSNAVG306
CACGTGTTCMTCTCATTCACTTTGTAGGATGCTATATGGGTCAAGTCAGATCC972
HVFNIHFVGCYMGQVRS324
CTAAATGCAACGGTTATTGCTGCATGTACTCCTCATGAAATGTCTGTTCTAGGG1026
NATVIAACTPHEMSVG342
GGCTATCTGGGAGAGGAATTCTTCGGGMAGGGACATTTGAAAGAAGATTCTTC1080
GYGEEFFGKGTFERRFF360
AGAGATGAGMAGAACTTCAAGAATACGAGGCGGCTGAACTGACAAAGACTGAC1134
RDEKEQEYEAAETKTD378
GTAGCACTGGCAGATGATGGAACTGTCMCTCTGACGACGAGGACTACTTCTCA1188
VALADDGTVNSDDEDYFS396
GGTGAAACCAGAAGTCCGGAGGCTGTTTATACTCGAATCATGATGAATGGAGGT1242
GETRSPEAVYTRIMMNGG414
CGACTAAAGAGATCTCACATACGGAGATATGTCTCAGTCAGTTCCAATCGTCAT1296
RKRSHIRRYVSVSSNRH432
GCCCGTCCAAACTCATTCGCCGAGTTTCTAAACMGACATATTCGAGTGACTCA1350
ARPNSFAEFNKTYSSDS450
<210〉2
〈211〉27
〈212>DNA
〈213〉RVNP5'端引物 <223〉人工合成
〈400〉2
GCGGATCCAT GGATGCCGAC AAGATTG
〈210〉3
29
<212〉DNA
〈213〉RVNP3，端引物 〈223〉人工合成
3
GGCAAGCTTTTATGAGTCAC TCGAATATG
權利要求
1. 犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒，試劑盒內設有NP抗體檢測板，酶結合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，其特徵在於所述NP抗體檢測板為包被狂犬病病毒核蛋白NP的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記抗犬IgG單克隆抗體，陽性對照為犬狂犬病標準陽性血清，陰性對照為犬標準陰性血清，所述狂犬病病毒核蛋白NP為利用RT-PCR技術擴增狂犬病病毒ERA疫苗株NP基因1350bp的片段，將其插入到原核表達載體pET-28a的下遊構建pET-NP重組表達質粒，以氯化鈣法轉化大腸桿菌BL21DE3，經0.01mM IPTG誘導表達，用超聲波裂解表達菌體，經Ni-NTA親和層析柱純化獲得。
2. 根據權利要求1所述犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒，其特徵在於包被 NP抗體檢測板的狂犬病病毒核NP重組蛋白的使用濃度為2pg/ml，用量為100nl/孔。
全文摘要
犬狂犬病病毒NP-ELISA抗體檢測試劑盒，其中抗體檢測板為包被狂犬病病毒核蛋白NP的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記抗犬IgG單克隆抗體，陽性對照為犬狂犬病標準陽性血清，陰性對照為犬標準陰性血清，狂犬病病毒核蛋白NP為利用RT-PCR技術擴增狂犬病病毒ERA疫苗株NP基因1350bp的片段，將其插入到原核表達載體pET-28a的下遊構建pET-NP重組表達質粒，以氯化鈣法轉化大腸桿菌BL21 DE3，經0.01mMIPTG誘導表達，用超聲波裂解表達菌體，經Ni-NTA親和層析柱純化獲得。包被NP抗體檢測板的狂犬病病毒核NP重組蛋白的使用濃度為2μg/ml，用量為100μl/孔。本發明的優點為特異性強，敏感性高，安全性好。
文檔編號G01N33/577GK101413948SQ20081016244
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月13日 優先權日2008年11月13日
發明者周繼勇, 偉 尹, 焰 顏, 馬益平 申請人:浙江大學