通過不同基因的五個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒的製作方法

2023-07-13 19:15:21 1

專利名稱：通過不同基因的五個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測肺癌易感性的試劑盒，通過同時檢測多 聚ADP核糖轉移酶家族成員1 (poly(ADP-ribose) polymerase family, member l,PARPl,又簡寫為ADPRT)、 細胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450, family 1， subfamily A， polypeptide 1, CYPlAl )、 X射線交錯 互補修復基因1 (X-ray repair cross--complementing gene 1， XRCCO和切除修復複合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2)的單核苷酸多態性位點 (SNP)來預測個體對肺癌的易感性。
背景技術：
原發性支氣管肺癌，簡稱肺癌，為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重威脅人類健康和 生命的疾病。腫瘤細胞源於支氣管黏膜或腺體，常有區域性淋巴結和血行轉移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道症狀，病情進展速度與細胞的生物特性有關。半個世紀以來，世界各國肺癌的發病率和病死率都有明顯增高趨勢。世界衛生組織(WHO)2000年報告 1997年全世界死於惡性腫瘤的共706.5萬人，佔死亡人數的12.6%,其中肺癌佔惡性腫瘤死亡的19%,居 惡性腫瘤死因的第一位。我國1990 1992年的抽樣調査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第1位，農村上升最快的也是肺癌。雲南錫礦的肺癌發病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1960 1969年間為197.87/10萬，1970 1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的。英國 著名腫瘤學家R.Peto預言如果我國不及時控制吸菸和空氣汙染，到2025年我國每年肺癌將超過100萬， 成為世界第一肺癌大國。病因和發病機制迄今尚未明確。 一致認為肺癌的發病與下列因素有關①吸菸(包括主動吸菸和被動 吸菸)；②職業致癌因子，己被確認的致人類肺癌的職業因素包括石棉、無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環芳烴、菸草的加熱產物等；③空氣汙染 (包括室內小環境和室外大環境汙染) 電離輻射⑤飲食與營養，美國紐約和芝加哥開展的前瞻性人群觀察的結果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿蔔素的攝入量與十幾年後癌症的發生呈負相關，其中最突出的是肺癌；⑥其他，美國癌症學會將結核列為肺癌的發病因素之一。有結核病者患肺癌的危險性是 正常人群的10倍。其主要組織學類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃麴黴)、機體免疫功能低下、 內分泌失調以及家族遺傳等因素，對肺癌的發生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發生與某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關。己經證明的幾個癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細胞肺癌中均有過度表達。 非小細胞肺癌中則常可見ras族基因的過度表達。這些深入的研究將為基因預防和治療肺癌提供理論基礎。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態性標記，是一類基於單鹼基變異引起的DNA 多態性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性， 包括單鹼基轉換、顛換，以及單鹼基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態性標記，佔 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是複雜疾病的易感 性和對環境因素、藥物反應的差異。PARPl基因位於第l號染色體lq41"q42位置，全長47,3kb， mRNA全長3861bp,共有23個外顯子， 編碼1015胺基酸的多聚ADP核糖轉移酶蛋白。這種酶通過聚ADP核糖基化反應修正多種核蛋白。這種 修正以DNA為基礎，參與多種重要的細胞活動，例如分化，增殖，腫瘤轉移等，同時也參與分子水平 的活動，例如修復DNA受損的細胞等等。PARP1的主要功能通常被描述為3個方面1. DNA修復功能 (BER); 2.抑制受損DNA的轉錄；3.耗盡細胞中的能量，導致細胞凋亡；4.參與部分基因的轉錄調控。 這些功能可以修復細胞中受損的DNA,抑制破損DNA的轉錄，甚至殺死無法修復的細胞，達到抑制癌症 發生的作用。研究發現，PARP1功能缺失會提髙乳腺癌，肺癌等癌症的發病率。
rel136410是位於第1號染色體上PARP1華但上的，個T/C多態，弓l起PARP1基因編碼的蛋白第762 個胺基酸由Val變為Ala。 NCBI公布的世界人fe中的該多態的頻率分布，T佔0.808， C佔0.192左右，雜 合度為0.311。分子生物學研究表明，PARP1上762號胺基酸由Val轉化為Ala,降低了瞎的活性，導致多 種癌症的發生風險升高。大樣本的中國人群的關聯分析顯示，該位點的多態現象是中國人群中重要的肺癌影響因素之一。CYP1A1基因位於第15號染色體15q22-q24位置，全長6.0kb, mRNA全長2601bp，共有7個外顯子， 編碼513個胺基酸的細胞色素P450A1。 P4501A1是重要的活化多環芳烴類致癌物的主要酶類，被激活的 CYP1A1能將多種環境中的有機物質如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環芬芳碳氣化合物轉 化為細胞毒素或其他致癌物質，從而增加癌症發生的危險。國內外的眾多研究顯示CYP1A1的多態與野生 型相比有更高的酶接觸反應活性和可誘導性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的 危險度。細胞色素P450酶(CYP450)是細胞內重要的I相代謝酶，在致癌物的活化和解毒過程中起著重 要的作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多環芳烴類致癌物的主要嗨類。CYP1A1作為一種微神經元體細胞酶 與一些致癌物質的生物激活有關，例如benzo[a]pyrene。同時，CYP1A1易於被TCDD和多環的芳香族化 合物所誘變，包括3-甲基膽葸等實驗室用致癌物質。目前的動物實驗表明，CYP1A1的表達與芳基碳氣化 合物受體(AhR)和Arnt (AhR Nuclear Translocator)的激動劑，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor) 的拮抗劑有關。同時，CYP1A1通過C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動。rsl048943是位於CYP1A1基因上的一個A/G多態，位於第7外顯子462號教基酸由lie轉化為Val。 目前NCBI公布的世界人口頻率A:G為0.896:0.104,雜合度0.186。世界人群的關聯分析表明，CYP1Ale462Val位點ValVal和Vallle基因型在肺癌病例組中的頻率明顯高於對照組，在女性中風險度尤其突出。 基於多個中國人群肺癌發病與CYP1A1 Ik462Val位點的關聯分析研究，上千例肺癌個體與健康對照個體的 分析，顯示CYPlAlHe462Val這種位於酶蛋白的血紅素結合區的變異，是中國人群中重要的肺癌遺傳易感 因素之一，在女性中尤為突出。酶動力學研究表明，3種基因型表達的酶活性存在差異。Val/Val活化毒物 的能力最強，Ile/Val次之，而lle/Ile最弱。研究顯示，CYPlAlVal.Val基因型是中國人群中重要的肺癌遺 傳易感因素之一。XRCC1位於第19號染色體19913.2-13.3位置，全長32.3kb， mRNA全長2087bp,共有17個外顯子， 編碼634個胺基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對因電離輻射和垸基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效 的修復作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接瞎ffl、聚合酶e、多聚ADP核糖轉移酶交互作用，參與DM 的鹼基切除修復(Base Excision R印air, BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態性，與 癌症發生有密切的關係。與XRCC1相關的癌症主要有乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管癌、胃癌、結 腸癌、胰腺癌、肺癌等。rs25487是位於第19號染色體XRCC1基因上的一個G/A多態，弓l起XRCC1基因編碼的蛋白第399 個胺基酸由Arg變為Gln。 Ai^399Gln位於第10號外顯子，XRCC〗蛋白BCRTI區域。在世界人群中的該 多態的頻率分布，G佔0.72， A佔0.28左右。中國人群中的分布G為0.68， A為0.32。分子生物學研究表 明，XRCC1基因上第399號胺基酸A屯-Gln的替代加強XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結合能力， 從而影響個體的腫瘤易感性。通過大量對於大規模人群的肺癌病例對照研究，XRCC1的399胺基酸突變 位點在做單因素分析時與肺癌發生相關，但是分層分析後發現在大量吸菸的人群中，肺癌發病風險降低。ERCC2,位於第19號染色體19ql3.3位置，共有23個外顯子，基因全長19.0kb, mRNA全長2355bp, 編碼含761個胺基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉錄偶聯的核苷酸切除修復，它可識別與修復結 構無關的大範圍的損傷，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚體，並且是基本轉錄因子複合物BTF2/TFnH的一 個組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，屬於RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的功能 缺失導致基本轉錄因子複合物不能正確識別DNA損傷位點,從而使鹼基切除修復無法正確進行,導致DNA 上的致癌損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導致的疾病包括癌症、著色性幹皮病、毛髮硫營養 不良、柯凱因氏綜合症。rsl3181是位於第19號染色體ERCC2基因第23號外顯子段Lys751Gln的T/G多態。世界人群中的頻 率約為T:G =0.798: 0.202，雜合度0.322，中國人群中的頻率約為T:G =0.91: 0.09。目前的多項研究表明， Lys751Gln的胺基酸替代位於ERCC2蛋白C-末端部，這個位點的多態性與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮膚 罹等疾病有關。ERCC2Lys751Gln位點的多態現象與肺癌特別是肺鱗痛的發生存在顯著關聯。rel799793是位於第19號染色體ERCC2基因第10號外顯子段Asp312Asn的G/A多態。世界人群中 的頻率約為G:A=0.778:0.222，中國人群中的頻率約為G:A=0.94:0.06。目前的多項研究表明，該位點的多 態會導致ERCC2參與構成的轉錄因子複合物的性能發生弱化，從而使得對DNA損傷修復的能力下降，轉 錄因子的能力也同時發生下降，導致一系列諸如肺癌，前列腺癌等疾病的發生。ERCC2Asp312Asn多態性 與肺癌特別是肺鱗癌發生有顯著關聯，該位點的多態現象被認為是中國人群中肺癌遺傳易感因素之一。國內外的大量的關聯分析表明，PARP1基因上的rsl136410號SNP位點基因型為C時肺癌的發生機率 增加；CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點基因型為G時肺癌的發生機率增加；XRCC1基因上rs25487號 SNP位點基因型為A時肺癌的發生機率增加；ERCC2基因上rsl3181號SNP位點基因型為G時肺痛的發生 機率增加；ERCC2基因上rsl799793號SNP位點基因型為A時肺癌的發生機率增加。這五個SNPs位點的 多態性可用於評估個體對肺癌的易感性。發明內容基於PARPl基因上的rsll36410號SNP位點、CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上 的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl7997 3號SNP位點 的多態性可用於評估個體對肺癌的易感性的基礎上，本發明提供一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測PARP1基因上的rsl136410號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、檢測 CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、檢測XRCC1基因上的rs25487 號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、檢測ERCC2基因上的rs13181號SNP位點的特異性引物 對及特異性螢光探針、檢測ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、 Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對PARP1基因上的rsl136410號SNP位點、CYP1A1基因上的 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2 基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能特異性擴增出耙位點的DNA片段。設計這類引物對是本領域技 術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO: 1和2所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 7和8所示序列 的引物對以及具有SEQ ID NO: 9和10所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。 本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這五對引物。本試劑盒中所述的特異性螢光探針是指針對PARP1基因上的rsl 136410號SNP位點、CYPIAI基因上的 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2 基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出這五個SNPs '位點肺癌易 感基因型的探針。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 11、 12、 13、 14和15所示序列的Taqnian探針。特異性螢光探針可用常規的合成技術進行合成。本領域的 技術人員能夠理解，本發明的特異性螢光探針不限於這五條探針，所有可用於螢光定量PCR檢測PARPl基 因上的rsl136410號SNP位點、CYPIAI基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的rs25487號SNP 位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的探針均在本發明 範圍內。本發明試劑盒的組分和含量包括lpl 10 X螢光定量PCR反應緩衝液，0. lpl 25niM dNTP混合液，0. 5nl 25mM MgCl2溶液，0.02nl (5units/jil) Taq DNA聚合酶，20(xM特異性引物對(十條)各0.225nl，10fiM特異性螢光探針(五條)各0.25nl，
去離子水2.88fil。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DM模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:螢光定量PCR反應使用可檢測肺癌易感性的螢光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和螢光探針:有義引物l:5，-TTTGCCATTCACTGTGTTGG -3，(SEQIDNO:1)Tm值為58'C反義引物l:5，-ATCCTTGCTGCTATCATCA -3，(SEQIDNO:2)Tin值為54°C有義引物2:5'-GTGTTMGTGAGMGGTGAT -3，(SEQIDNO:3)Tm值為56'C反義引物2:5，-AGGATAGCCAGGMGAGAAA -3'(SEQIDNO:4)Tm值為58T)有義引物3:5，-TAACTGGCATCTTCACTTCT -3'(SEQIDNO:5)Tm值為56'C反義引物3:5,-TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'(SEQIDNO:6)Tm值為58'C有義引物4:5，-ACTCAGGAGTCACCAGGAA _3'(SEQIDNO:7)Tm值為58'C反義引物4:5，-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3,(SEQIDNO:8)Tm值為58'C有義引物5:5，-ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3，(SEQIDNO:9)Tm值為58°C反義引物5:5，-TCAGGMGCCCAGGAAAT -3'(SEQIDNO:10)Tm值為54'C螢光探針1:5，-CAGGCCMGGCGGAAATGCT -3,(SEQIDNO:11)Tm值為64'C螢光探針2:5，-TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3，(SEQIDNO:12)Tm值為64'C螢光探針3:5，-CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'(SEQIDNO:13)Tm值為64'C螢光探針4:5'- MTCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3,(SEQIDNO:14)Tm值為66'C螢光探針5:5,-TGCCCMCGMGTGCTGCAG -3，(SEQIDNO:15)Tm值為64'C有義引物1，反義引物1和螢光探針1特異地針對檢測PARP1基因上的rsl 136410號SNP位點多態性； 有義引物2，反義引物2和螢光探針2特異地針對檢測CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點多態性；有 義引物3，反義引物3和螢光探針3特異地針對檢測XRCCl基因上rs25487號SNP位點多態性；有義引物 4，反義引物4和螢光探針4特異地針對檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點多態性；有義引物5, 反義引物5和螢光探針5特異地針對檢測ERCC2基因上的rel799793號SNP位點多態性。螢光定量PCR反應體系為總體積lO(il，包含濃度為20ng/nl的DM模板2^1、 ljil 10 X螢光定量PCR 反應緩衝液、0. ljd 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物l、 2 、 3 、 4和5各0.225nl、 20fiM的反義引物l、 2 、 3、 4和5各0.225pl、 10nM的 螢光探針l、 2 、 3、 4和5各0.25^1,去離子水2.88nl。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環的 95r、 30秒，60C、 l分鐘。反應結束後在ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量。步驟3: SNP基因型分析 將螢光定量PCR儀上顯示的最終樣品螢光量和正常對照相對比，螢光探針1最終的螢光信號明顯髙於 正常對照，說明被檢測DM的PARPl基因上的rsll36410號SNP位點基因型攜帶有C型，為肺癌易感型； 螢光探針2最終的螢光信號明顯高於正常對照，說明被檢測DM的CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點 基因型攜帶有G型，為肺癌易感型;螢光探針3最終的螢光信號明顯高於正常對照，說明被檢測DNA的XRCC1 基因上rs25487號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺癌易感型；螢光探針4最終的螢光信號明顯高於正常 對照，說明被檢測DM的ERCC2基因上的rs13181號SNP位點基因型攜帶有G型，為肺癌易感型；螢光 探針5最終的螢光信號明顯高於正常對照，說明被檢測DNA的ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點基 因型攜帶有A型，為肺癌易感型。實施例2.指導人們主動預防肺癌的服務目前在上海主健生物工程有限公司己經開展了這項服務。 步驟l: DNA提取對被檢測者進行服務前諮詢，由被檢測者籤署知情同意書，填寫生活飲食習慣問巻調査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。 步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的PARP1基因上的rsl136410號SNP位點、CYP1A1基因上 rsl048943號SNP位點、XRCC1基因上rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2 基因上的rsl799793號SNP位點同時進行螢光定量PCR檢測，確定這五個SNPs位點的基因型。步驟3:指導人們主動預防肺癌通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告。基因 檢測報告詳細說明了被檢測者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導報告以被檢測者 的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問巻調査結果，評估被檢測者肺癌遺傳易感的相對風險。 同時制定出針對於被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等，並 為被檢測者普及預防肺癌的健康知識。
序列表〈110〉上海主健生物工程有限公司〈120>通過不同基因的五個SNPs檢測肺癌易感性的試劑盒 15<210〉 1 20 DNA 人工序列引物 〈400〉 1tttgccattc actgtgttgg〈210〉 2 19 ■ 〈213〉人工序列〈223〉引物 2atccttgctg ctatcatca 3 〈211〉 20 DNA 〈213〉人工序列〈220〉引物 3gtgttaagtg ag8aggtg8t201920 <210〉 4 <211〉 20 <212〉 ■ 〈213〉人工序列引物 <柳〉4鵬3tagcca ggaagaga肪〈210〉 5 <211〉 20 DNA <213〉人工序列<220〉引物 < 5taactggcat cttcacttct 6 19 DNA <213〉人工序列<220〉引物 < 6tccagattcc tggcattgc 7 19 人工序列引物
actcaggagt caccaggaa〈210> 8 19 ■ 人工序列〈223〉引物 〈400> 8tctgttctct gcaggagga<210〉 9 20 <212〉 DNA 人工序列〈223〉引物 < 93tC3a8g8g8 Cag8CgagC3 10 18 DNA 〈213〉人工序列〈220>引物 10tcaggaagcc caggaaat<210〉 11 DNA說明書第8/10頁191920<213〉人工序列 〈223〉探針 11caggccsagg cggsaatgct 20 <211〉 〈212〉 〈213〉12 20 DNA人工序列<220〉探針 12tatcggtgag accgttgccc 20<210〉 <213〉13 18 DNA人工序列探針 ■> 13cggctgccct cccagagg 18 1422 腿人工序列〈223>探針 14aatctgctct atcctctgca gc 22formula see original document page 12
權利要求
1.一種檢測肺癌易感性的試劑盒，包括同時檢測PARP1基因上的rs1136410號SNP位點、CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和ERCC2基因上的rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性引物對是指針對PARPl基因上的 rsl136410號SNP位點、CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的rs25487號SNP位點、 ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能特異性擴增出 包含PARPl基因上的rsl136410號SNP位點、CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的 rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點的 引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性螢光探針是指針對PARPl基因上的 rsl136410號SNP位點、CYPlAl基因上的rsl048943號SNP位點、XRCCl基因上的rs25487號SNP位點、 ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點和ERCC2基因上的rsl799793號SNP位點而設計，能通過螢光定量 PCR技術特異性檢測出這五個SNPs位點肺癌易感基因型的探針。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: l和2所 示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對、 具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 9和10所示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性螢光探針選自具有SEQIDNO: 11、 12、 13、 14和15所示序列的Taqman探針。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括ljil IOX螢光定量PCR反 應緩衝液，O.lnl 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液,0,1 (5units/fd) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(十條)各0.225nl， 10jiM特異性螢光探針(五條)各0.25pl，去離子水2.88nl。本 試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測PARP1基因上的rs1136410號SNP位點、CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點、XRCC1基因上的rs25487號SNP位點、ERCC2基因上的rs13181號SNP位點和ERCC2基因上的rs1799793號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測分析個體的PARP1基因、CYP1A1基因、XRCC1基因和ERCC2基因上的SNPs位點基因攜帶型來預測個體對肺癌的易感性。
文檔編號G01N21/64GK101153846SQ200610116669
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司