一種用於地溝油檢測的試劑盒及其檢測方法
2023-07-14 02:38:21 1
一種用於地溝油檢測的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於地溝油檢測的試劑盒，該試劑盒包括由外引物Ⅰ、外引物Ⅱ、內引物Ⅰ和內引物Ⅱ配製而成的檢測引物溶液；具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶；10×反應緩衝液；dNTPs溶液；陽性DNA對照樣品；陰性DNA對照樣品。同時本發明還公開了該試劑盒的檢測方法。本發明具有高特異性，且具有快速高效、操作簡便，檢測成本低的特點，適合現場快速檢測。
【專利說明】一種用於地溝油檢測的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種用於地溝油檢測的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]地溝油是一種衛生極差，過氧化值、酸價、水分、羰基價、丙二醛、黃麴黴毒素等嚴重超標的非食用油。產生途徑主要有以下幾種:一是由下水道的一些油膩漂浮物，還有餐廚廢棄油中的一些油膩物質，經過簡單的加工提煉而來；還有一種是從動物內臟等組織提煉出來的油脂；其三就是經過反覆油炸的油脂。地溝油中如黃麴黴素、苯並(a)芘、反式脂肪酸等各種有毒物質，長期食用對人體傷害很大，嚴重威脅這人類的健康。近年來，國內有關地溝油的報導以及地溝油引起的食品安全問題引起了人們的高度關注。
[0003]國外對地溝油檢測方法報導較少，但由於制訂一系列法規，使地溝油很難再進入食用油市場，研究主要關注廢棄油脂綜合利用及食用油摻偽和種類區分。
[0004]近年來，各種地溝油的檢測方法層出不群，2011年12月，衛生部向社會廣泛公開徵集「地溝油」檢測方法，共收到762份關於檢驗方法或檢驗指標的建議。其中，有281個單位和個人提交了 315項「地溝油」檢測方法，組建了包括油脂加工、食品安全、衛生檢驗、化學分析等領域權威專家和相關機構在內的檢驗方法論證專家組，通過盲樣測試等方式對徵集到的方法進行了科學論證，發現這些方法特異性都不強。
[0005]朱旭平等通過對樣品油所含的外源動物基因進行螢光定量PCR檢測的方法對地溝油進行了檢測。其原理為:地溝油主要是由各種潲水、用於油炸食品中的油、劣質動物肉、內臟、毛皮等加工及提煉後產出的油煉製而成，這些原料在煎炸烹飪和回收過程中往往會含有一些動物性原料，因此含有其相應的核酸成分，如豬、牛和魚類等哺乳動物的特徵基因殘留。目前市面上的合格食用油多為植物油，不存在動物性基因成分。因此，通過判斷樣品油中是否含有動物性基因成分，就可以推斷該樣品油是否為地溝油，或者樣品油中是否混有地溝油。該檢測方法在部分樣品的檢測中取得較好的效果，但地溝油的來源多樣、加工工藝不同，有的地溝油經過高溫、粉碎、攪拌等生產處理，細胞核基因組往往被破壞，因此，該方法採用細胞核基因組基因作為檢測的對象，檢測的特異性不強，無法達到地溝油有效鑑定的預期目的。
[0006]專利(201110456243.2)以樣品油中不應存在的動物外源成分作為地溝油的鑑別依據，以動物外源成分的線粒體特徵DNA為檢測的具體靶標，建立了基於此原理的螢光定量PCR擴增技術檢測線粒體DNA地溝油的方法。但該方法操作繁瑣、需要專門的特殊儀器，不適合現場快速檢測。
[0007]LAMP技術是由日本榮研化學株式會社在2000年開發的一種新的基因擴增技術，該技術的基本特點是:①恆溫擴增:整個擴增反應在恆溫條件(6(T65°C)進行，不需要特殊儀器設備；②快速高效:整個擴增和產物檢測可在Ih內完成；③高特異性:針對靶標序列6個區域設計4條檢測引物，擴增特異性高；④高靈敏度:檢測極限可低至10個拷貝或更低；⑤鑑定簡便:擴增產物有多種鑑定方法，如肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應管內沉澱的濁度變化、加入染料觀察顏色變化等。
[0008]LAMP方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高等特點、不需要特殊儀器，適合現場快速檢測，在轉基因植物檢測領域具有廣闊的應用前景。目前尚未有利用LAMP方法檢測動物線粒體特徵DNA序列、引物組，構建地溝油的檢測試劑盒。
【發明內容】
[0009]本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、高效的用於地溝油檢測的試劑盒。
[0010]本發明所要解決的另一個技術問題是該用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法。
[0011]為解決上述問題，本發明所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，包括
一檢測引物溶液:由濃度為4飛MmoI/L的外引物1、濃度為4飛MmoI/L的外引物I1、濃度為32?48 Mfl1l/L的內引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內引物II配製而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—1X 反應緩衝液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成；
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA。
[0012]所述脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0013]所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0014]所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0015]所述內引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0016]所述內引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0017]該試劑盒還包括顯色劑1000XSYBR GREEN I螢光染料。
[0018]如上所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
⑴提取待測樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩衝液，然後加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重複5?20次，所得水相即為待測樣品DNA ；
⑵配製待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管I內加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑶配製對照樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管II內加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應管III內加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑷分別對所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應；
(5)LAMP擴增結果的鑑定:通過肉眼觀察或利用濁度儀分別觀察所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果，或取2飛μ?擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；
(6)當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；
⑴當檢測結果為陰性時，若所述待測樣品DNA的濃度偏差小於同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度的1%時，則判定樣品為地溝油；
⑶當檢測結果為陰性時，若所述待測樣品DNA的濃度與同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度相等時，則將所述待測樣品DNA轉移至離心管II中；
⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻後經65°C水浴lOmin，期間顛倒數次；然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻後靜置1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻後於_20°C冰箱靜置過夜沉澱DNA，然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉澱物；該沉澱物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最後，沉澱物自然晾乾，並加50μ L TE緩衝液溶解，_20°C保存，即得純化的待測樣品DNA ；
(11)配製純化的待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管IV內加入所述純化的待測樣品DNA 2飛μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應緩衝液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 uL；
(12)分別將所述PCR反應管I1、PCR反應管II1、PCR反應管IV重複所述步驟⑷?(5)，當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；當檢測結果為陰性時，即判定樣品為市售標準油脂。
[0019]如上所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
⑴提取待測樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩衝液，然後加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重複5?20次，所得水相即為待測樣品DNA ；
⑵配製待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管I內加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑶配製對照樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管II內加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應管III內加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑷分別對所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應；
(5)LAMP擴增結果的鑑定:在LAMP擴增產物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果；
(6)當出現綠色，則為陽性，即判定樣品為地溝油；
(7)當出現橙色，則為陰性，若所述待測樣品DNA的濃度偏差小於同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度的1%時，則判定樣品為地溝油；
(8)當出現橙色，則為陰性，若所述待測樣品DNA的濃度與同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度相等時，則將所述待測樣品DNA轉移至離心管II中；
⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻後經65°C水浴lOmin，期間顛倒數次；然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻後靜置1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻後於_20°C冰箱靜置過夜沉澱DNA，然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉澱物；該沉澱物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最後，沉澱物自然晾乾，並加50μ L TE緩衝液溶解，_20°C保存，即得純化的待測樣品DNA ；
(11)配製純化的待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管IV內加入所述純化的待測樣品DNA 2飛μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應緩衝液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 uL；
(12)分別將所述PCR反應管I1、PCR反應管II1、PCR反應管IV重複所述步驟⑷?(5)，當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；當檢測結果為陰性時，即判定樣品為市售標準油脂。
[0020]本發明與現有技術相比具有以下優點:
1、由於線粒體DNA具有分子量小、拷貝數多和結構穩定等特點，因此，本發明中的脊椎動物線粒體高度保守DNA序列可作為動物性外源成分鑑定和物種分類等技術的理想靶基因。
[0021]2、本發明中脊椎動物線粒體高度保守DNA序列僅存在於脊椎動物，而在細菌、古菌、真菌和綠色植物線粒體中則不存在，因此，作為LAMP技術檢測地溝油識別、鑑定的依據，使本發明的檢測試劑盒檢測地溝油的準確率更高。
[0022]3、本發明以樣品中不應存在的動物源性成分作為鑑別依據，以動物線粒體DNA為檢測靶標，試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性，且具有快速高效、操作簡便，在不到I小時即可完成檢測。
[0023]4、本發明的檢測試劑盒只需一個恆定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低，適合現場快速檢測。
[0024]5、本發明的基因快速診斷試劑盒鑑定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物一焦磷酸鎂沉澱，可通過肉眼觀察鑑定，並且加入顯色液後，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。
[0025]6、利用環介導等溫擴增技術(LAMP)技術檢測地溝油，本發明試劑盒及檢測方法具有很好的通用性和特異性。
[0026]⑴測試樣品:分別含有食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚等動物的總DNA樣品的大豆油；市場上常見的大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調調和油；2種模擬地溝油樣品。
[0027]用實施例廣2中所述試劑盒及檢測方法進行試驗，測試結果顯示所有含有動物的總DNA樣品的大豆油(1、2、3、4、5、6)和陽性對照(P)反應管顯現出典型擴增曲線，肉眼觀察有沉澱產生，表明含有動物源性成分，是地溝油；市場上常見的大豆油(7)、花生油(8)、玉米油(9)、橄欖油(10)和3種植物調和油(11、12、13)和陰性對照(N)顯現橙色一致，無典型擴增曲線，肉眼觀察無沉澱產生，表明不含有動物源性成分(參見圖1)。
[0028]⑵測試樣品:分別含有食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚等動物的總DNA樣品的大豆油；市場上常見的大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調和油；2種模擬地溝油樣品。
[0029]用實施例3?4中所述試劑盒及檢測方法進行試驗，測試結果顯示所有含有動物的總DNA樣品的大豆油和2種模擬地溝油樣品反應管顯現綠色，市場上常見的大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調和油顯現橙色(參見圖2)。
[0030]5、經測試，本發明試劑盒及檢測方法的靈敏度可達0.01 ng/μ L0
[0031]測試樣品為含有牛總DNA的大豆油樣品所提DNA樣品依次稀釋而成。樣品中牛總 DNA 的濃度分別為:160ng/μ L、80 ng/μ L、40 ng/μ L、20 ng/μ L、1ng/μ L、lng/μ L、0.lng/μ L、0.0lng/μ L、0.0Olng/μ L 和 0.000lng/μ L。
[0032]樣品中牛總DNA 的濃度分別為 160ng/y L(-2)、80 ng/μ L(-3),40 ng/μ L(-4),20 ng/μ L (-5)U0ng/y L (-6)、lng/μ L (-7+),0.lng/ μ L (-8+),0.0lng/μ L (-9+)和陽性對照(P)的測試反應管中均呈現綠色，而0.0Olng/μ L (-10-),0.0OOlng/μ L (-11-)和陰性對照(N)顯現橙色(參見圖3)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0034]圖1為本發明LAMP檢測(無顯色劑)方法的通用性和特異性實驗結果圖。
[0035]圖2為本發明LAMP檢測(有顯色劑)方法的通用性和特異性實驗結果圖。
[0036]圖3為本發明LAMP靈敏度檢測結果圖。圖中管子上方:N為陰性對照屮為陽性對照；數字表示1X梯度稀釋倍數。
【具體實施方式】
[0037]實施例1 一種用於地溝油檢測的試劑盒，包括
一檢測引物溶液:由濃度為4飛Mmol/L的外引物1、濃度為4飛Mmol/L的外引物I1、濃度為32?48 Mmol/L的內引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內引物II配製而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—1X 反應緩衝液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成；
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA。
[0038]其中:
脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0039]外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0040]外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0041]內引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0042]內引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0043]實施例2 —種用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
⑴提取待測樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩衝液，然後加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重複5?20次，所得水相即為待測樣品DNA ；
⑵配製待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管I內加入待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、BstDNA聚合酶IyLUOX反應緩衝液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25μ L ；
⑶配製對照樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管II內加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應管III內加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑷分別對PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min,80°C孵育5min終止反應；
(5)LAMP擴增結果的鑑定:通過肉眼觀察或利用濁度儀分別觀察PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果，或取2飛μ?擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；
(6)當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；
⑴當檢測結果為陰性時，若待測樣品DNA的濃度偏差小於同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度的1%時，則判定樣品為地溝油；
⑶當檢測結果為陰性時，若待測樣品DNA的濃度與同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度相等時，則將所測樣品DNA轉移至離心管II中；
(9)在離心管II中加入100μ L 20% SDS,混勻後經65°C水浴lOmin，期間顛倒數次；然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻後靜置lOmin，室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；苯酹_氯仿_異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在離心管IV中，按上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻後於_20°C冰箱靜置過夜沉澱DNA，然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉澱物；該沉澱物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最後，沉澱物自然晾乾，並加50 μ L TE緩衝液溶解，-20°C保存，即得純化的待測樣品DNA ；
(11)配製純化的待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管IV內加入純化的待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
(12)分別將PCR反應管I1、PCR反應管II1、PCR反應管IV重複步驟⑷?(5)，當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；當檢測結果為陰性時，即判定樣品為市售標準油脂。
[0044]實施例3 —種用於地溝油檢測的試劑盒，包括
一檢測引物溶液:由濃度為4飛Mmol/L的外引物1、濃度為4飛Mmol/L的外引物I1、濃度為32?48 Mmol/L的內引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內引物II配製而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—10Χ 反應緩衝液:200 mmol/L且pH= 8.8 的Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 舌甘菜喊;
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA 一顯色劑:1000XSYBR GREEN I螢光染料。
[0045]其中:
脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0046]外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0047]外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0048]內引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0049]內引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0050]實施例4 一種用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
⑴提取待測樣品DNA:
在2mL離心管I中加入400μ? TE緩衝液，然後加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重複5?20次，所得水相即為待測樣品DNA ；
⑵配製待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管I內加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑶配製對照樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管II內加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應管III內加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑷分別對PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min,80°C孵育5min終止反應；
(5)LAMP擴增結果的鑑定:在LAMP擴增產物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果；
(6)當出現綠色，則為陽性，即判定樣品為地溝油；
(7)當出現橙色，則為陰性，若待測樣品DNA的濃度偏差小於同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度的1%時，則判定樣品為地溝油；
(8)當出現橙色，則為陰性，若待測樣品DNA的濃度與同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度相等時，則將待測樣品DNA轉移至離心管II中；
(9)在離心管II中加入100μ L 20% SDS,混勻後經65°C水浴lOmin，期間顛倒數次；然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中；
(10)在離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻後靜置lOmin，室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；苯酹_氯仿_異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液；
在離心管IV中，按上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻後於_20°C冰箱靜置過夜沉澱DNA，然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉澱物；該沉澱物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最後，沉澱物自然晾乾，並加50 μ L TE緩衝液溶解，-20°C保存，即得純化的待測樣品DNA ；
(11)配製純化的待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管IV內加入純化的待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
(12)分別將PCR反應管I1、PCR反應管II1、PCR反應管IV重複所述步驟⑷?(5)，當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；當檢測結果為陰性時，即判定樣品為市售標準油脂。
[0051]應該理解，這裡討論的實施例和實施方案只是為了說明，對熟悉該領域的人可以提出各種改進和變化，這些改進和變化將包括在本申請的精神實質和範圍以及所附的權利要求範圍內。
【權利要求】
1.一種用於地溝油檢測的試劑盒，包括 一檢測引物溶液:由濃度為4飛MmoI/L的外引物1、濃度為4飛MmoI/L的外引物I1、濃度為32?48 Mfl1l/L的內引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內引物II配製而成； 一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ； —1X 反應緩衝液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成； —dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成； 一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品； 一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA。
2.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，其特徵在於:所述脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
3.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，其特徵在於:所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
4.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，其特徵在於:所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
5.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，其特徵在於:所述內引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
6.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，其特徵在於:所述內引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
7.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒，其特徵在於:該試劑盒還包括顯色劑1000 X SYBR GREEN I螢光染料。
8.如權利要求1所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟: ⑴提取待測樣品DNA: 在2mL離心管I中加入400μ? TE緩衝液，然後加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重複5?20次，所得水相即為待測樣品DNA ； ⑵配製待測樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 μ L PCR反應管I內加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ； ⑶配製對照樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 uL PCR反應管II內加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ； 在200 μ L PCR反應管III內加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ； ⑷分別對所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應； (5)LAMP擴增結果的鑑定:通過肉眼觀察或利用濁度儀分別觀察所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果，或取2飛μ?擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果； (6)當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油； ⑴當檢測結果為陰性時，若所述待測樣品DNA的濃度偏差小於同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度的1%時，則判定樣品為地溝油； ⑶當檢測結果為陰性時，若所述待測樣品DNA的濃度與同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度相等時，則將所述待測樣品DNA轉移至離心管II中； ⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻後經65°C水浴lOmin，期間顛倒數次；然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中； (10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻後靜置1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液； 在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻後於_20°C冰箱靜置過夜沉澱DNA，然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉澱物；該沉澱物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最後，沉澱物自然晾乾，並加50μ L TE緩衝液溶解，_20°C保存，即得純化的待測樣品DNA ； (11)配製純化的待測樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 uL PCR反應管IV內加入所述純化的待測樣品DNA 2飛μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應緩衝液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 uL； (12)分別將所述PCR反應管I1、PCR反應管II1、PCR反應管IV重複所述步驟⑷?(5)，當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；當檢測結果為陰性時，即判定樣品為市售標準油脂。
9.如權利要求7所述的一種用於地溝油檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟: ⑴提取待測樣品DNA: 在2mL離心管I中加入400μ? TE緩衝液，然後加入食用油lmL，漩渦震蕩混勻:T8min，室溫下13000r/min離心5min，去除上層油脂，留下層水相，在所述離心管I中再次加入食用油lmL，顛倒混勻，離心，共重複5?20次，所得水相即為待測樣品DNA ； ⑵配製待測樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 μ L PCR反應管I內加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到.25 μ L ； ⑶配製對照樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 uL PCR反應管II內加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到.25 μ L ； 在200 μ L PCR反應管III內加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩衝液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到.25 μ L ； ⑷分別對所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應； (5)LAMP擴增結果的鑑定:在LAMP擴增產物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果； (6)當出現綠色，則為陽性，即判定樣品為地溝油； (7)當出現橙色，則為陰性，若所述待測樣品DNA的濃度偏差小於同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度的1%時，則判定樣品為地溝油； (8)當出現橙色，則為陰性，若所述待測樣品DNA的濃度與同等條件下市售標準油脂樣品處理後的濃度相等時，則將所述待測樣品DNA轉移至離心管II中； ⑶在所述離心管II中加入100 μ L 20% SDS,混勻後經65°C水浴lOmin，期間顛倒數次；然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到上清液I，該上清液I移至離心管III中； (10)在所述離心管III中加入等體積的Tris和苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻後靜置.1min,室溫下13000r/min離心5min,得到上清液II,該上清液II移至離心管IV中；所述苯酚-氯仿-異戊醇混合液是指將苯酚、氯仿、異戊醇按25 mL:24 mL:1 mL的體積比混合而成的溶液； 在所述離心管IV中，按所述上清液II的體積的0.7倍加入異丙醇，顛倒混勻後於_20°C冰箱靜置過夜沉澱DNA，然後在溫度為4°C、速率為13000r/min的條件下離心10 min，得到沉澱物；該沉澱物用體積濃度為70%的乙醇洗滌2次，最後，沉澱物自然晾乾，並加50μ L TE緩衝液溶解，_20°C保存，即得純化的待測樣品DNA ； (11)配製純化的待測樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 uL PCR反應管IV內加入所述純化的待測樣品DNA 2飛μ L、檢測引物溶液.1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUOX反應緩衝液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 uL； (12)分別將所述PCR反應管I1、PCR反應管II1、PCR反應管IV重複所述步驟⑷?(5)，當檢測結果為陽性時，即判定樣品為地溝油；當檢測結果為陰性時，即判定樣品為市售標準油脂。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328193SQ201410636580
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】徐紅偉, 臧榮鑫 申請人:西北民族大學