β-1,4-內切木聚糖酶催化域(AorXyn10BC)基因的克隆及表達的製作方法

2023-07-29 01:46:01 2

專利名稱：β-1,4-內切木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因的克隆及表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種新型10家族木聚糖酶催化域(Aor XynlOBC)基因完整cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶催化域基因工程菌的構建及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
在自然界中植物細胞壁是一個巨大的碳水化合物倉庫，半纖維素約佔植物乾重的 33%，是除纖維素之外最為豐富的多糖。木聚糖是半纖維素最主要的成分之一，廣泛存在於植物細胞的細胞壁和胞間層中。木聚糖結構複雜，其主鏈由以β-1，4-糖苷鍵相連的木糖殘基構成，當主鏈被取代後可形成包含阿拉伯糖、葡糖醛酸、甲基葡糖醛酸、乙醯基、阿魏醯基及P-香豆素等取代基的側鏈。木聚糖的這種複雜的結構導致其完全降解需要眾多酶的共同參與才能完成，其中能夠水解木聚糖主鏈的木聚糖酶在整個水解過程中起最重要的作用。內切 β-1，4- -木聚糖酶(3-l，4-D_endoxylanase，EC 3. 2. 1.8)是木聚糖酶的主要組分之一，它能夠從木聚糖主鏈的內部切割β _1，4糖苷鍵形成寡聚木糖和少量木糖。 木聚糖酶在自然界分布很廣，研究較多的是微生物產生的木聚糖酶，已報導能合成木聚糖酶的微生物有細菌、放線菌、真菌和酵母菌等。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析， 可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。目前木聚糖酶已在造紙、食品、能源、飼料以及環境等領域體現出了重要的應用價值，雖然每年都有數目龐大的新的木聚糖酶被發現，但實際上大多數微生物中木聚糖酶的酶學性質和產量都不能滿足工業生產的要求。而隨著基因工程的發展，運用分子生物學方法對木聚糖酶進行改造將加速木聚糖酶在各領域中的應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型10家族木聚糖酶催化域cDNA序列的克隆和分析， 木聚糖酶催化域基因工程菌的構建及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定理論基礎，也為其他木聚糖酶研究奠定基礎。根據Bernard Henrissat等提出的糖苷水解酶分類法，絕大多數木聚糖酶屬於糖苷水解酶第10和11家族。生物信息學分析表明該基因所編碼的木聚糖酶屬於A.0ryZae CICC 40186中發現的一種10家族木聚糖酶的催化域，命名為iVor XynlOBC，其相應的基因命名為iVor xynlOBC.本發明的技術方案一種來源於A. oryzae CICC 40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因(Aor xynlOBC)，其 cDNA 序列為 SEQ ID NO :1。所述的由cDNA推導的iVor XynlOBC胺基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組木聚糖酶的活性測定方法於25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩衝液配製的質量
3濃度為0.5%的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入0. ImL 適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min;立即各加入2. 5mL 3' ,5' - 二硝基水楊酸(DNS) 試劑，在B管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻後各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，並從木糖標準曲線上查出相應的還原糖 (以木糖計)含量並折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生 1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(IU)。所述的iVor xynlOBC cDNA序列的克隆和表達方法(I)Aor xynlOBC cDNA序列的克隆基於我們申請的《β _1，4-內切木聚糖酶 (Aor XynlOB)基因的克隆及序列分析》及預測的催化域，設計兩條引物XynlOBC-Fl和 XynlOBC-Rl Xyn 10BC-F1 5' -GAGCTGGTCTGCATGACGC-3『Xyn 10BC-R1 5' -CAAAACCTCCAAAATGCC-3『提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與 PUCm-T載體連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到 Aor xynlOBC cDNA 序列。(2)含編碼iVor XynlOBC成熟肽基因的表達質粒的構建基於上述得到的^Vor xynlOBCcDNA序列以及預測的催化域，設計一對引物Xynl0BC_F。和XynlOBC-R。，擴增成熟肽
基因XynlOBC-F0 5' -CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3『，含 Xho I 酶切位點XynlOBC-R0 5' -GCGGCCGCCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3『，含 Not I 酶切位點按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說明書進行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Xynl0BC_F。為引物進行第一輪PCR ；以XynlOBC-F。和XynlOBC-I 。為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉化 JM109,經酶切鑑定正確後送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-xynlOBC與一種改造的pPIC9KM質粒均用Xho I和 Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pPIC9KM-xynlOBC(圖1)，並對重組表達質粒進行序列測定。(9)GS115/xynlOBC重組子的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對 pPIC9KM-xynlOBC進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/XynlOBC;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組木聚糖酶活性；發酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。本發明的有益效果本發明提供了一種新型10家族木聚糖酶基因cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶工程菌GS115/XynlOBC的構建，以其重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，為該基因的異源高效表達和產業化生產奠定了理論基礎。經生物信息學分析表明來源於米麴黴CICC 40186的該木聚糖酶催化域屬於糖苷水解酶第10家族，命名為^Vor XynlOBC，其相應的基因命名為iVor xynlOBC。Aor XynlOBC具有較好的pH穩定性，有較大的工業化生產和應用潛力以及經濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎。


圖1 重組質粒pPIC9KM_xynlOBC的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例IAor xynlOBC cDNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4 禾口 XynlOBC-Fl 為引物進行第一輪 PCR 擴增(94°C 2min ；30 個循環，94°C 30s, 51 °C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)，以 XynlOBC-Fl 和 XynlOBC-Rl 為引物進行第二輪 PCR擴增 (940C 2min ；30 個循環，94°C 30s，51°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將 PCR 擴增產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉化JM109， 經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例2含編碼木聚糖酶催化域成熟肽基因的表達質粒的構建以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4 和 XynlOBC-Fl 為引物進行第一輪 PCR (94 "C 2min ；30 個循環，94 "C 30s,51 "C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)；以 XynlOBC-Fl 和 XynlOBC-Rl 為引物第二輪PCR(94°C 2min ；30 個循環，94°C 30s，51°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將兩輪PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T-xynlOBC與pPIC9KM質粒均用Xho I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在iMDNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9KM-XynlOBC， 並對重組表達質粒進行序列測定。實施例3 GS115/xynlOBC的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9KM-xynlOBC進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xynlOBC。該工程菌用0. 5%甲醇誘導96h，DNS法測得發酵液中重組木聚糖酶活性達20IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過濾層析純化，純化後經SDS-PAGE檢測為單一條帶，並顯示重組木聚糖酶分子量為50kDa。該重組木聚糖酶最適作用溫度60°C，在溫度50°C以下穩定；最適作用pH 5. 5，在 pH 4.0 7. 5穩定。
權利要求
1.一種源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186、歸屬於糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶催化域基因，其cDNA的核苷酸序列對應於序列表中的SEQ ID NO :1。
2.如權利要求1所述的新型木聚糖酶催化域(AorXynlOBC)，其胺基酸序列為SEQ ID NO :2。
3.A. oryzae CICC 40186 Aor xynlOBC cDNA 序列的獲取方法基於我們申請的《β-1，4-內切木聚糖酶(Aor XynlOB)基因的克隆及序列分析》及預測的催化域，設計兩條引物XynlOBC-Fl和XynlOBC-Rl XynlOBC-Fl 5' -GAGCTGGTCTGCATGACGC-3『XynlOBC-Rl 5' -CAAAACCTCCAAAATGCC-3『以 A. orvzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynlOBC-Fl為引物進行第一輪PCR(94°C 2min ； 30 個循環，94°C 30s,51°C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)；以 XynlOBC-Fl 和 XynlOBC-Rl 為弓丨物進行第二輪 PCR(94°C 2min ;30 個循環，94°C 30s，51°C 30s，72°C Imin ； 72 °C IOmin)；目的條帶經克隆、測序得到Aor xynlOBC cDNA序列。
4.A. oryzae CICC 40186木聚糖酶催化域基因工程菌的構建和表達方法(1)構建含編碼AorXynlOBC成熟肽基因的表達質粒基於上述得到的木聚糖酶催化域基因cDNA序列，設計一對引物XynlOBC-F。和XynlOBC-R。，獲得已去除信號肽基因序列的催化域成熟肽基因XynlOBC-F0 5' -CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3 『，含 Xho I 酶切位點XynlOBC-R0 5' -GCGGCCGCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3 『，含 Not I 酶切位點以合成的cDNA第一條鏈為模板，M13 Primer M4和XynlOBC-F。為引物進行第一輪 PCR(94 °C 2min ；30 個循環，94 °C 30s, 51 °C 30s, 72 °C 90s ；72 °C IOmin)；以 XynlOBC-F。 和 XynlOBC-R。為引物第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環，94 °C 30s, 51 °C 30s, 72 °C Imin ； 72°C IOmin)；將第二輪PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-xynlOBC與一種改造後的pPIC9KM質粒均用Bio I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9KM-XynlOBC，並對重組質粒進行測序鑑定；(2)GS115/xynlOBC的構建、表達、產物純化及活性測定用MlI對pPIC9KM_xynlOBC 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子 GS115/xynlOBC ；該工程菌用0. 5%甲醇誘導96h，DNS法測得發酵液中重組木聚糖酶活性達 20IU/mL ；離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化，純化後經 SDS-PAGE檢測為單一條帶，並顯示重組木聚糖酶分子量為50kDa。
全文摘要
本發明提出了一種源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因cDNA序列的克隆及分析、質粒構建及表達方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。生物信息學分析表明該木聚糖酶催化域屬於糖苷水解酶第10家族，命名為Aor Xyn10BC，其胺基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為Aor xyn10BC。這為該基因的異源表達和工業化生產奠定了理論基礎。本發明還公開了木聚糖酶工程菌的構建以及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法。作為一種新型酶製劑，該木聚糖酶具有較大的工業化生產和應用潛力及經濟價值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了理論基礎。
文檔編號C12N15/56GK102492707SQ20111041039
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者劉曉彤, 李劍芳, 殷欣, 羅秋玲, 鄔敏辰 申請人:江南大學