一種單細胞或組織微粒懸液的製備方法及用途的製作方法

2023-07-14 02:56:21

專利名稱：一種單細胞或組織微粒懸液的製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學技術領域，具體涉及一種使用方便、檢測方法準確性高的單 細胞或組織微粒懸液的製備方法及用途。
背景技術：
免疫組織化學、原位雜交及螢光原位雜交在病理工作中應用越來越普遍，對部分 病變的良惡性和組織細胞性質的確定、以及為放療、化療、抗激素治療、新近發展起來的靶 向治療、新輔助化療提供指標等都有重要作用。然而其質量影響因素較多以及原有陽性對 照方法麻煩對很多缺乏有自身陽性對照的病變，結果的判斷缺乏保障，導致診斷、治療的 不恰當，由此帶來的醫療糾紛也不斷上升。國外有人試用過蛋白質多肽作為陽性對照，但因 其沒有特定的細胞結構也就難以發揮作用。國內有人介紹因闌尾含有多種組織和細胞，可 作為多種抗原的對照，但極為局限。還有根據需要收集各種各樣的組織切成細絲包埋在一 起，然後連續切片備用；或類似於多組織切片用晶片儀將各種各樣的組織排列在一起進行 連續切片備用。但這些介紹的方法操作繁瑣；備用片相互摩擦影響難以運輸、保存，再用於 切片沒有保障；工作量增加較大，對照物體積大，試劑耗費要增加一倍。由於存在以上多種 缺陷，病理技師難以接受這些做法，使得這些方法在實際工作中無法推廣應用。建立對照的 傳統做法是一組檢測片只能通過切片方法設立一張陽性對照片作為對照，但是無論是機器 操作還是手工操作均不能保證每張玻片的檢測條件一致，如每一步驟的時間、試劑的用量、 效價程度或其它人為因素等均存在差異，都會造成部分結果的準確性很難判斷。目前在我 國不設立陽性對照是普遍存在的現象，也是不符合質量控制要求的。

發明內容
針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在於提供一種檢測操作過程簡 單，檢測結果準確性高的單細胞或組織微粒懸液的製備方法及用途。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於其製備方法如下步驟
1)切取並收集對照目標物豐富的組織，用10%中性福馬林固定液固定，或直接收集 留存已經確定有某些特定抗原、抗體標記陽性的用福馬林固定液及時固定後的組織備 用；
2)將步驟1)得到的組織切成為2mm-10mm的小塊，放入打碎器中，加入緩衝液進行打 碎l-2min，所述的組織與緩衝液的體積比為1 :1_100，棄去組織殘渣，得到含單細胞或組織 微粒的緩衝液；
3)將步驟2)中得到的含單細胞或組織微粒的緩衝液過濾，100-400目篩網過篩去除過 大細胞，再放入離心機中以2000-3000r/min的速度離心5-15min，棄去上層清液，向下層單 細胞或組織微粒中加入與其體積比為1 :1_5的緩衝液，充分震蕩後浸泡l_3h，離心棄去上 層清液，重複操作3-5次，直至無福馬林氣味溢出為止，得到洗淨的單細胞或組織微粒；
4)將步驟3)得到的單細胞或組織微粒放入保存液中保存，得到單細胞或組織微粒懸液，並進行塗片按常規免疫組織化學方法確定陽性細胞所佔比例，所述的單細胞或組織微 粒與保存液的體積比為ι :1-3，所述的保存液的製備取0. 05-0. lmol/L、PH為7. 4的三羥 甲基氨基甲烷100ml，加溫到60-70°C，加入優質明膠50_100mg，攪拌溶解後，冷卻至室溫， 加入0. 1-0. 8g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解後過濾製成。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於所述的緩衝液為含0. 02%NaN3的 磷酸緩衝液、生理鹽水或Tris緩衝液。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟2)所述的打碎器可為組織細 胞分離器，也可為豆漿機，用組織細胞分離器打碎時，組織切成2mm-3mm的小塊，用豆漿機 打碎時，組織切成3mm-10mm的小塊。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟2)所述的緩衝液加入體積為 組織體積的3-50倍，打碎時間Imin。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟3)所述的離心時間為 8-10min，優選時間為10 min。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟3)所述的浸泡時間為2h。所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟4)所述的單細胞或組織微粒 可以將處理後的不同微生物、不同腫瘤細胞、不同體細胞按使用方便和商品化的需要進行 組合為通用型的單細胞和組織微粒懸液。所述的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，其特徵在於在免疫組織化學等待檢樣 本進行組織切片後，在烤片過程中使用點塗器將對照用的單細胞或組織微粒懸液點塗在組 織附近，點塗面的最大徑為廣20mm，再在6(T8(TC烤片、抗原熱修復，或酶消化、DNA變性等 處理，進行免疫組織化學染色或原位雜交、螢光原位雜交，當對照物中著色的陽性細胞定位 清楚和陰性細胞背景乾淨，說明抗體和免疫組織化學方法可靠，待檢切片中的陽性或陰性 結果也可靠；應該陽性的抗體在對照物中為陰性，說明切片的陰性結果為假陰性；對應該 細胞核陽性的抗體在對照物中為細胞漿或細胞膜著色，說明抗體滴加或免疫組織化學方法 有問題；對照物中沒有很好的陰性細胞，說明切片的陽性結果為假陽性。所述的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，其特徵在於還可以根據顯色陽性細胞 數佔理論陽性細胞數的比例判斷待測樣本中的實際陽性細胞數。所述的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，其特徵在於所述的對照方法為內組合 式對照或外組合式對照。與現有技術相比，本發明存在如下有益效果
1)本發明通過將多種具有陽性對照意義或一種細胞具有多種陽性對照意義的單細胞 或組織微粒懸液進行組合達到有效的濃度，只要點一點於玻片上便可以成為「斑點式」對照 物，不需要對對照物進行切片，簡化了檢測步驟；
2)本發明製備的單細胞或組織微粒懸液通過等同原理還可以用於原位雜交、FISH技術 及一些病原體的染色，運用範圍廣；
3)本發明製備的單細胞或組織微粒懸液保存方便、易於長期保存、可反覆使用；
4)本發明製備的單細胞或組織微粒懸液使用時操作方便，步驟少，節省時間，而且可以 避免假陽性、假 陰性結果，確保了檢測結果的準確性，便於推廣、普及，有望全面輕鬆解決免 疫組織化學等原位檢測方法質量控制對照問題。
具體實施例方式以下 結合實施例對本發明作進一步的描述
一種單細胞或組織微粒懸液，由以下步驟製備而成1)先切取並收集對照目標物豐富 的組織，用10%中性福馬林固定液固定，或直接收集留存已經確定有某些特定抗原、抗 體標記陽性的用福馬林固定液及時固定後的組織；2)把組織切成為2mm-10mm的小塊， 放入打碎器中，加入體積為組織體積1-100倍的含0. 02%NaN3的磷酸緩衝液、生理鹽水或 Tris緩衝液，進行打碎l-2min，棄去組織殘渣，得到含單細胞或組織微粒的緩衝液，組織與 緩衝液優選體積比為1 :3-50，優選打碎時間lmin，所述的打碎器可為Medimachine組織細 胞分離器、豆漿機或多功能攪拌機等，用Medimachine組織細胞分離器打碎時，組織切成為 2mm-3mm的小塊，優選為2mm小塊，用豆漿機或多功能攪拌機打碎時，組織切成為3mm-10mm 的小塊，打碎方式最好選用點動法，即間歇式打碎；3)將上述緩衝液過濾，100-400目篩網 過濾除去過大的組織塊和細胞碎屑，如果沒有大細胞也可以不經過濾這一步，再放入離心 機中以2000-3000r/min的速度離心5-15min，棄去上層清液，向下層單細胞或組織微粒 中加入與其體積比為1 :1_5的緩衝液，充分震蕩後浸泡l_3h，離心棄去上層清液，重複操 作3-5次，直至無福馬林氣味溢出為止，得到洗淨的單細胞或組織微粒，優選離心時間 為8-lOmin，最優為10 min，優選浸泡時間為2h，所述的磷酸緩衝液也可不含NaN3成分；4) 將上述的單細胞或組織微粒放入保存液中保存，得到單細胞或組織微粒懸液，並進行塗片 按常規免疫組織化學方法確定陽性細胞所佔比例，所述的單細胞或組織微粒與保存液的體 積比為1 :1_3，所述的保存液的製備取0.05-0. lmol/L、PH為7. 4的三羥甲基氨基甲烷 100ml，加溫到60-70°C，加入優質明膠50-100mg，攪拌溶解後，冷卻至室溫，加入0. 1-0. 8g 牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解後過濾製成。所述的單細胞或組織微粒可以將處理後 的不同微生物、不同腫瘤細胞、不同體細胞按使用方便和商品化的需要進行組合為通用型 的單細胞和組織微粒懸液。本發明的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，在免疫組織化學等待檢樣本進行組 織切片後，在烤片過程中使用點塗器將對照用的單細胞或組織微粒懸液點塗在組織附近， 點塗面的最大徑為廣20mm，再在6(T80°C烤片、抗原熱修復，或酶消化、DNA變性等處理，進 行免疫組織化學染色或原位雜交、螢光原位雜交，將染色結果進行對照當對照物中著色的 陽性細胞定位清楚和陰性細胞背景乾淨，說明抗體滴加和免疫組織化學方法可靠，待檢切 片中的陽性或陰性結果也可靠；應該陽性的抗體在對照物中為陰性，說明切片的陰性結果 為假陰性；應該細胞核陽性的抗體在對照物中為細胞漿或細胞膜著色，說明抗體滴加或免 疫組織化學方法有問題；對照物中沒有很好的陰性細胞，說明切片的陽性結果為假陽性。本 發明還可以根據顯色陽性細胞數佔理論陽性細胞數的比例判斷待測樣本中的實際陽性細 胞數，看是否存在偏差。上述的對照方法為內組合式對照或外組合式對照，所述的內組合式對照，是指按 需要將不同的細胞或組織微粒組合後構成單細胞或組織微粒懸液再點塗式對照，即單細胞 或組織微粒中含有多種不同類型的細胞，點一點就可以對照多種待測樣品，所述的外組合 式對照，將含有需要的不同的單細胞懸液分別點塗，對待測樣品進行對照。本發明通過將不 同的單細胞或組織微粒混合構成組合式、通用型的單細胞或組織微粒懸液，可以發揮多用途的適用於多種對照對象，減少陽性對照試劑的種類，建立對照時不需要從紛繁的試劑中 去選擇，以免給使用者帶來新的麻煩，或出錯。本發明在選取組織時，採用已固定的組織製作單細胞或組織微粒，這樣不僅細胞 或組織微粒的形態在製作過程中變形小，而且也不需要進行酶的消化處理，本發明還可選 擇脫落細胞或培養細胞製作單細胞或組織微粒。選用腫瘤組織時，可以選擇上皮性、間葉 性，也可以是淋巴造血組織腫瘤，最好是惡性腫瘤，因為其實質細胞黏附性差，容易成為單 細胞或組織微粒，也可以利用相關細胞系的培養物。有利用價值的病原體的樣本可以為結 核、人乳頭瘤病毒(HPV)、EB病毒、幽門螺桿菌(HP)等感染的組織或培養 物。如針對乳腺可 選擇ER + ,PR +、AR +、GCDFP-15 +或c-erbB_2 +的乳腺癌組織(它們也可作為CK、CK5/6、 CK7、CK8、CK18、CK34 β Ε12、E-cadherin、Ki_67、P53、Topo II、PCAN、SMA, Calponin、P63、 CD34、CD31、CycIinDl等抗體的陽性對照組織)，還可選用Her2蛋白(c-erbB_2)表達+、++、 +++組織或細胞樣本。在組織打碎時選用的打碎器，當組織樣本量較少時可選用Medimachine組織細胞 分離器，組織塊要切成約2mm的小塊，一次切割時間不超過2分鐘為宜；樣本量多時最好 選用有200 μ m孔徑濾網的豆漿機或多功能攪拌機，最好採用點動，此時組織塊可以大一些 3mm-10mm，但明顯的脂肪和纖維組織要儘量去除，豆漿機或多功能攪拌機的刀刃不要過於 鋒利，要有切刮的作用就行，打碎之後緩衝液渾濁時及時收集，大的殘渣或碎片在濾網內， 富含單細胞或組織微粒的緩衝液，在單細胞或組織微粒收集孔和篩網外，反覆重新添加緩 衝液和新組織如前操作，在將組織放入機器中，加入足夠的緩衝液，以保證單細胞或組織微 粒是在液體中從組織上分離下來，並隨即進入液體中以減少擠壓變形的影響。因為切取出來的組織經福馬林浸泡過，在製成懸液之前要先用大量的緩衝液進 行多次充分洗滌，除去夾雜在組織裡面的福馬林，此過程中單細胞或組織微粒需過夜或 來不及及時進行下一次清洗可在足量的緩衝液中於4°C冰箱中臨時存放。製成單細胞或組 織微粒懸液時，要對單細胞或組織微粒進行普通塗片觀察其形態，注意有無過大細胞團、過 多細胞碎屑，並進行相關免疫組織化學，與來源組織切片進行比較，確定效果是否滿意，即 判斷單細胞或組織微粒的陽性部位或陽性強度與來源組織切片是否相互應證，陽性部位相 同、陽性強度一致說明該單細胞或組織微粒懸液製作成功，所述的陽性部位是指細胞膜、細 胞核、細胞漿或特定細胞器所在部位。本發明的單細胞或組織微粒懸液在4°C冰箱內可長期存放，不變質，但如果用作 ER、ra對照，必須用半年內製作的單細胞或組織微粒；其餘均可一年以上，用作抗酸染色對 照的可五年以上。所述的單細胞和組織微粒的濃度加離心後下沉細胞體積的1-3倍的緩衝 液稀釋混勻即可，也可用細胞計數板計數細胞的濃度等待組合，最好在組合後確定陽性細 胞所佔的比例範圍，保證用於對照的陽性細胞要每中倍視野(20倍視野)有50個以上，可含 有一定量的組織微粒。本發明在組合時可將不同組織具有不同抗原性的細胞進行搭配，可按基本大類來 分，如CK系列、CD系列、激素受體及靶向治療系列等；也可按組織、器官，或腫瘤大類來分。 根據點塗對照物的面積中各細胞的有效數量，組合成可直接使用的通用式的組合式單細胞 懸液對照物。還可按膜、漿、核陽性設立點外獨立陽性、陰性組合式對照，也可將微生物與細 胞進行組合。
本發明所用的點塗器具，可以用專用盛放對照用細胞試劑組合器具，配以排式點 塗器具，如吸水的棉籤、竹籤、吸管、液體張力環、瓶口可形成張力膜的瓶、轉移液體膜式滴 瓶、排槍、排筆等。
對照物中總會有陰性的細胞存在。細胞的形態完全可以滿足對照觀察的要求。對 照物中著色的陽性細胞定位清楚和陰性細胞背景乾淨，說明抗體和免疫組織化學方法可 靠，待檢切片中的陽性或陰性結果也可靠；如果應該陽性的抗體在對照物中為陰性，說明切 片的陰性結果為假陰性；對應該細胞核陽性的抗體在對照物中為細胞漿著色，說明抗體或 免疫組織化學方法有問題；對照物中沒有很好的陰性細胞，說明切片的陽性結果為假陽性。 還可以根據顯色陽性細胞數佔理論陽性細胞數的比例判斷是否存在偏差，可大概估算待測 樣本中的實際陽性細胞數，如對照樣中理論陽性細胞數30個，而試驗檢測出為20個，說明 有存在偏差，試驗的陽性細胞數佔總陽性細胞數的2/3，而根據試驗中待測樣本的陽細胞數 乘以1.5倍即為實際待測樣品的陽細胞數，有定量檢測的作用。該方法針對最迫切需要解決的免疫組織化學、原位雜交等組織、細胞等原位檢測 對照問題，將多種具有陽性對照意義及一種細胞具有多種陽性對照意義的單細胞懸液進行 組合達到有效的濃度，只要點一點於玻片上便可以成為「斑點式」對照物，與切片一起進行 免疫組織化學染色，不需要對對照物進行切片，完全改變了傳統的做法，易於長期保存、反 復使用，便於推廣、普及，有望全面輕鬆解決免疫組織化學等原位檢測等質量控制對照問 題。組合式單細胞懸液作為對照的方法還可以用於原位雜交、FISH技術及一些病原體的染 色。
權利要求
一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於其製備方法如下步驟1)切取並收集對照目標物豐富的組織，用10%中性福馬林固定液固定，或直接收集留存已經確定有某些特定抗原、抗體標記陽性的用福馬林固定液及時固定後的組織備用；2)將步驟1)得到的組織切成為2mm 10mm的小塊，放入打碎器中，加入緩衝液進行打碎1 2min，所述的組織與緩衝液的體積比為11 100，棄去組織殘渣，得到含單細胞或組織微粒的緩衝液；3)將步驟2)中得到的含單細胞或組織微粒的緩衝液過濾，100 400目篩網過篩去除過大細胞，再放入離心機中以2000 3000r/min的速度離心5 15min，棄去上層清液，向下層單細胞或組織微粒中加入與其體積比為11 5的緩衝液，充分震蕩後浸泡1 3h，離心棄去上層清液，重複操作3 5次，直至無福馬林氣味溢出為止，得到洗淨的單細胞或組織微粒；4)將步驟3)得到的單細胞或組織微粒放入保存液中保存，得到單細胞或組織微粒懸液，並進行塗片按常規免疫組織化學方法確定陽性細胞所佔比例，所述的單細胞或組織微粒與保存液的體積比為11 3，所述的保存液的製備取0.05 0.1mol/L 、PH為7.4的三羥甲基氨基甲烷100ml，加溫到60 70℃，加入優質明膠50 100mg，攪拌溶解後，冷卻至室溫，加入0.1 0.8g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解後過濾製成。
2.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於所述的緩衝液為含 0. 02%NaN3的磷酸緩衝液、生理鹽水或Tris緩衝液。
3.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟2)所述的打碎 器可為組織細胞分離器，也可為豆漿機，用組織細胞分離器打碎時，組織切成2mm-3mm的小 塊，用豆漿機打碎時，組織切成3mm-10mm的小塊。
4.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟2)所述的緩衝 液加入體積為組織體積的3-50倍，打碎時間lmin。
5.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟3)所述的離心 時間為8-10min，優選為10 min。
6.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟3)所述的浸泡 時間為2h。
7.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液，其特徵在於步驟4)所述的單細 胞或組織微粒可以將處理後的不同微生物、不同腫瘤細胞、不同體細胞按使用方便和商品 化的需要進行組合為通用型的單細胞和組織微粒懸液。
8.根據權利要求1所述的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，其特徵在於在免疫組織 化學等待檢樣本進行組織切片後，在烤片過程中使用點塗器將對照用的單細胞或組織微粒 懸液點塗在組織附近，點塗面的最大徑為廣20mm，再在6(T8(TC烤片、抗原熱修復，或酶消 化、DNA變性等處理，進行免疫組織化學染色或原位雜交、螢光原位雜交，當對照物中著色的 陽性細胞定位清楚和陰性細胞背景乾淨，說明抗體和免疫組織化學方法可靠，待檢切片中 的陽性或陰性結果也可靠；應該陽性的抗體在對照物中為陰性，說明切片的陰性結果為假 陰性；對應該細胞核陽性的抗體在對照物中為細胞漿或細胞膜著色，說明抗體滴加或免疫 組織化學方法有問題；對照物中沒有很好的陰性細胞，說明切片的陽性結果為假陽性。
9.根據權利要求8所述的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，其特徵在於還可以根據2顯色陽性細胞數佔理論陽性細胞數的比例判斷待測樣本中的實際陽性細胞數。
10.根據權利要求8所述的一種單細胞或組織微粒懸液的用途，其特徵在於所述的對 照方法為內組合式對照或外組合式對照。
全文摘要
一種單細胞或組織微粒懸液，屬於生物醫學技術領域。它由下列步驟製備而成1)組織樣品的收集；2)單細胞或組織微粒的緩衝液製作；3)單細胞或組織微粒的緩衝液洗滌；4)單細胞或組織微粒懸液的製備。本發明通過將多種具有陽性對照意義的單細胞或組織微粒或一種具有多種陽性對照意義的單細胞或組織微粒進行組合，只要點一點該懸液即可作為對照物，不需要進行切片，簡化了檢測步驟；還可以用於原位雜交、FISH技術及一些病原體的染色，運用範圍廣；單細胞或組織微粒懸液保存方便、易於長期保存、可反覆使用；確保了檢測結果的準確性，便於推廣、普及，有望全面輕鬆解決免疫組織化學等原位檢測方法質量控制對照問題。
文檔編號G01N1/30GK101957282SQ20101051272
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月20日 優先權日2010年10月20日
發明者任興昌, 劉衛豔 申請人:杭州市中醫院