抗體的選擇性富集的製作方法

2023-07-14 04:43:21 1

專利名稱：抗體的選擇性富集的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白、尤其是免疫球蛋白或具有Fe域的其他蛋白的純化方法。
現有技術生物分子(例如蛋白、聚核苷酸、多糖等)在作為藥物、診斷劑、食品添加劑、清潔劑等、研究試劑方面及對於許多其他應用而言具有日益增加的商業重要性。通過自天然來源分離分子(例如在蛋白的情況下)通常不再能夠滿足對所述生物分子的需要，而需要使用生物技術製備方法。 蛋白的生物技術製備通常始於將DNA片段克隆至適合的表達載體中。將表達載體轉染至適合的原核或真核表達細胞中且隨後選擇經轉染的細胞後，在生物反應器中培養所述經轉染的細胞且表達所要蛋白。接著收集細胞或培養物上清液，且處理並純化其中所含的蛋白。在真核表達系統的情況下，即當使用哺乳動物細胞培養物(例如CHO或NSO細胞)時，在過去15年中細胞培養物或細胞培養上清液中所要蛋白的濃度顯著增加，此可在表達步驟中達成。相比之下，在相同時期，在蛋白的後續純化中所用的色譜材料的結合能力僅略微增加。為此，迫切需要生物分子、尤其是蛋白的經改良且最佳化的純化方法，所述方法可在大工業規模上進行。在生物藥物(例如用作藥物的蛋白，例如治療性抗體)的情況下，除產物產率以夕卜，分離雜質亦至關重要。方法依賴性雜質與產物依賴性雜質之間可加以區分。方法依賴性雜質含有宿主細胞的組分，例如蛋白(宿主細胞蛋白，HCP)及核酸，且源於細胞培養(例如培養基的組分)或處理(例如鹽或溶解的色譜配位體)。產物依賴性雜質為具有不同特性的產物分子變異體。這些變異體包括截短形式(例如前體及水解分解產物)，以及例如通過脫除氨基、不正確糖基化或誤連接二硫橋產生的經修飾形式。產物依賴性變異體亦包括聚合物及聚集物。其他雜質為汙染物。此術語涵蓋具有化學、生物化學或微生物學性質且不直接屬於製備方法的所有其他物質。汙染物的實施例包括可能以不需要的方式存在於細胞培養物中的病毒。在生物藥物的情況下，雜質產生安全性問題。若通過注射或輸注將治療性蛋白直接給予血流中，如生物藥物中極常發生，則這些問題加劇。因此，宿主細胞組分可能引起過敏反應或免疫病理學影響。此外，雜質亦可能導致所給予的蛋白產生不需要的免疫原性，即其可能在患者體內引發不需要的對治療劑的免疫反應，從而可能造成危及生命的過敏性休克。因此，需要適合的純化方法，藉助於所述方法可使所有非所需的物質降至無害程度。另一方面，即使在生物藥物的情況下，仍不能忽視經濟考慮因素。因此，所用製備及純化方法不應損害由此製備的生物醫藥產品的經濟生存力。作為蛋白的處理及加工步驟，(柱)色譜方法以及過濾及沉澱方法至關重要。因此，濃縮抗體的確切操作包括通過親和色譜純化的步驟。目前已知許多柱色譜方法及可用於這些方法的色譜材料。親和色譜基質在工業純化各種物質中用作固定相。經固定的配位體可用於特定濃縮及純化對於所用特定配位體具有特定親和力的物質。對於抗體(免疫球蛋白)的工業純化，尤其是單克隆抗體的純化，經固定的蛋白A常常用於初始純化步驟。蛋白A為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的約41kDa的蛋白，其以高親和力(ICT8M-ICr12M人類IgG)結合於免疫球蛋白Fe區的CH2/CH3域。在蛋白A色譜中，移動相中具有蛋白A結合Fe區的免疫球蛋白或融合蛋白特異性結合於共價偶合至載體(例如瓊脂糖(Sepharose))的蛋白A配位體。金黃色葡萄球菌的蛋白A(野生型蛋白A)及經遺傳修飾的重組蛋白A經非共價相互作用而與抗體的恆定區(Fe片段)相互作用。此特異性相互作用可用於有效分離雜質與抗體。通過改變pH,可刻意終止抗體與蛋白A配位體之間的相互作用且自固定相釋放或洗脫抗體。
除蛋白A作為親和配位體以外，目前已知許多結合於Fe片段的其他分子。因此， 使用蛋白A的個別域替代完整蛋白(8)。已知與蛋白A的B域確切不同的蛋白變異體，其適合結合含Fe片段的分子(16，17)。這些不同變異體基本上不同在於突變，所述突變已插入以提高穩定性或結合親和力。這些B域的突變體通常稱作Z域或蛋白Z。除蛋白A或蛋白G以外，多種肽亦適合選擇性結合於Fe片段(14)。現今對Fe片段的親和配位體的極大關注使得吾人推測會發現更多親和配位體。然而，親和色譜及尤其是經常使用的蛋白A色譜花費高，且確切而言，當發酵槽中產物濃度增加且有大量產物時，可進行的色譜純化方法有所限制。關鍵點為裝載量、循環數、處理時間、池體積及緩衝液的量。因此，將來需要替代性純化方法。包括親和色譜及親和色譜的替代方法的常規純化策略的一般概述可見於以下文章中(7，10)。新近親和色譜方法不使用恆定固定的親和配位體，而是始於與標靶蛋白混合的溶解親和配位體(11)。該親和配位體帶有融合標記或融合蛋白，可能使該親和配位體固定於固相上，該固定發生於第二步驟中。在下一步驟中，如在常規親和色譜中，標靶蛋白與配位體在適合條件下分離且因此自柱洗脫。在此所述的本發明使用親和沉澱替代親和色譜來純化生物分子。此方法在較大規模使用時確實顯示具有極大潛力(1，2)。親和沉澱為最有效的蛋白沉澱方法(2)。蛋白自溶液中沉澱一般為經常使用的熟知方法。因此，許多蛋白已通過蛋白混合物進行硫酸銨沉澱而自溶液中分離。在此沉澱期間，大分子(例如蛋白)自溶液移出且轉化為粒子。視粒子與溶液之間的密度差異及粒子直徑而定，此步驟導致沉澱。然而，此沉澱通常非特異地發生。因此，為更選擇性地濃縮分子(例如蛋白)，開發出親和沉澱。親和沉澱是利用親和分子與標靶分子的選擇性結合。親和分子可為例如蛋白、肽、寡核苷酸或小化學分子。親和沉澱在兩種原理之間有所區別，這兩種原理為第一級親和沉澱及第二級親和沉澱(7)。在第一級親和沉澱中，親和分子與標靶分子均具有兩個結合位點，使得兩個分子之間有可能形成網絡，且形成在特定尺寸下沉降的親和複合物。在第二級親和沉澱中，使用例如親和巨型配位體(AML)。在此類型的沉澱中，親和分子結合於可刺激性物質(通常為聚合物)。可刺激性物質因環境條件改變(例如PH值或溫度變化)而改變其溶解特徵，且發生沉澱。不同於第一級親和沉澱，不需要雙官能親和分子或雙官能標靶分子。在普遍使用的親和沉澱中，目前親和配位體偶合至聚合物或其他介質(15)。含Fe片段的分子的親和沉澱已描述於許多研究中。目前最常見應用的特徵為使用所謂的「智慧型聚合物(smart polymer)」。「智慧型聚合物」(或刺激反應性「智能」聚合物或親和巨型配位體)為可對外部影響(物理或化學刺激)作出反應而改變特性的聚合物。這些刺激可為例如PH值或溫度變化(12-13)。通常，智慧型聚合物對其刺激作出反應而在溶液中沉澱。在上清溶液進行所要分離之後，通過適合條件可使此沉澱逆轉。智慧型聚合物可與多種生物分子結合，從而使得可用於各種應用的聚合物/生物分子系統大量積聚。這些生物分子的實施例包括蛋白、寡核苷酸及糖。另一形式的親和沉澱為最近公開的「親和浸沒(affinity sinking)」方法。在此形式的親和沉澱中，使用連接分子骨架使許多親和配位體彼此結合。此繼而使得有可能形 成沉澱所需的網絡。親和配位體與網絡形成物的結合可以以非共價方式與共價方式進行。此方法最近描述於專利 「Compositions and methods for purifying and crystallizingmolecules of interest」中(6)。在此方法中，首先將含有抗體的溶液與共價結合於交聯劑的親和配位體混合。未觀察到沉澱。僅在隨後添加配位離子或分子之後，方產生沉澱。在第二種類似應用中，親和配位體連接於生物素結合蛋白，該生物素結合蛋白與介質抗生物素蛋白形成網絡(9)。美國專利7，083，943描述如下親和沉澱其中標靶蛋白的結合域連接於骨架域，該骨架域的胺基酸序列預期可有助於發生沉澱的趨勢。Chen及Hoffman (15)描述IgG與聚(N-異丙基丙烯醯胺)-蛋白A結合物的親和沉澱。然而，抗體與未經修飾的蛋白A的沉澱尚未證實有效。現有技術中所述的方法的一個缺陷為，在第一級親和沉澱期間，沉澱僅可能經由交聯分子達成；或在第二級親和沉澱中，需要可刺激性物質。最為熟知的親和沉澱的其他缺陷一方面為a)位阻，其中標靶蛋白的結合受高分子親和巨型配位體的結合的限制；b)已沉澱的聚合物複合物的再溶解較緩慢；c)雜質的非特異性共沉澱，此一般需要第二沉澱步驟；d)使親和蛋白與聚合物或與交聯劑結合的額外步驟(2-5)。

發明內容
本發明涉及利用具有兩個結合位點的結合蛋白的親和沉澱，其完全不需要額外的融合蛋白或連接分子。親和蛋白本身足以用於沉澱，且不需要固定相。在此所用的發明內容亦可較容易地回收親和蛋白。本發明尤其涉及一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fe域的其他蛋白(標靶蛋白)的方法，其包括以下步驟a.製備含有標靶蛋白的溶液；b.在允許發生結合的條件下引入確切具有兩個結合位點的Fe結合蛋白；c.自液相分離沉澱物；d.解除標靶蛋白與Fe結合蛋白的結合。在另一方面中，本發明涉及一種方法，其中Fe結合蛋白為蛋白A或蛋白G的Fe結合域的二聚體。優選地，該二聚體的兩個單體經由二硫橋彼此連接。
在另一方面中，本發明涉及一種方法，其中二聚體為均二聚體，其單體具有SEQ IDNO: I、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7 或與 SEQ ID NO: I 的不同之處在於 1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個胺基酸的序列。在另一方面中，所用Fe結合蛋白相對於標靶蛋白的比率為0. 5-20。步驟a.中溶液的PH值優選為5. 5-8。優選地，步驟d.中的結合解除在2-4. 5的pH值進行。在另一方面中，本發明涉及一種由2個相同亞單元組成的Fe結合蛋白，所述亞單元具有序列 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7 或與 SEQ ID NO: I 的不同之處在於 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個胺基酸的序列，該兩個亞單元經由共價鍵彼此連接。優選地，該共價鍵為二硫鍵。


圖I a 二聚體的SDS-PAGE。為顯示經由半胱氨酸達成的二聚，在施用於SDS-PAGE 之前添加碘乙醯胺或碘乙醯胺與二硫蘇糖醇
~與0. 6 y mo I碘乙醯胺混合的重組Z- 二聚體
—I與0. 3y mol DTT及碘乙醯胺混合的重組Z- 二聚體
~純的重組Z- 二聚體
4科姆比標記物(Kombi marker)
~與0. 2 y mol碘乙醯胺混合的重組Z- 二聚體
6與0. I y mol DTT及0. 2 y mol碘乙醯胺混合的重組Z- 二聚體
~純的重組Z- 二聚體圖2 :使用Z- 二聚體進行的親和沉澱。作為第一步驟，使蛋白Z氧化。在第二步驟中，向含有抗體(mAB)的溶液中添加Z- 二聚體，這使得抗體選擇性沉澱；圖3 :在酸性條件下分離Z 二聚體與抗體的離子交換色譜的UV圖(實驗2)。220nm下的UV色譜圖以紅色顯示，280nm下的UV色譜圖以藍色顯示，且緩衝液B (20mM磷酸鹽，3MNaCl)的遞增含量以綠色顯示；圖4 :實驗 2 的 SDS-PAGE
~經純化的抗體
~~2蛋白Z 二聚體
權利要求
1.一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fe域的其他蛋白(標靶蛋白)的方法，所述方法包括以下步驟 a.製備含有該標革巴蛋白的溶液； b.在允許發生結合的條件下引入確切具有兩個結合位點的Fe結合蛋白； c.自液相分離沉澱物； d.解除該標革巴蛋白與該Fe結合蛋白的結合。
2.權利要求I的方法，其特徵在於該Fe結合蛋白為蛋白A或蛋白G的Fe結合域的二聚體。
3.權利要求2的方法，其特徵在於該Fe結合域包含或含有序列SEQID NO: I至SEQ IDNO: 11 之一。
4.權利要求2或3的方法,其特徵在於該二聚體的兩個單體由二硫橋連接在一起。
5.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於該二聚體為均二聚體，其單體具有序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 7 或與 SEQ ID NO: I 不同之處在於 I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個胺基酸的序列。
6.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於使用該Fe結合蛋白相對於該標靶蛋白的摩爾比為0. 5-20。
7.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於步驟a.中該溶液的pH為5.5-9，優選為6-8。
8.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於步驟d.中的結合解除在2-4.5的pH發生。
9.一種Fe結合蛋白，其由2個相同亞單元組成,所述亞單元具有序列SEQ ID NO: 1>SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7 或與 SEQ ID NO: I 不同之處在於 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸的序列，其中該兩個亞單元經由共價鍵連接在一起。
10.權利要求9的Fe結合蛋白，其特徵在於該共價鍵為二硫鍵。
全文摘要
本發明涉及一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(標靶蛋白)的方法，其包括以下步驟e.製備含有標靶蛋白的溶液；f.在允許發生結合的條件下引入精確具有兩個結合位點的Fc結合蛋白；g.自液相分離沉澱物；h.解除標靶蛋白與Fc結合蛋白的結合。
文檔編號C07K14/31GK102791728SQ201180012227
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月2日 優先權日2010年3月5日
發明者D.安布羅修斯, M.迪特爾勒, M-K.霍耶, P.多伯西恩 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司