利用膜分離技術高效製備一類不均一性安絡小皮傘多糖的方法
2023-07-28 03:26:06
專利名稱：利用膜分離技術高效製備一類不均一性安絡小皮傘多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用膜分離技術從發酵液中分離提取濃縮一類不均一性安絡小皮傘多糖的方法。
背景技術：
中國農產品每年因作物病害減產數十億噸，防治農作物病害對保障國民經濟的穩定發展和不斷提高人民生活水平具有重要的意義。使用化學農藥是減少作物病害損失的有效手段，但由於大量使用、濫用以及農藥的不可降解性，造成環境汙染、生態破壞、食品汙染及人畜毒等事件頻發，並導致嚴重的3R(殘留、抗性、再增猖獗)問題。水稻稻瘟病是全世界稻區危害最嚴重的水稻病害之一，一般造成水稻減產10% —20%。以我國為例，20世紀 90年代以來，該病的年發生面積均在380萬公頃以上，年損失稻穀達數億千克。由於稻瘟病菌小種構成複雜，而且變化很快，易導致水稻抗病品種喪失，稻瘟病菌的多變性也常使其抗農藥性發展迅速，因此篩選一種新的殺菌劑是十分必要的。真菌多糖一般是指各種真菌的子實體和類所產生的一類代謝產物，通常是極性大分子化合物，能夠控制細胞分裂分化，調節細胞生長衰老的一類活性多糖，被譽為21世紀的健康衛士。與動、植物多糖不同的是真菌多糖分子單體之間，大多以β(1 —3)與β (I — 6)糖苷鍵結合，形成鏈狀分子，具有螺旋狀的立體構型。多糖又分為均一性多糖和不均一性多糖兩類。(I)均一性多糖一般由10個以上的同一種單糖通過糖苷鍵連接而成，可分為直鏈結構，也可有分支結構。(2)不均一性多糖是由不同單糖分子縮合而成的多糖，除含有糖鏈外，還可含有肽鏈或脂類成份。大部分的多糖都屬於不均一性多糖。安絡小皮傘類多糖是安絡小皮傘的重要活性成分，它的藥用價值較高，我國民間用它的菌絲來治療跌打損傷、骨折疼痛、坐骨神經痛、偏頭痛、麻風性神經痛和風溼關節痛等，但是對於防治作物病害方面國內外報導的很少。本課題組通過研究發現不均一性安絡小皮傘類多糖是一個高效、殺菌譜廣、對作物和肺靶標生物以及環境安全的真菌多糖，尤其對稻瘟病菌有良好的防效，經多次試驗證明對稻瘟病菌的菌絲生長的抑制率高達93. 5%。目前多糖提取工藝一般多採用水浴、酶提和層析、精餾、重結晶等工藝過程，其缺點一、是工藝繁瑣、溫度、時間要求特定。二、是沒有進行有效組分提純或生產中無法實現組分提純，多是以雜多糖形成製品，其產品中無效的糟柏成分較多、有效功效低，這局限了其在製藥方面的開發和利用。三、是現有工藝成本高，功效低，難以規模化生產。四、是現有工藝處理步驟中用到的一些化學藥品，其既浪費資源，又汙染環境，而且對產品的有效成分還有一定程度的破壞。膜分離技術是國際上公認的20世紀末至21世紀中期最有發展前途的前沿技術。膜分離是以選擇性透過膜為分離介質，當膜兩側存在推動力時，原料的組分可透過選擇膜而對混合物進行分離、提純、濃縮的一種分離過程。膜分離技術是當今世界一項先進的精細分離技術，膜技術的分離孔徑從納米級至微米級，能把一切物質分離開，它的分離比以重力為基礎的離心機收得率高30%以上。因此，本項目以該技術為基礎原理的所研發的一類不均一性安絡小皮傘類多糖發酵後的安絡小皮傘類多糖製備工藝具有比以濾布為介質的板框等分離精度高一個數量級；比化學萃取工序簡單，無相變、無汙染；比蒸餾分離、蒸發濃縮能耗低80% 90%等優點。
發明內容
本發明的目的是解決現有的一類不均一性安絡小皮傘類多糖製作方法存在的製作工藝複雜成本高及製作得到的多糖含量低、發酵液雜質多以及使用化學藥品對產品的有效成分造成破壞等。本發明提供一種利用膜分離技術濃縮純化一類不均一性安絡小皮傘類多糖製作方法。用以解決現有技術中存在的勞動強度大、生產效率低、環境汙染嚴重、生產成本高、產品質量差、產品收率低等問題。本發明的膜材料是陶瓷無機膜。本發明所用的陶瓷無機膜與高聚物分離膜相比優點是(I)熱穩定好，適用於高溫、高壓體系。試用溫度一般都可以達到400°C，有時可以高達800°C。(2)化學穩定性好，能耐酸和弱鹼，pH值試用範圍寬。(3)抗微生物能力強，與一般微生物不發生生化及化學反應。(4)陶瓷膜組件機械強度大。(5)清潔狀態好。本身無毒，不會使被分離體系受到汙染。容易再生和清洗。當膜汙染被堵塞後、可以進行反吹及衝洗，也可以在高溫下進行化學清洗。(6)陶瓷膜的孔分布 窄，分離性能好。本發明一種利用膜分離技術從發酵液中分離提取濃縮一類不均一性真菌多糖的芽孢的方法，按照以下步驟進行一、將產安絡小皮傘類多糖的安絡小皮傘經深層發酵後得到發酵液；二、將步驟一中的發酵液冷凍乾燥至恆質量，粉碎機破碎，過60目篩；三、將步驟二中的類乾粉加蒸餾水在70°C恆溫水浴鍋浸提2h ;四、將步驟三中的浸提液在操作溫度為25 45°C、膜通量為50 60LMH條件下，經過截留分子量為O. 01 O. 03um的無機陶瓷微濾膜和微濾技術來濃縮純化浸提液中不均一性安絡小皮傘類多糖，通過的溶液為安絡小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡小皮傘類多糖濃縮倍數為6 7倍；五、將步驟四中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液在操作溫度為25 45°C、膜通量為35 45LMH條件下通過截留分子量為4000 9000k的無機陶瓷超濾膜和超濾技術來濃縮純化浸提液中不均一性安絡小皮傘類多糖，其中被截留的在膜的近側液的溶液為不均一性安絡小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡小皮傘類多糖濃縮倍數為10 15倍；六、將步驟五中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液經噴霧乾燥製成粉末，即得到不均一性安絡小皮傘類多糖，噴霧乾燥的進口溫度為170 210°C，出口溫度為80 95°C。本發明的方法中的膜過濾技術自動化程度高，操作簡單，減少了人力成本且不需要使用過濾劑進行過濾，本發明的製作方法成本低。本發明製作得到不均一性安絡小皮傘類多糖殺菌劑中安絡小皮傘類多糖含量高，製作得到的小皮傘真菌多糖殺菌劑不易吸潮，保質期長。
圖I利用膜分離技術高效製備一類不均一性安絡小皮傘多糖的工藝生產流程框圖。
具體實施例方式以下結合具體實施方式
，對本發明進行詳細說明。
具體實施方式
一本實施方式一種膜分離技術從發酵液中分離提取濃縮一類不均一性小皮傘真菌多糖的方法按照以下步驟進行一、將產安絡小皮傘類多糖的安絡小皮傘經深層發酵後得到發酵液；二、將步驟一中的發酵液冷凍乾燥至恆質量，粉碎機破碎，過60目篩；三、將步驟二中的類乾粉加蒸餾水在70°C恆溫水浴鍋浸提2h ；
四、將步驟三中的浸提液在操作溫度為25_45°C、膜通量為50-60LMH條件下，經過截留分子量為O. 01-0. 03um的無機陶瓷微濾膜來濃縮純化浸提液中不均一性安絡小皮傘類多糖，通過的溶液為安絡小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡小皮傘類多糖濃縮倍數為6-7倍；被截留的在膜的近側液的溶液中主要成分為類和不溶性物等。五、將步驟四中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液在操作溫度為25_45°C、膜通量為35-45LMH條件下通過截留分子量為4000_9000k的無機陶瓷超濾膜來濃縮純化浸提液中不均一性安絡小皮傘類多糖，其中被截留的在膜的近側液的溶液為不均一性安絡小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡小皮傘類多糖濃縮倍數為10-15倍；通過的溶液為鹽、胺基酸等一些小分子物質。六、將步驟五中的不均一'丨生安絡小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液經噴霧乾燥製成粉末，即得到不均一性安絡小皮傘類多糖殺菌劑，噴霧乾燥的進口溫度為170 210°C，出口溫度為80 95。。。本實施方式得到的一類不均一性安絡小皮傘類多糖的保質期為2年以上。本實施方式得到的一類不均一性安絡小皮傘類多糖的分子量為180萬。13CNMR譜測定表I 一類不均一性安絡小皮傘類多糖的化學移植峰號化學位移值δ (ppm)峰號化學位移值δ (ppm)
1104.61073.2
2103. I1172.8
3102.31272.8
4101. 21369.6
580.51469.8
680.31568.9 778.51664.0
875.81763.8
974.3表2 —類不均一性安絡小皮傘類多糖的C-I區解析
糖殘基碳原子化學位移值S (ppm) 峰高比
—2) -Man-(I— C-I104.6 I
-4)- a -D-Glc-Cl- C-I102.3 3
A-D-Glc-(I— C-I101. I I
—2)-Mane - (I— C-I103. I I t表3 —類不均一性安絡小皮傘類多糖的C-6區解析
糖殘基碳原子化學位移值δ (ppm)
Glc _(n—C-663.4Man - (n—C-663.8 —2) -Manc - (I—C-668.7
t表4 一類不均一性安絡小皮傘類多糖取代後的C-2、C-3、C_4區解析糖殘基碳原子化學位移值δ (ppm)
—2)_Man - (I—C-280.2—4)- a-D-Glc-(l- C_478.6
—2)-Maru — (I—C~280.7
t具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中將一類不均一性小皮傘接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為為25-28°C，發酵時間為60-70h。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟四中小皮傘類多糖溶液濃縮倍數為7倍。其它步驟及參數與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三不同的是步驟四中濾液通過截留分子量為O. 02um的微濾膜過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟五中小皮傘類多糖溶液濃縮倍數為14倍。其它步驟及參數與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五不同的是步驟五中濾液通過截留分子量為7000k的超濾膜過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟七中噴霧乾燥的進口溫度為180°C，出口溫度為75°C。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
二不同的是一類不均一性小皮傘接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為28°C，發酵時間為70h。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟五中將發酵液通過截留分子量為5000 8000k的超濾膜過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十不均一性安絡小皮傘類多糖的防治效果，採用抑菌圈法首先刮取病原菌孢子製成孢懸液，將孢懸液(I X IO6個/mL)與融化並冷卻至45°C左右的PDA培養基混勻，制平板。不均一性安絡小皮傘類多糖點接於病原菌平板上，28°C培養72h，觀測抑菌圈。也可將不均一性安絡小皮傘類多糖和病原菌成十字交叉排列(病原菌在十字的中央，不均一性安絡小皮傘類多糖在十字的兩端)。培養3-4天後，觀察抑菌圈大小。得出的結果見表5和表6。
表5不均一性安絡小皮傘類多糖的抑菌譜測定結果
權利要求
1.ー種利用膜分離技術從發酵液中分離濃縮提取不均一性安絡小皮傘類多糖的方法，其特徵在於，按照以下步驟進行一、將產安絡小皮傘類多糖的安絡小皮傘經深層發酵後得到發酵液；ニ、將步驟一中的發酵液冷凍乾燥至恆質量，粉碎機破碎，過60目篩；三、將步驟ニ中的類乾粉加蒸餾水在70°C恆溫水浴鍋浸提2h ;四、將步驟三中的浸提液在操作溫度為25 45°C、膜通量為50 60LMH條件下，經過截留分子量為O. 01 O. 03um的無機陶瓷微濾膜濃縮純化浸提液中不均一性安絡小皮傘類多糖，通過的溶液為安絡小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡小皮傘類多糖濃縮倍數為6 7倍；五、將步驟四中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液在操作溫度為25 45°C、膜通量為35 45LMH條件下通過截留分子量為4000 9000k的無機陶瓷超濾膜來濃縮純化浸提液中不均一性安絡小皮傘類多糖，其中被截留的在膜的近側液的溶液為不均一性安絡小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡小皮傘類多糖濃縮倍數為10 15倍；六、將步驟五中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液經噴霧乾燥製成粉末，即得到不均一性安絡小皮傘類多糖產品，噴霧乾燥的進ロ溫度為170 210°C，出ロ溫度為80 95。。。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟一中將安絡小皮傘接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為25-28°C，發酵時間為60 70h。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟三中料水重量比為I: 15。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟四中溶液通過截留分子量為O.02um的無機陶瓷微濾膜。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在幹，步驟五中溶液通過截留分子量為8000k的超濾膜過濾。
6.根據權利要求I或5所述的方法，其特徵在於，步驟五中ー類不均一性安絡小皮傘類多糖溶液的濃縮倍數為14倍。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟六中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白。
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟七中噴霧乾燥的進ロ溫度為190°C，出口溫度為85で。
全文摘要
本發明公開了利用膜分離技術高效製備一類不均一性安絡小皮傘多糖的方法，按照以下步驟進行一、深層發酵後得到發酵液；二、將發酵液冷凍乾燥至恆質量，粉碎機破碎，過60目篩；三、恆溫水浴鍋浸提；四、無機陶瓷微濾膜濃縮純化；五、通過截留分子量為4000～9000k的無機陶瓷超濾膜濃縮純化；六、將步驟五中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡小皮傘類多糖溶液經噴霧乾燥製成粉末，即得到不均一性安絡小皮傘類多糖產品，噴霧乾燥的進口溫度為170～210℃，出口溫度為80～95℃。本發明的製作方法成本低，製作得到的產品質量好，保質期長，密封條件下可保存2年以上不變質。
文檔編號C12R1/645GK102676609SQ20111044266
公開日2012年9月19日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者安德榮 申請人:西北農林科技大學