克隆有人腫瘤壞死因子α(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌的構建方法

2023-07-14 12:05:41 1

專利名稱：克隆有人腫瘤壞死因子α(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌的構建方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域。
腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor TNF)是由激活的巨噬細胞分泌產生的細胞因子，可以在體內外特異殺傷腫瘤細胞而對正常組織則無顯著毒性。人TNF由157個胺基酸組成，分子量為17000道爾頓，是一種非糖基化、中等疏水性的蛋白質。除了具有抗腫瘤活性外，還具有抗病毒感染、抑制病毒複製功能;可以抑制蛋白脂酶活性，促進正常細胞增殖，刺激骨吸收和抑制骨形成，在內毒素介導的敗血症休克、細胞的增殖分化和骨重建中均有重要作用;通過增強多形核中性白細胞的細胞毒和吞噬活性激活巨噬細胞，可以誘導產生其它細胞因子，促進組織相容性抗原表達;TNF還可以與多種細胞因子如白細胞介素-I、白細胞介素-2及各種幹擾素有協同作用。TNF作為一種有希望的抗腫瘤、抗病毒(尤其對愛滋病毒)的生物製劑已引起人們廣泛關注。目前TNF的應用研究已進入Ⅰ期和Ⅱ期臨床實驗階段，應用DNA重組技術獲得的TNF對癌症病人的Ⅰ期臨床實驗也已經開始，並獲得了初步結果。
當前獲得人腫瘤壞死因子-α，可以採用下列方法1.從激活的人巨噬細胞、前髓性白血病細胞進行分離提純由於來源困難，無法製備樣品，因此無實用價值;
2.基因工程方法(1)在大腸桿菌中克隆表達在國內外均有報導，南京大學王平等人的文章「人腫瘤壞死基因的化學合成、大腸桿菌表達及分子改造設計」(863計劃生物技術領域年會論文摘要(1989-1990)，128頁)中，採用人工合成的TNF基因在大腸桿菌中獲得108單位/升表達，病毒研究所張德震等人在「採用定位基因缺失突變技術在大腸桿菌中高效表達腫瘤壞死因子」(生物工程學報6(3).181.1990)介紹了採用定位基因缺失突變獲得3×108單位/升表達。由於大腸桿菌是腸道寄生菌，對人體有害，而且大腸桿菌蛋白產物不易分泌，大量生產時成本高，工藝複雜。
(2)在酵母菌中克隆表達復旦大學李昌本等人在「腫瘤壞死因子基因在大腸桿菌和酵母中的表達」(863計劃生物技術領域年會論文摘要(1988-1989)105頁)文章中介紹TNF-y基因在酵母細胞中表達水平為8×105單位/升，其表達水平低，無實用價值。
(3)在鏈黴菌中克隆表達鏈黴菌是一種重要的工業微生物，由於它是抗生素的主要產生菌，因此工業化生產工藝成熟，具有可分泌性的特點，可以有效表達外源基因。
美國Cetus公司報導S.Y.Chang和S.Chang在Secretion of HeterologusProteins in Streptomyces Lividans(Biology of Actinomycets′88，103頁)文章中採用質粒PIJ702為載體，TNF基因在變鉛青鏈黴菌中獲得了分泌表達，在aph啟動子作用下，表達水平為約1.3×107單位/升，其產物為融合蛋白，這個方法雖然較好，但也有缺點，即所得產物是融合蛋白，同時，表達水平尚不夠高。
本發明目的在於構建一種可以高效表達TNF-α的變鉛青鏈黴菌基因工程菌，以期推向工業生產，表達水平在1×107單位/升以上。
本發明目的是這樣達到的將TNFcDNA片段插入PIJ486載體質粒，轉化至變鉛青鏈黴菌TK54，挑選出所需轉化子，經提取轉化子質粒確定為含TNFcDNA重組質粒，便獲得了腫瘤壞死因子基因工程菌，即克隆有腫瘤壞死因子基因的變鉛青鏈黴菌。
現結合附圖對本發明進行詳細說明。
附

圖1是克隆有腫瘤壞死因子基因的變鉛青鏈黴菌構建步驟方框圖;
附圖2是腫瘤壞死因子基因克隆菌株(Streptomyces TK54-HT菌株)孢子絲;
附圖3是EcoRI-HindⅢ雙酶切重組質粒PIJT7的凝膠電泳圖;
附圖4是重組質粒PIJT7的限制性內切酶圖譜;
附圖5是重組腫瘤壞死因子(TNF)的L929細胞毒活性測定;
附圖6是抗體中和實驗;
附圖7是克隆有腫瘤壞死因子(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌細胞裂解上清液聚丙醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖;
附圖8是在不同培養時間條件下，克隆有腫瘤壞死因子(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌TNF活性曲線。
附圖1是本發明克隆有腫瘤壞死因子(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌構建步驟方框圖。
從附圖1可見步驟1酶切分為兩部分第一部分是從克隆有人腫瘤壞死因子cDNA片段的質粒PHT1經EcoRI-HindⅢ雙酶切分離出615bp的TNF基因片段;
第二部分為用EcoRI-HindⅢ雙酶切質粒PIJ486;第二步驟是連接，加入T4-DNA連接酶將第一步驟獲得的兩種DNA片段進行連接;第三步驟是轉化，重組後的質粒被引入受體菌中，引入的步驟稱之為轉化，本發明將上述連接過的DNA轉化至變鉛青鏈黴菌TK54(S.Lividans TK54)原生質體;第四步驟是挑選轉化子和提取重組質粒，選擇抗新黴素的轉化子，然後提取重組質粒，選出重組質粒PIJT7;第五步驟經過對TNF活性的測定，確定含有重組質粒PINT7的變鉛青鏈黴菌轉化子為腫瘤壞死因子的基因工程菌，得到所需克隆有TNF-α基因的變鉛青鏈黴菌。
以下對各步驟進行詳細說明
(一)酶切1.質粒PHT1的提取基本上採用Sambrook方法(Sambrook，J.et al Molecular Cloning.A La-boratory Manual，Second Edition.Cold Spring Harbour P1.25.1989)將含有質粒PHT1的大腸桿菌JM105接種於L.B.培養基中(胰蛋白腖1%、酵母粉0.5%、NaCl1%、自然PH)，L.B.培養基中加有50μg/ml氨青黴素，37℃過夜振蕩培養，於4℃～10℃離心(3000轉/分)去上清得溼菌絲，以100毫升培養液菌絲為例，將離心所得溼菌絲懸浮於加有溶菌酶(5mg/ml)的溶液Ⅰ中(50mM葡萄糖、25mM Tris.Cl、10mM EDTA、PH8.0)振蕩均勻，在冰浴中放置五分鐘，至溶液變粘，加入10ml溶液Ⅱ(0.2N NaOH，1%SDS)在冰浴中放置十分鐘，不時緩慢振蕩，再加入7.5ml 3M醋酸鉀溶液，搖勻後在冰浴放置30-60分鐘，離心(4℃，104轉/分)，取上清，另入2.5倍體積預冷過的無水乙醇，搖勻後於-20℃放置2小時以上，離心(4℃，104轉/分)，去上清，將沉澱溶於少量體積TE緩衝液中(10mM Tris.HCl、1mM EDTA PH8.0)，再加入2.5倍體積預冷過的無水乙醇和1/10體積3M醋酸鉀，置於-20℃，2小時以上沉澱，104轉/分離心，去上清，減壓抽乾，再度溶解於少量TE緩衝液中，-20℃保存備用。
2.質粒PIJ486的提取含有質粒PIJ486的變鉛青鏈黴菌TK24(Streptomyces lividans TK24)培養於YEME培養基中(酵母粉0.3%、蛋白腖0.5%、麥芽提取物0.3%、葡萄糖1～2%、蔗糖34%、MgCl20.1%、PH7.0-7.2)，28℃培養40-48小時，離心(2500轉/分)10分鐘左右，去上清，用STE緩衝液洗滌(蔗糖10.3%、EDTA25mM、Tris HCl 25mM、PH8.0)，離心(2500轉/分)，棄上清，以100ml培養液菌絲為例，加入10-15ml STE緩衝液(含5mg/ml溶菌酶，37℃，30-60分保溫，加入20ml鹼性SDS溶液(0.2N NaOH、1%SDS於冰浴中放置5-10分，加入15ml醋酸鈉，於冰浴放置30-60分，12000-15000轉/分，離心15-30分，取上清，加入2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分離心15～30分，除上清，加入10ml，TE緩衝液，1/10體積3M醋酸鈉和2.5M倍體積預冷無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分離心15～30分，真空減壓乾燥，溶於1ml TE緩衝液，-20℃保存備用，得到質粒PIJ486。本質粒是一種啟動子探針質粒，如在多接頭部分(新黴素抗性基因前面)插入外源基因片段，如果片段中有新黴素抗性基因啟動子功能，則很容易由轉化子對新黴素抗性的顯著提高加以確定，因此，這種質粒可以較廣泛應用，且提取便利，易於製備。
3.酶切採用限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ分別對質粒PHT1和質粒PIJ486進行雙酶切。HindⅢ的酶切緩衝液為10×Y50(Tris 10mM、MgCl26mM、巰基乙醇7mM、NaCl 50mM)，EcoRⅠ的酶切緩衝液為10×Y100(Tris 10mM、MgCl26mM、巰基乙醇7mM、NaCl 100mM)，37℃，保溫1小時以上。
4.TNF CDNA片段的製備取相當量經HindⅢ-EcoRⅠ雙酶切過的質粒PHT1，於瓊脂糖凝膠製備電泳上樣，於100伏泳動2-3小時左右，電泳緩衝液為TAE(0.04M Tris、醋酸鹽、0.002M EDTA)電泳畢將膠浸泡於溴化乙錠溶液染色(-0.5μg/ml)，在紫外燈下切割下來0.6Kb TNFcDNA片段，將含此片段瓊脂糖凝膠塊裝入充滿TAE緩衝液的透析袋中，袋口夾緊後，將此袋置於電泳槽中進行電泳洗脫(100V4-5小時)，電泳畢，正負極反向交叉通電1分鐘左右，關閉電源，從透析袋中取出緩衝液，置於離心管加入酚和氯仿抽提，離心(12000轉/分)5分鐘，除去酚、氯仿，再加入2.5倍體積無水乙醇和1/10體積3M醋酸鈉，-20℃放置2小時以上，離心(4℃，12000轉/分)20分鐘，除去液體，減壓抽乾，將沉澱溶於適量TE緩衝液，-20℃保存備用。
(二)連接將上述已經分離製備的TNFcDNA片段和經HindⅢ-EcoRⅠ雙酶切過的質粒PIJ486以適當濃度比例cDNA片段∶PIJ486＝3.5∶1，最好是5∶1，加入T4DNA連接酶，在10-14℃放置3小時以上，連接緩衝液成分為Tris60mM、MgCl26mM、巰基乙醇10mM，PH7.5。本方法的特點在於TNFcDNA片段濃度與PIJ486濃度相比為3～5∶1，最好是5∶1進行連接，獲得重組DNA分子。若cDNA片段純度不好，則直接影響連接效果。
(三)轉化本發明採用PEG6000處理，除去受體菌細胞壁，在原生質體形成的情況下，直接與DNA接觸進行轉化，再在特定再生培養基中生長，使細胞壁重新形成，成為轉化子。
1.原生質體的製備將變鉛青鏈黴菌TK54(Streptomyces lividans TK54)種於25ml YEME培養基中(加入適量彈簧)，26～28℃培養24～30小時，再以10～15%接種於新鮮YEME培養基中(加入0.5%甘氨酸，適量彈簧)，培養基中加入彈簧可以顯著提高原生質體的形成率，如不加則菌體生長成球狀，生長異常，若加量過多則菌絲自溶，一般每100ml培養基中加入3-4個彈簧，該菌生長才正常。在26～28℃培養36～40小時，2000～3000轉/分離心10～15分鐘，去上清，用10.3%蔗糖溶液洗滌並離心兩次，加入4～5ml P緩衝液(Tris 0.3%、MgCl2·6H2O 2.04%、葡萄糖0.1%、CaCl2·2H2O 0.386%、蔗糖10%)，其中含有溶菌酶1-2mg/ml，於26～28℃放置30分鐘以上，於相差顯微鏡下觀察原生質體形成率大於90%，於1500～2000轉/分離心5分鐘左右，去上清，用1-2ml P緩衝液洗滌一次，1500～2000轉/分離心5分鐘左右，將所得原生質體懸浮於100微升P緩衝液中。
2.轉化操作本發明在轉化操作中，採用Hopwood(Hopwood D·A·et alGeneticManipulation in streptomyces.The John Innes Foundation，Norwich，P110，1985)方法。取50微升變鉛青鏈黴菌TK54的原生質體與1微克以下，最好為0.5微克的上述已連接的DNA樣品混勻，以便提高轉化率，加入25%PEG 1000(P緩衝液中)1ml，緩慢振蕩3～5分鐘，立即加入5ml P緩衝液，於1500～2000轉/分離心5分鐘左右，用P緩衝液洗滌並離心一次，將原生質體懸浮於1ml P緩衝液中，取50-100微升塗布R2瓊脂平板(蔗糖10.3%、酵母粉0.4%、CaCO3·2H2O 0.7%、酪蛋白水解物0.01%、Tris 0.3%、K2SO40.025%、蛋白腖0.3～0.5%、MgCl2·H2O 1%、葡萄糖1%、KH2PO40.003%、瓊脂1.5、微量元素溶液0.2%(ZnCl20.004%、Na2B4O7·10H2O 0.001%、MnCl2·4H2O 0.001%、CuCl2·2H2O 0.001%、FeCl3·6H2O 0.02%)，28℃～30℃培養18～20小時，塗布於加有新黴素30μg/ml的R2瓊脂平板上，28℃培養7天左右，獲得抗新黴素的轉化子。新黴素的量如低於30μg/ml則對照菌株也會生長，如大於30μg/ml則克隆菌種可能死掉。
(四)挑選轉化子提取重組質粒1.挑選抗新黴素的轉化子上述平板於28℃培養7～14天後，陸續挑選抗新黴素轉化子，以未克隆有重組質粒的變鉛青鏈黴菌TK54作為對照，它在新黴素平板上不生長，因此可以從抗藥性的提高，判斷絕大多數轉化子中含有重組質粒;
2.重組質粒的提取採用Katz的快速鹼變性方法(Katz.E.et al1983.J.Gen Microbiol.1292703)將轉化子種於2ml YEME培養基中(加入少量彈簧)，26～28℃培養24～30小時，10%～15%接種於新鮮YEME培養基2ml(加少量彈簧)中，26～28℃培養40～48小時，2000～2500轉/分離心5～10分鐘，去上清，用STE緩衝液洗滌，離心，去上清液，加入0.2～0.5ml STE緩衝液(內含3～5mg/ml溶菌酶)，37℃，保溫30～60分，加入0.3～0.5ml鹼性SDS溶液，置冰浴5～10分，加入0.2～0.4ml 3M醋酸鈉，於冰浴中放30分-1小時，12000-15000轉/分離心15～30分，取上清，加入2.5倍體積預冷過的無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000～15000轉/分離心15～30分，去上清，加入200μl TE緩衝液，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃，2小時以上，於15000轉/分離心15～30分，去上清，真空乾燥，溶於50μl TE緩衝液中，取適量進行瓊脂糖凝膠水平平板電泳(1%瓊脂糖)電壓3.5V/cm，緩衝液為TAE。
對瓊脂糖凝膠電泳後確定為重組質粒的樣品，進行EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切，酶切後的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動的入噬菌體DNA限制性內切酶HindⅢ酶切片段泳動距離進行比較(λ-HindⅢ為分子量標準)，可以確定各片段分子量大小，其中，№7轉化子所含重組質粒PIJT7插入片段為6.15bp與TNFcDNA相同。本發明挑選了含重組質粒PIJT7的№7轉化子進行了有關腫瘤壞死因子基因表達的深入研究。含有PIJT7重組質粒的№7轉化子(Strepto-myces lividans TK54-HT)的形態見附圖2。附圖2是變鉛青鏈黴菌TK54-HT菌株(腫瘤壞死因子基因克隆菌株)孢子絲照片。所用斜面為R2(%)蔗糖10.3、硫酸鉀0.025、酵母膏0.4、蛋白腖0.4、酪蛋白水解物0.01、葡萄糖1、三羥甲基氨基甲烷0.3、磷酸氫二鉀0.0025、氯化鈣0.735、氯化鎂1.012、微量元素溶液2ml/L(氯化鋅0.004、氯化銅0.001、硼酸鈉0.001、氯化鐵0.02、氯化錳0.001)瓊脂1.5，PH7.5，溫度28～30℃，培養6～7天，其生長形態為有較多氣生菌絲，孢子較多，頂部有捲曲，氣生菌絲呈灰白色，產生紫紅色色素，菌落表面平滑，基內菌絲呈紫紅色。
為了確認重組質粒PIJT7插入了腫瘤壞死因子的(cDNA)片段，採用EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切該質粒。圖3是重組質粒PIJT7雙酶切電泳結果。圖中1代表重組質粒PIJT7;2代表HindⅢ酶切PIJT7;3代表HindⅢ-EcoRⅠ雙酶切PIJT7;4代表HindⅢ酶切入噬菌體DNA作為分子量標準;5代表TNFcDNA片段;6代表HindⅢ酶切PIJ486，7代表質粒PIJ486，從圖可見PIJT7經雙酶切後主要為兩帶，其中一條與PIJ486HindⅢ單酶切片段分子量相同;而另一條小片段則與腫瘤壞死因子cDNA片段相同，因此說明該基因cDNA片段確已插入質粒PIJ486構成了重組質粒PIJT7。
限制性內切酶圖譜是表明不同限制性內切酶在某種DNA上相互位置的圖譜，圖4是重組質粒PIJT7的限制性內切酶圖譜，如圖所示，該質粒分子量為6.78Kb。圖中黑點部分為腫瘤壞死因子基因部位。
(五)獲得克隆有TNF-α基因的變鉛青鏈黴菌基因工程菌1.S.lividans TK54-HT克隆菌株的培養為了確證克隆菌株是否產生腫瘤壞死因子，將含有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54(S.lividans TK54-HT)培養於YEME培養基中(瓶中加有適量彈簧)，於26～28℃培養24～30小時，再以10～15%接種於新鮮YEME培養基中(加有適量彈簧)，於26～28℃振蕩培養48小時、72小時、96小時、120小時和144小時。
2.S.lividans.TK54-HT克隆菌株上清裂解液的製備取上述不同培養時間的發酵液於5000轉/分，4℃離心15～20分鐘，去上清，將菌絲懸浮於STE緩衝液中，5000轉/分4℃離心10～15分鐘，去上清，此洗滌步驟重複一次，將所得菌絲懸浮於一定量STE緩衝液中，其中含有溶菌酶5mg/ml，於37℃保溫30分鐘，保溫畢置於冰浴中，以超聲波破碎細胞(30W、10秒/次×15～20，每次間歇5秒)，所獲得破碎細胞懸浮液於12000轉/分、4℃、離心30分鐘，棄沉澱，取上清，分裝至多根小管，保存於-70℃，以備測TNF活性用。
下述步驟是對№7轉化子(含有重組質粒PIJT7的變鉛青錠黴菌TK54)腫瘤壞死因子活性的確證步驟(1)TNF對L929細胞的細胞毒性有關本測定方法見Stone-walff的文章(J.EXP.Med 159，828-843，1984)。L929細胞培養液的成分是小牛血清10%、NaHCO37.5%、青黴素、鏈黴素、卡那黴素各1萬單位/ml，穀氨醯胺1%、Eagle′s培養基86%。將L929細胞以1～3×104細胞/孔接種於96孔塑料培養板，37℃、5%CO2孵育過夜(18小時)，棄去培養液，加入終濃度為1μg/ml的放線菌素D，不同稀釋度的TNF表達菌細胞裂解液(0.1ml)，37℃繼續培養，18小時後觀察細胞存活狀況，棄去測試樣品，用0.1ml0.2%結晶紫乙醇-水溶液(2∶98V/V)於室溫下對細胞染色10分鐘，用蒸餾水衝洗塑料培養板，室溫晾乾，加入0.1ml 1%SDS裂解細胞，用DG＃3022酶聯免疫檢測儀(南京華東電子管廠)570nm波長檢測樣品光吸收值，以殺死50%細胞的TNF稀釋度為一個活性單位。附圖5是重組腫瘤壞死因子(TNF)的L929細胞毒活性測定結果。在圖中A代表含有PIJ486的變鉛青黴菌TK54細胞裂解液對L929細胞作用的結果;B代表克隆有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌菌株對L929細胞作用的結果;C表示正常L929細胞生長對照;D表示加有1μg/ml放線菌素D的L929細胞藥物對照。從圖中清晰可見含有PIJ486的變鉛青鏈黴菌TK54細胞裂解液對L929細胞基本無細胞毒作用，於酶聯免疫檢測儀570nm檢測，結果其光密度大體與正常細胞對照C相同;而含有重組質粒PIJT7重組質粒的克隆菌株細胞裂解液對L929細胞有顯著細胞毒作用。這說明該克隆菌株細胞裂解液具有和TNF相同的細胞毒活性。由於含有PIJ486的變鉛青鏈黴菌TK54克隆株對L929細胞無毒性，兩種克隆菌株區別僅在於PIJT7重組質粒中插入了TNFcDNA片段，因此可以認為含有PIJT7重組質粒的克隆菌株具有TNF活性是由於TNF基因在該克隆菌株中獲得了表達的原故，若以殺死50%L929細胞的TNF稀釋度為一個活性單位，則在28℃培養了120小時的、含PIJT7變鉛青鏈黴菌TK54克隆菌株TNF活性可高達1×108單位/升以上。
(2)腫瘤壞死因子的中和實驗鑑於抗體與其抗原專一性結合的特點，因此我們採用了人腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(西德Boehringer公司產品)對克隆有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54菌株、28℃不同培養時間的細胞裂解上清液進行了中和實驗。取50μl 1/3000稀釋和1/6000稀釋的腫瘤壞死因子-α單克隆抗體分別與50μl不同稀釋度的上述細胞裂解上清液樣品混合，37℃作用1小時後，再在4℃放置30分鐘，隨後按上述方法檢測抗體中和後的TNF對L929細胞的細胞毒作用。圖6為抗體中和實驗結果，圖中A表示含重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT細胞裂解上清液與人腫瘤環死因子-α單克隆抗體共同作用後對L929細胞的作用結果;B表示含有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT細胞裂解液不加TNF單克隆抗體但同樣按37℃作用1小時，再在4℃放置30分鐘後再與L929細胞作用的細胞毒結果;C為正常的L929細胞對照，從上述A結果可見，含有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT細胞上清液經與TNF-α單克隆抗體作用後，對L929細胞基本未發生細胞中毒現象，其光密度檢測結果(570nm)與正常對照細胞大體相同，發生了中和作用，說明該上清液中存在有可與TNF-α單克隆抗體特異結合的抗原-腫瘤壞子因子-α。B表示由於上清液未與TNF-α單克隆作用，因此上清液對L929細胞有較顯著細胞毒作用，因此根據本中和實驗結果可以確認含有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT培養液中含有TNF，因此該克隆菌株為TNF基因工程菌。
(3)SDS聚丙醯凝膠蛋白電泳(SDS-PAGE)基本上按照Sambrook方法(Sambrook，J，et al Molecular cloning.A Laboratory Manual.Second Edition.Cold Spring Harbour P18.47.1989)將克隆有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT細胞上清裂解液樣品和含有質粒PIJ486的變鉛青鏈黴菌TK54菌株細胞上清裂解液樣品分別與樣品緩衝液(2×樣品緩衝液，每10ml成分Tris 0.15g、10% SDS 4ml、甘油1ml、溴酚蘭20mg(0.02%)、β-巰基乙醇0.4ml(4%)、H2O 4ml)以1∶1稀釋，同時將1mg/ml分子量標準蛋白樣品溶於上述緩衝液，上樣前將所有樣品於100℃加熱3分鐘，冷卻後經SDS-聚丙醯胺凝膠垂直平板電泳(凝膠分為分離膠和樣品膠，其中分離膠30ml含有30%丙醯胺混合液12ml(雙甲叉丙醯胺∶丙醯胺為1∶29)、1.5M Tris、PH 8.8 7.5ml、10%SDS 0.3ml、10%過硫酸胺0.3ml、TEMED 0.012ml;樣品膠5%，20ml含有30%丙醯胺混合液3.4ml、1M Tris、PH6.8 2.5ml、10%SDS 0.2ml、10%過硫酸胺0.2ml、TEMED 0.02ml、水13.6ml)先將分離膠倒入平板垂直放置，以正丁醇封液面，除去氣泡，垂直放置45分鐘，凝膠固定後，倒去正丁醇，以蒸餾水衝洗淨正丁醇，再倒入樣品膠，並插入加樣梳，待凝膠固定後拔出梳子，將前述經加熱處理過的樣品加至樣品槽，進行電泳，緩衝液為Tris-甘氨酸(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1%SDS)，電泳電壓100～150V，電流～20mA，電泳畢對凝膠進行固定2小時(固定液成分為異丙醇100ml、冰乙酸40ml、水260ml)，然後用染色液進行染色，在染色劑A(異丙醇125ml、冰乙酸50ml、考馬斯亮蘭R250 0.15g、加水至400ml)中放置3小時，在染色劑B(異丙醇50ml、冰乙酸50ml考馬斯亮蘭R250 0.015g、加水至400ml)中放置1小時，再在染色劑C中放置3小時(冰乙酸50ml、考馬斯亮蘭7.5mg、加水至400ml)，染色畢，將膠放置於脫色液中(10%乙酸)反覆換液漂洗，直至背景色基本脫盡，照相保存。圖7為克隆有TNF基因的變鉛青鏈黴菌(含PIJT7)細胞裂解上清液的SDS-PAGE結果，圖中A為蛋白質分子量標準;B為克隆有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT細胞上清裂解液的樣品，C為含有質粒PIJ486的變鉛青鏈黴菌TK54菌株細胞胞上清裂解液樣品，圖中箭頭所示部位，含PIJT7克隆菌株樣品比含PIJ486對照菌株顯著多一條蛋白電泳帶，與標準分子量相比該帶分子量大體相當於17000d，與TNF分子量相同，根據這一結果也可以確證克隆有PIJT7重組質粒的變鉛青鏈黴菌TK54-HT經過培養確實能夠產生TNF蛋白，因此該菌株為TNF基因克隆菌株。
綜上所述，根據L929細胞毒實驗，中和實驗及SDS-PAGE分析結果，我們可以確證克隆有重組質粒PIJT7的變鉛青鏈黴菌TK54-HT為腫瘤壞死因子基因的基因工程菌。
圖8表示克隆有TNF基因的變鉛青鏈黴菌不同培養時間TNF活性曲線，圖中橫坐標表示上述克隆菌株28℃的不同培養時間(小時)，縱坐標表示不同培養時間克隆菌株上清裂解液的腫瘤壞死因子活性單位，由圖可見120小時為腫瘤壞死因子產生的最高峰。
本發明克隆有人腫瘤壞死因子-α(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌的構建方法可以高效表達TNF-α的變鉛青鏈黴菌基因工程菌，工藝成熟，表達水平高達1×108單位/升以上。在此基礎上進一步強化可達到工業生產水平，予期表達水平可達1×107單位/升以上，所得產物是非融合蛋白，有可分泌性，菌種遺傳穩定。
權利要求
1.克隆有人腫瘤壞死因子-α(TNF)基因的變鉛青鏈黴菌的構建方法，其中包括酶切、連接、轉化、挑選轉化子提取重組質粒和經確證後得到所需菌種五個步驟，其特徵在於a、連接以質粒PIJ486為載體，將經過限制性內切酶EcoRI-HindⅢ雙酶切得到的質粒PHT1TNFcDNA片段和經過限制性內酶EcoRI-HindⅢ雙酶切得到的質粒PIJ486片段相連接，cDNA片段濃度和載體DNA濃度比為3～5∶1，加入T4DNA連接酶，於10～14℃放置3小時以上進行連接，獲得重組DNA分子；b、轉化採用上述a步驟中連接後的重組DNA，以變鉛青鏈黴菌TK54的原生質體為受體，按照Hopwood等人的方法，將連接後的DNA轉化至所說的受體菌中；c、挑選轉化子及提取重組質粒以含新黴素30μg/ml的R2瓊脂平板挑選含重組質粒的轉化子，凡是挑選出來的耐藥菌落多為含重組質粒的轉化子，採用Katz的快速鹼變性方法提取含重組質粒的轉化子，將瓊脂糖凝膠電泳後確定為重組質粒的樣品再用EcoRI-HindⅢ酶切後的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動的入噬菌體DNA限制性內切酶HindⅢ酶切片段的距離進行比較從而確定各片段分子量大小，其中№7轉化子所含重組質粒PIJT7插入片段為615bp與TNFcDNA相同，經L929細胞毒實驗、中和實驗和SDS-聚丙醯胺凝膠電泳確證№7轉化子為人腫瘤壞死因子-α的基因工程菌。
2.按照權利要求1所述的構建方法，其特徵在於在a連接步驟中，經過限制性內切酶EcoR I-HindⅢ雙酶切得到的質粒PHT1TNFcDNA片段的濃度和經過限制性內切酶EcoR I-HindⅢ雙酶切得到的質粒PIJ486片段濃度比為5∶1。
3.按照權利要求1所述的構建方法，其特徵在於在b步驟轉化操作中，50ml變鉛青鏈黴菌TK54原生質體與已連接的DNA混合進行轉化時，該已連接的DNA濃度為1微克以下。
4.按照權利要求3所述的構建方法，其特徵在於在b步驟轉化操作中，50ml變鉛青鏈黴菌TK54原生質體與已連接的DNA混合進行轉化時，該已連接的DNA濃度為0.5微克。
5.按照權利要求1所述的構建方法，其特徵在於在b步驟轉化操作中，瓊脂平板中加入新黴素濃度為30μg/ml。
6.按照權利要求1所述的構建方法，其特徵在於在b步驟轉化操作中，培養變鉛青鏈黴菌TK54過程中，培養基中要加入適量彈簧，即每100毫升培養基加入3～4個彈簧。
全文摘要
本發明涉及克隆有人腫瘤壞死因子-α基因的變鉛青鏈黴菌的構建方法。本發明方法採用基因工程技術，以質粒P
文檔編號C12N15/09GK1055200SQ9110310
公開日1991年10月9日 申請日期1991年5月17日 優先權日1991年5月17日
發明者李元, 劉菊萍, 李煥婁, 石蓮英, 劉伯英 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所