抗狂犬病病毒重組免疫毒素及製備工藝的製作方法
2023-07-29 00:30:21
專利名稱：抗狂犬病病毒重組免疫毒素及製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗狂犬病病毒免疫毒素，特別是提供了抗狂犬病病毒重組免疫毒素及製備工藝，用於狂犬病的緊急預防與暴露後治療，屬於重大人獸共患傳染病防治藥物製備技術領域。
背景技術：
狂犬病早在公元前四世紀即有記載，是由狂犬病毒引起的直接接觸性、病毒性傳染病，所有溫血動物均易感，是目前危害人類健康的一種重要疫病。據世界衛生組織統計，全世界每年有40,000-70,000人死於狂犬病，1950-2005年我國狂犬病死亡總人數約102,280例，從2006年1月開始，我國每月因狂犬病死亡人數呈持續上升狀態，從5月開始超越了長期領先的肺結核，成為國人生命的第一殺手，當前我國狂犬病總的發病和死亡人數僅次於印度，居世界第2位。狂犬病患者一旦出現症狀幾乎100％死亡，目前主要措施是在被動物致傷前或致傷後注射狂犬病疫苗或狂犬病抗血清。作為暴露後免疫的疫苗應快速產生抗體以阻止病毒侵襲神經系統，而當前國內外的疫苗需要較長的時間(10-14天)才能誘導機體產生有效保護滴度的中和性抗體，尤其對潛伏期短或病變部位離中樞神經系統較近的患者，常常因免疫失敗而造成死亡。狂犬病抗血清或狂犬病免疫球蛋白具有直接中和病毒作用，但問題是抗體只能中和游離於體內的病毒，而不能破壞病毒複製所依賴的感染細胞，病毒一旦進入細胞，抗體便失去了其中和能力，因此無法完全清除病毒。
近十幾年來，國內外學者紛紛將單克隆抗體、基因工程抗體、細胞因子等作為載體，與化學藥物、毒素、同位素及酶類等相連接，將其帶至病灶部位，特異性的殺傷腫瘤細胞，這種治療稱為導向治療，有關的藥物稱為「生物飛彈」或「免疫導向藥物」。2002年Zevalin被FDA批准用於淋巴瘤的治療，成為第一個用於腫瘤免疫治療的放射性毒素偶鏈的抗體藥物，此外DAB389IL-2和CD33-刺孢黴素也被FDA批准用於皮膚T-淋巴細胞瘤(CTCL)和急性髓性白血病(AML)的治療。
發明內容
本發明提供一種抗狂犬病病毒重組免疫毒素，集殺傷病毒感染細胞和中和游離病毒為一體的藥物。
本發明還提供了上述免疫毒素的製備工藝，目的旨在為人狂犬病的預防與控制提供新的途徑，並適合於工業化生產。
本發明公開的重組免疫毒素，其靶向載體為抗狂犬病病毒中和性單鏈抗體，藥物彈頭為綠膿桿菌外毒素PE40。
本發明的解決方案是根據免疫學基本原理，篩選能產生抗狂犬病病毒高特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，提取雜交瘤細胞基因組，利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因，並構建抗狂犬病病毒中和性單鏈抗體，將構建的單鏈抗體基因酶切插入到含有綠膿桿菌外毒素(PE40)的表達載體中，轉化大腸桿菌進行原核表達，將表達的融合蛋白進行純化。
本發明抗狂犬病病毒重組免疫毒素的製備方法主要包括以下步驟1、分泌抗狂犬病病毒中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株的篩選以純化的狂犬病病毒國際標準株(CVS株)免疫Balb/c小鼠→無菌分離小鼠脾細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合→HAT法篩選陽性融合細胞→ELISA法篩選分泌高親和力中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株；2、狂犬病病毒中和性單鏈抗體(ScFv)基因的構建提取分泌中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株RNA→互補合成輕、重鏈cDNA→PCR方法擴增鼠源單克隆抗體重鏈可變區與輕鏈可變區基因→採用SOE-PCR(重疊延伸拼接法)將輕、重鏈可變區基因裝配為ScFv基因；3、單鏈抗體(ScFv)基因克隆ScFv基因與PMD18-T載體連接→轉化Ecoli.JM109感受態→克隆ScFv基因；4、抗狂犬病病毒重組免疫毒素的製備酶切裝有ScFv基因的PMD18-T載體和裝有綠膿桿菌外毒素(PE40)的原核表達載體(PET28)→T4連接酶於16℃連接過夜→重組質粒轉化→菌體發酵→蛋白純化→復性。
下面實驗證明了狂犬病重組免疫毒素在防治狂犬病上效果方法將狂犬病病毒倍比稀釋後，將10-5稀釋液接種已長成單層的敏感細胞，分為六組，分別在接種病毒後12h、24h、36h、48h、60h、72h向各孔中加入抗狂犬病病毒重組免疫毒素，另設一組作為病毒對照，每組重複6孔，然後每天觀察細胞形態、病毒蝕斑出現情況及蝕斑大小，連續觀測12天(試驗組在給藥後開始觀察)。
結果病毒對照組最早出現細胞病變，在接種病毒5天後開始出現蝕斑，8天時蝕斑開始消退，10天後蝕斑連成一片，接種病毒後12h、24h、36h給重組免疫毒素組始終未出現病毒蝕斑，48h給藥組在接種病毒後10天開始出現病毒蝕斑，試驗結束時出現8個大小為1-2mm病毒蝕斑，期間病毒蝕斑數目及大小均未增加，60h給藥組在接種病毒後9天開始出現蝕斑，試驗結束時出現12個大小為1.5-2mm蝕斑，期間蝕斑數目及大小均未增加，72h給藥組在接種病毒後7天開始出現蝕斑，試驗結束時出現18個大小為3-4mm的蝕斑，期間蝕斑數目及大小均未增加。
具體結果如下表抗狂犬病病毒重組免疫毒素體外試驗結果
注表中蝕斑出現時間指自接種病毒後開始出現蝕斑的時間，「------」指未出現蝕斑。
結果表明該重組免疫毒素既可中和游離病毒又可殺傷病毒感染細胞，可阻止病毒的進一步感染，早期用藥結果優於晚期用藥，因此此重組免疫毒素可用於狂犬病的早期預防和暴露後緊急預防。
本發明用於狂犬病的防治較現有的其它產品具有如下優點1、本發明所用載體為抗狂犬病病毒高親和性單鏈抗體，故該發明既具有中和游離病毒的能力，又可通過PE的細胞毒性作用殺傷病毒感染細胞。
2、本發明為重組抗體類藥物，可快速清除體內的病毒與殺傷病毒感染細胞，可用於狂犬病的緊急預防與暴露後治療。
3、本發明克服了化學方法製備免疫毒素所存在的產率低、分子大、免疫原性大、組成不均一的缺點。
具體實施例方式
下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明權利要求範圍之內。
實施例1抗狂犬病病毒重組免疫毒素的製備1、分泌抗狂犬病病毒中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株的篩選以純化的狂犬病病毒國際標準株(CVS株)免疫Balb/c小鼠，共免疫三次，每次間隔15d，三免後血清抗體效價檢測(ELISA檢測效價＞27，瓊脂擴散試驗效價＞23)，無菌分離小鼠脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，HAT法篩選陽性融合細胞，ELISA法篩選分泌高親和力中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
2、狂犬病病毒中和性單鏈抗體(ScFv)基因的構建利用trizol提取分泌中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株RNA，互補合成輕、重鏈cDNA，PCR方法擴增鼠源單克隆抗體重鏈可變區與輕鏈可變區基因，採用SOE-PCR(重疊延伸拼接法)將輕、重鏈可變區基因裝配為ScFv。
3、單鏈抗體(ScFv)基因克隆將裝配好的ScFv基因與PMD18-T載體16℃連接過夜，轉化Ecoli.JM109感受態，塗布於氨苄(Ampcilin)抗性平板過夜培養後，挑取孤立菌落接種於含有氨苄青黴素的液體LB培養基中，37℃培養16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經PCR和酶切鑑定正確後，對所克隆的ScFv基因進行測序。
4、抗狂犬病病毒重組免疫毒素生產工藝流程分別用XhoI和EcoRI酶切克隆的ScFv基因及裝有綠膿桿菌外毒素(PE40)的表達載體，T4連接酶於16℃連接過夜，構建重組質粒。將構建的重組質粒轉化E.coliJM109感受態，塗布於卡那抗性平板37℃過夜培養後，挑取孤立菌落接種於含有卡那黴素的液體LB培養基中，37℃培養16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經PCR和酶切鑑定正確後，轉化E.coliBL21(DE3)感受態，塗布於卡那抗性平板37℃過夜培養後，挑取孤立菌落接種於含有卡那黴素的液體LB培養基中，37℃培養過夜，將菌液按1％比例加入液體LB培養基中，37℃振蕩培養4h後，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發酵，發酵後用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經復性後即獲得抗狂犬病病毒重組免疫毒素。
權利要求
1.一種抗狂犬病病毒重組免疫毒素，其特徵在於靶向載體為抗狂犬病病毒中和性單鏈抗體，藥物彈頭為綠膿桿菌外毒素PE40。
2.根據權利要求1所述的抗狂犬病病毒重組免疫毒素製備工藝，其特徵在於包括以下步驟1)分泌抗狂犬病病毒中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株的篩選以純化的狂犬病病毒國際標準株CVS株免疫Balb/c小鼠→無菌分離小鼠脾細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合→HAT法篩選陽性融合細胞→ELISA法篩選分泌高親和力中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株；2)狂犬病病毒中和性單鏈抗體基因的構建提取分泌中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞株RNA→互補合成輕、重鏈cDNA→PCR方法擴增鼠源單克隆抗體重鏈可變區與輕鏈可變區基因→採用重疊延伸拼接法將輕、重鏈可變區基因裝配為ScFv基因；3)單鏈抗體基因克隆ScFv基因與PMD18-T載體連接→轉化Ecoli.JM109感受態→克隆ScFv基因；4)抗狂犬病病毒重組免疫毒素的製備酶切裝有ScFv基因的PMD18-T載體和裝有綠膿桿菌外毒素PE40的原核表達載體PET28→T4連接酶於16℃連接過夜→重組質粒轉化→菌體發酵→蛋白純化→復性。
全文摘要
本發明公開了一種抗狂犬病病毒重組免疫毒素的製備工藝，篩選能產生抗狂犬病病毒高特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，提取雜交瘤細胞基因組，利用聚合酶鏈式反應方法擴增抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因，並構建抗狂犬病病毒中和性單鏈抗體，將構建的單鏈抗體基因酶切插入到含有綠膿桿菌外毒素的表達載體中，轉化大腸桿菌進行原核表達，將表達的融合蛋白進行純化。本發明可中和游離病毒，並通過PE的細胞毒性作用殺傷病毒感染細胞，能快速清除體內的病毒與殺傷病毒感染細胞，可用於狂犬病的緊急預防與暴露後治療。本發明克服了化學方法製備免疫毒素所存在的產率低、分子大、免疫原性大、組成不均一的缺點。
文檔編號A61P31/12GK1927887SQ200610017178
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月15日 優先權日2006年9月15日
發明者夏鹹柱, 楊松濤, 朱平, 王化磊, 王承宇, 高玉偉, 黃耕, 王鐵成 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所